一、B7-1基因转染小鼠EL-4淋巴瘤细胞体外诱导免疫小鼠脾细胞产生的白细胞介素-2（论文文献综述）
韩超[1]（2021）在《Th17细胞中SOX-5介导RORγt基因新的增强子RORCE2与启动子相互作用的机制研究》文中认为Th17细胞是一种CD4+辅助性T细胞（CD4+Th）的亚群,表达细胞因子IL-17A,以及IL-17F、IL-26、IL-22、IL-21和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等,这些细胞因子尤其是IL-17A是Th17细胞发挥各种生物学功能的基础。Th17细胞在多种炎症相关的疾病中发挥着非常重要的作用,例如多发性硬化（multiple sclerosis,MS）、实验性自身免疫性脑炎（Experimental autoimmune encephalitis,EAE）、类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）、肝炎（Hepatitis）、以及结肠炎（colitis）等等。因此,深入研究Th17细胞的内在分子机制对于多种炎症相关疾病的发病原理和相关防治措施的建立都具有非常重大的意义。维甲酸受体相关孤儿受体（Retinoic acid receptor-related orphan receptor-γ,RORγ,又称为RORC）基因可以编码两种不同的异构体,RORγ1和RORγ2（也称为RORγt）。目前众多的研究表明,在CD4+Th免疫细胞亚群中,RORγt仅表达于Th17细胞中,是Th17细胞特异性的关键转录因子（transcription factor,TF）。在体外实验中证实,敲除RORγt基因的CD4+T细胞中的IL-17A的表达量会迅速下降;而通过基因转染的方式过表达RORγt可恢复表达IL-17A。缺失RORγt基因小鼠的Th17细胞会发生缺陷,在构建的EAE疾病模型中,RORγt基因缺失小鼠更难发病,发病时间会延迟,疾病程度会减轻。由此可见,RORγt是Th17细胞分化、发育和发挥功能的关键转录因子。RORγt可以控制许多调控Th17细胞分化的关键基因,因此,对于RORγt基因自身转录调控机制的研究就显得尤为重要。近年来的研究已经明确RORγt基因的启动子是位于转录起始位点（transcriptional start site,TSS）-400～+151 bp的区域,但是关于RORγt基因增强子却报道不多。本课题围绕RORγt基因增强子的发现和鉴定,以及其具体的作用机制进行了深入的研究,并得到了以下三方面的结论:1.增强子RORCE2通过增强RORγt的表达促进Th17细胞的分化。我们首先利用表观遗传学方法通过对增强子相关的组蛋白修饰H3K4me2的Ch IP-seq数据进行分析,发现在小鼠RORC基因上游存在一段Th17细胞特异的1.5kb左右的候选增强子序列RORCE2;并在人的Th17细胞中RORC基因相同的位点发现了还高度表达与增强子活化相关的H3K4me1和H3K27ac表观修饰标志;体外双荧光素酶实验证实了RORCE2对RORγt启动子活性有显着地增强作用;在小鼠体内分选的Th17细胞中,利用染色质免疫共沉淀（Chromatin Immnoprecipitation,Ch IP）-q PCR进一步证实该序列还发生了与增强子活化密切相关的其他组蛋白修饰,例如H3K4me1、H3K27ac和H3ac;基于CRISPR/Cas9技术制备RORCE2敲除的小鼠,利用RT-q PCR和流式细胞技术（Flow cytometry,FCM）证实RORCE2的缺失严重影响RORγt和IL-17A的表达;在体外诱导分化模型中,通过FCM进一步发现RORCE2的缺失影响Th17细胞的分化;利用RORCE-/-和WT小鼠建立EAE疾病模型发现RORCE2的缺失显着降低了EAE疾病的严重程度。这些结果都提示了Th17细胞中RORCE2是RORγt基因的潜在增强子·,可以通过增强RORγt的表达促进Th17细胞的分化。2.SOX-5介导增强子RORCE2与RORγt基因启动子相互作用对Th17细胞的分化至关重要。增强子对于目的基因的调节依赖于染色质环（loop）的形成,其具体机制是:首先是谱系特异性转录因子与增强子结合并开放该染色质区域,然后招募其他的转录因子协同活化该增强子区域,使其发生特定的组蛋白修饰并最终被彻底激活,进而与同源基因的启动子相互作用发挥增强子的功能。为了进一步探究Th17细胞中增强子RORCE2是如何发挥作用的?我们做了如下实验:（1）首先我们发现在RORCE序列中存在8个限制性内切酶Nla III的酶切位点（TS1-8）;（2）通过染色体构象捕获技术结合定量PCR的方法（Chromatin conformation capture-q PCR,3C-q PCR）证实,无论是表达RORγt的小鼠淋巴细胞株EL4,还是FACS分选的Th17细胞,或者是体外诱导分化的Th17中,3号检测位点（TS3）相比于其他位点而言,可以与RORγt启动子存在很强的相互作用;（3）通过对增强子上转录因子结合位点的生物信息学分析以及文献提示,我们推测转录因子SOX-5可能是与增强子RORCE2相互结合进而参与loop形成调节RORγt基因表达的关键转录因子,其结合位点（SOX-5-Binding site,SOX-5-BS）位于TS3上游约50 bp;（4）通过Ch IP-q PCR证实SOX-5确实结合在SOX-5-BS与以及RORγt启动子区域;（5）通过3C-q PCR结合Ch IP的实验方法（Ch IP-loop）证实,无论是EL4还是体外分化的Th17细胞中,SOX-5都介导了TS3和RORγt启动子之间的相互作用;（6）为了进一步了解其中的机制,基于CRISPR/Cas9技术构建了RORCE上转录因子SOX-5结合位点缺失的小鼠(SOX-5-BS-deficient,SOX-5-BS-/-),结果发现SOX-5-BS的缺失导致SOX-5在SOX-5-BS上的结合显着降低,并严重破坏了TS3和RORγt启动子之间的相互作用;（7）小鼠体内实验也表明:SOX-5结合位点的缺失显着影响了RORγt和IL-17的表达,并通过影响Th17细胞的分化显着降低了EAE疾病的严重程度。这些结果都提示了Th17细胞中转录因子SOX-5介导增强子RORCE2与RORγt基因启动子相互作用对Th17细胞的分化至关重要。3.Th17细胞中SOX-5与STAT3协同诱导RORCE2的染色质开放。SOX家族转录因子通过与DNA结合可以引起染色质开放从而进行基因的转录调控,但是有研究表明,SOX家族的转录因子结合DNA后,并不能独自的招募染色质重塑复合物导致染色质结构的改变,必须依赖于结合在邻近位置上的伙伴转录因子（Partner TF）协同合作才能招募重塑复合物引起染色质的开放。基于此,我们首先利用WT和SOX-5-BS-/-小鼠,通过Ch IP-q PCR和染色质可接近性检测实验发现,SOX-5-BS缺失后,增强子RORCE2区域染色质开放程度严重下降;通过生物信息学分析发现在SOX-5-BS下游存在转录因子STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）的结合位点（STAT3 binding site,STAT3-BS）,多篇研究证实STAT3在Th17细胞的分化中至关重要,这就提示Th17细胞中我们STAT3是潜在的SOX-5的Partner TF;进一步的实验结果显示STAT3可以结合在RORCE2上,而且当SOX-5与RORCE2结合缺失后,STAT3与RORCE2的结合也几乎消失;双荧光素酶报告实验结果表明STAT3-BS的缺失严重影响了RORCE2对RORγt启动子活性的增强作用;Co-IP的结果也证实STAT3与SOX-5之间存在蛋白-蛋白之间的相互作用;此外,我们在Th17细胞中敲低（Knock down,KD）STAT3表达后发现,增强子RORCE2区域的染色质开放程度明显降低。这些结果提示我们Th17细胞中SOX-5与STAT3协同诱导RORγt基因增强子RORCE2染色质开放。综上所述,我们证实了在Th17细胞中RORCE2是RORγt基因新的增强子,它可以在转录水平上增强RORγt基因的表达从而促进Th17的分化,转录因子SOX-5与STAT3协同诱导了增强子RORCE2染色质的开放,并介导了其与RORγt基因启动子的相互作用。这项开创性的研究证实了顺式作用元件在疾病发病机制中的重要意义,该研究不仅进一步丰富了Th17细胞分化的机制,同时也为Th17细胞相关疾病的干预治疗提供潜在线索。
李保华[2]（2021）在《长链非编码RNA Snhg1在记忆CD8+T细胞分化中的作用及机制研究》文中提出研究背景:传染性疾病始终是人类健康的重大威胁。近年来,除了传统的传染性疾病,例如病毒性肝炎、肺结核、艾滋病等继续肆虐以外,一些新发传染病诸如非典型肺炎、中东呼吸综合征以及正在全球流行的新型冠状病毒肺炎等也相继出现,严重威胁着全人类的健康。预防和控制传染病最有效的措施之一便是接种疫苗。但目前许多传染病包括艾滋病、结核病和新冠肺炎等仍缺乏有持久保护力的疫苗,针对传染病的疫苗研发工作仍任重道远。疫苗发挥保护性作用的原理是诱导机体产生免疫记忆。免疫记忆是指机体在接触某一外源性抗原后会记住该抗原,当再次遭遇同一抗原时会产生更快、更强的免疫应答。免疫记忆的另一个重要特征是它可在体内维持很长时间,故而能提供长期、有效的保护。产生免疫记忆的基础是形成记忆细胞,如何产生更多的记忆细胞并长期维持是疫苗研发的核心科学问题。CD8+T细胞是机体控制病毒和胞内病原体感染最重要的细胞亚群。在急性病毒感染时,初始CD8+T细胞（naive CD8+T cells）在接触抗原后被激活并迅速增殖,产生大量的效应CD8+T细胞（effector CD8+T cells）。效应CD8+T细胞具有细胞毒作用,可通过分泌穿孔素（perforin）直接溶解受感染的细胞,或通过颗粒酶（granzyme）、FAS-FASL途径等介导靶细胞凋亡,从而有效杀伤受感染的细胞和清除病毒。当病原体被完全清除后,大部分效应T细胞会逐渐凋亡,但约有5-10%的细胞可继续存活,最终形成记忆CD8+T细胞（memory CD8+T cells）。记忆CD8+T细胞可在体内长期存留,并当再次遭受同一病原体感染时能产生更快速、更强烈的免疫应答,对于机体的长期保护十分重要。记忆CD8+T细胞的分化和命运受很多因素调控,目前发现T细胞受体（T cell receptor,TCR）信号强弱、细胞表面分子标记表达情况、细胞内转录因子表达情况、表观遗传、细胞代谢状态以及微环境中细胞因子情况等许多因素都能影响记忆CD8+T细胞命运。但目前关于记忆CD8+T细胞分化和命运调控的研究主要集中于转录水平,而关于长非编码RNA在这一过程中的作用尚未明确。长链非编码RNA（Lnc RNAs）最初被认为是基因转录时产生的“噪音”而被人们忽视。然而,随着近年来高通量测序技术的发展,人们越来越认识到lnc RNA对基因表达调控的重要性。研究表明,lnc RNAs能够广泛地参与造血、神经系统发育、肿瘤、感染等各个生理或病理过程。在免疫系统中,lnc RNAs也被报道能够影响树突状细胞（dendritic cell,DC）、中性粒细胞（neutrophil）、巨噬细胞（macrophage）等多种免疫细胞的发育与功能。但目前关于lnc RNAs在CD8+T细胞中作用,特别是在急性病毒感染时CD8+T细胞免疫记忆形成与功能中的作用尚不清楚。结合国内外记忆CD8+T细胞及lnc RNAs的研究进展,我们推测lnc RNAs在记忆CD8+T细胞形成与功能中可能发挥重要作用。研究方法和结果:1.为探究lnc RNAs在记忆CD8+T细胞形成与功能中的作用及寻找在这一过程中可能起关键作用的lnc RNA,我们首先利用淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）Armstrong毒株建立急性病毒感染小鼠模型,随后通过RNA-seq高通量测序,获得了初始、效应和记忆CD8+T细胞中lnc RNA的表达谱。进一步,通过生物信息学分析和RT-q PCR验证等,我们鉴定得到可能影响记忆CD8+T细胞分化的lnc RNA Snhg1。接下来,我们利用短发夹RNA（short hairpin RNA,sh RNA）敲减Snhg1在CD8+T细胞中的表达,发现Snhg1敲减后记忆前体（memory precursor,MP）细胞和中央型记忆T细胞(central memory T cell,TCM)的形成明显减少。2.Lcn RNAs通常需要与蛋白质相互作用才能发挥其生物学功能。为探寻与Snhg1相互作用的靶标蛋白,我们进行了RNA pull down、质谱分析和RIP等实验,鉴定得到与Snhg1相互作用的囊泡运输蛋白Vps13D。进一步,通过使用sh RNA技术敲减Vps13D在CD8+T细胞中的表达,我们发现Vps13D敲减后MP细胞及TCM细胞的形成也同样减少,表明Snhg1通过与Vps13D相互作用调控记忆CD8+T细胞的分化。3.为探寻Snhg1-Vps13D调控记忆CD8+T细胞分化的机制,我们首先进行RNA-seq测序并分析Snhg1和Vps13D敲减后基因表达谱的变化,发现Snhg1和Vps13D调控的基因主要与膜受体免疫过程有关。随后,通过流式细胞术检测,我们发现Snhg1或Vps13D敲减后膜IL-7Rα（CD127）的表达丰度明显下调。进一步,通过免疫荧光染色、免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）和质谱分析等实验,我们发现Snhg1/Vps13D敲减后膜IL-7Rα表达丰度的下调是由于Snhg1/Vps13D影响了IL-7Rα从ER-Golgi向细胞膜的转运。最后,通过染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,Ch IP）、流式细胞染色及TCF-1过表达实验等实验,我们证明Snhg1-Vps13D通过IL-7-IL-7R-STAT3-TCF-1轴来调控记忆CD8+T细胞的分化。结论:1.在急性病毒感染时,lnc RNA Snhg1促进病毒特异性记忆CD8+T细胞的分化;2.Snhg1通过与囊泡运输蛋白Vps13D相互作用来调控记忆CD8+T细胞的分化;3.Snhg1-Vps13D通过IL-7-IL-7R-STAT3-TCF-1轴来调控记忆CD8+T细胞的分化。
谢梦晓[3]（2016）在《IL-6和TNF-α经NF-κB-miR-34a/miR-31-Foxp3信号轴导致Treg/Th17细胞失衡》文中进行了进一步梳理目的:在本实验室前期生物信息学和实验研究的基础上,本研究通过在体外诱导分泌白细胞介素17的辅助性T（Interlukin-17 producing helper T,Th17）细胞和调节性T（regulatory T,Treg）细胞,探讨肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）及白细胞介素6（Interlukin-6,IL-6）等通过调控miR-34a和miR-31的表达,继而miRNAs引起Treg细胞中叉头/翼状螺旋转录因子3（Forkhead/winged helix transcription factor 3,Foxp3）的表达水平的变化,使得表达Foxp3的Treg细胞与表达维甲酸相关核孤儿受体γt（RAR-related orphan receptor gamma,RORγt）的Th17细胞间的比例失衡,进一步导致以异常炎症反应为特征的自身免疫性疾病的发生。部分阐明在炎症因子的作用下miRNAs导致Treg/Th17细胞失衡的机制有助于更深入地揭示一些自身免疫性疾病的发病机制,为自身免疫性疾病的治疗提供理论依据。方法:在以往生物信息学预测的基础上,首先验证miR-34a、miR-31与Foxp3表达的相互关系。利用DNA重组技术构建表达小鼠miR-31的慢病毒质粒和逆转录病毒质粒（p LV-miR-31及MGP-31）,将pLV-miR-31,MGP-31及本实验室前期构建的pSMPUW-miR-34a与表达小鼠Foxp3基因的pCDNA-m Foxp3-3’-UTR（PFU）真核重组质粒共转染至人胚肾293T（HEK-293T）细胞,通过实时定量PCR技术（Quantitative real-time PCR,qPCR）检测Foxp3转录水平的变化,免疫印迹技术（Immunoblot）检测Foxp3翻译水平的变化。此外,采用转化生长因子β（Transforming growth factor-beta,TGF-β）分别与小鼠外周CD4+T细胞和小鼠T淋巴瘤细胞系EL4细胞共培养体外诱导Treg细胞和Foxp3+EL4细胞,分别检测miR-34a及miR-31与Foxp3表达水平的相关性。接下来,为进一步验证炎症因子是否参与调控miR-34a和miR-31,采用免疫磁珠纯化CD4+CD62L+的初始T细胞（Na?ve T cells）经抗小鼠-CD3及抗小鼠-CD28单克隆抗体（antimouse CD3/CD28 mAb）活化,加入炎症细胞因子组合体外诱导Th17细胞,胞内染色鉴定CD4+IL-17+Th17细胞的百分比以评估Th17细胞的纯度,并采用qpcr测定mir-34a及mir-31的表达水平。同时,利用il-6及tnf-α这两类th17细胞相关的炎症细胞因子分别刺激小鼠cd4+t和el4细胞,利用qpcr检测炎症因子作用下mir-34a及mir-31的表达水平,并通过immunoblot检测nf-κb磷酸化的水平及foxp3的蛋白表达水平。最后,在il-6和tnf-α等炎症因子模拟的微环境中以及核转录因子κb（nucleartranscriptionfactor-kappab,nf-κb）信号活化和抑制的调节下,利用qpcr检测mir-34a及mir-31的表达水平,并通过流式细胞术（flowcytometry,fcm）及immunoblot技术检测foxp3的蛋白水平以分析其信号转导通路。结果:dna测序结果表明,所构建慢病毒重组质粒plv-mir-31及逆转录病毒重组质粒mgp-31中mir-31的前体序列正确;qpcr及immunoblot结果表明mir-34a不抑制foxp3的mrna水平,但可抑制foxp3的蛋白表达水平,而mir-31既可抑制foxp3的mrna水平也可抑制foxp3的蛋白水平。在tgf-β诱导的itreg与foxp3+el4细胞中,mir-34a及mir-31表达水平下调同时foxp3表达上调,表明mir-34a及mir-31与foxp3的表达水平呈负相关。采用白细胞介素1β（interlukin-1beta,il-1β）、il-6、白细胞介素-23（interlukin-23,il-23）、tgf-β、γ-干扰素中和抗体（interferon-gammaneutralizingantibody,anti-ifn-γ）和白细胞介素-4中和抗体（interlukin-4neutralizingantibody,anti-il-4）等炎症因子在体外与初始t细胞共培养诱导高纯度的th17细胞中,mir-34a及mir-31在th17细胞中表达水平显着升高,提示某些炎症细胞因子参与调节mir-34a及mir-31的转录活性。单独采用il-6或tnf-α与小鼠cd4+t细胞或el4细胞共育时,il-6和tnf-α均可上调mir-34a及mir-31的表达,同时上调nf-κb磷酸化水平并抑制foxp3的翻译。el4细胞加入nf-κb抑制剂（bay11-7082）可下调mir-34a及mir-31,并逆转了nf-κb对foxp3的翻译水平抑制的效应。结论:炎症微环境中的细胞因子如il-6及tnf-α通过激活nf-κb信号通路,促进mir-34a及mir-31的转录,上调的mir-34a及mir-31通过抑制foxp3的转录和（或）蛋白水平,构成了il-6/tnf-α-nf-κb-mir-34a/mir-31信号轴,从而导致foxp3+treg/rorγt+th17细胞比例失衡,进一步促进了自身免疫性疾病的发生发展。
宋少华[4]（2010）在《SOCS1基因修饰的骨髓树突状细胞对同种移植排斥的治疗作用及其机理》文中进行了进一步梳理目前,器官移植已经成为治疗各种脏器终末期疾病的唯一、有效治疗手段。许多患者通过移植同种异体器官获得新生。然而,外来器官进入机体后不可避免地会激发受者的免疫系统,产生针对移植器官的免疫应答以及排斥反应。多种新型免疫抑制剂的临床应用,虽然降低了移植排斥反应的发生率,但仍然存在两大问题：其一,免疫抑制剂并不能完全抑制排斥反应的发生；其二,长期应用免疫抑制剂存在诸多不良反应,包括药物的毒性、过度抑制机体免疫力造成的感染及新生肿瘤等。因此,抑制同种移植排斥反应并诱导机体对供者抗原的特异性免疫耐受,使机体保持正常的免疫力以抵抗微生物等病原体感染及肿瘤的发生,是解决器官移植排斥反应的最佳途径,也是移植领域研究的热点之一树突状细胞（dendritic cells, DC）是一类功能强大,并且是唯一能够激活初始T细胞的抗原提呈细胞,在识别和提呈抗原、启动免疫应答、诱导移植排斥反应中起着重要的作用。然而,近年来的研究表明DC是一类异质性细胞群体,具有不同的亚群和不同的功能状态,不但在增强免疫反应上具有重要的作用,也具有抑制排斥反应、诱导特异性免疫耐受的潜力。有研究表明,未成熟DC缺乏共刺激分子CD80（B7-1）和CD86（B7-2）的表达,体外能够诱导同种抗原特异性的T细胞失能。然而,体内未成熟DC存在着自然发育成熟的内在机制,同时,器官移植术后受者体内产生的多种介质,如致炎性细胞因子、LPS等,均能促进DC分化成熟,使之拥有强大的免疫原性。因此,某些体外调控手段,如免疫抑制分子1,25-二羟维生素D共培养或白细胞介素10（interleukin-10, IL-10）、转化生长因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）等基因修饰,可以使DC维持于稳定的不成熟状态,增强其耐受原性,是减轻移植排斥反应、诱导特异性免疫耐受的重要途径并具有潜在的临床应用价值。细胞因子信号抑制因子1（suppressor of cytokine signalingl, SOCS1）作为负性调节细胞因子Janus激酶-信号传导和转录活化因子（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription, JAK-STAT）信号途径的蛋白而被发现,可以抑制γ干扰素（interferon-γ, IFN-γ）、IL-6、生长激素（growth hormone, GH）等细胞内信号传导。新的研究显示SOCS1对DC的成熟和功能具有重要的调控作用,源于SOCS1-/-小鼠的脾脏DC与正常DC相比,表达高水平共刺激分子,对IL-4、IFN-γ刺激呈明显高反应,刺激B细胞的增殖作用更加强烈。负载抗原的SOCS1-/-DC和正常DC分别注射到同一只小鼠不同足垫,前者能够激发小鼠足垫区域引流淋巴结更加强烈的Thl型反应,该淋巴结分离的T细胞能够产生更高水平的IFN-γ。SOCS1基因沉默的DC负载卵白蛋白（ovalbumin, OVA）后,体内、外均能更有效地刺激OVA特异性T细胞的增殖反应及细胞毒性作用。SOCS1基因沉默DC以及SOCS1-/-DC具有更强的免疫刺激功能以及打破自身耐受的能力。鉴于SOCS1基因对DC发育及免疫功能的重要调控作用,我们设想采用基因转染技术体外增加未成熟DC内SOCS1基因的表达将会减缓或阻止DC的成熟过程,体内回输有利于减轻排斥反应,并可能诱导稳定、有效的供者特异性免疫耐受。本文通过体外培养、扩增并富集小鼠骨髓来源的DC,并借助复制缺陷型腺病毒载体将SOCS1基因转入DC,研究SOCS1基因修饰的未成熟DC的表型及功能的变化以及体外诱导同种抗原特异性T细胞低反应性的作用和效果；通过建立小鼠同种异体异位心脏移植模型,观察SOCS1基因修饰的未成熟DC体内减轻排斥反应、诱导心脏移植免疫耐受的效果,并探讨了可能的机制。第一部分小鼠骨髓树突状细胞体外培养及SOCS1基因转染DC起源于骨髓,在体内分布广泛,但含量极少,不足外周血单核细胞的1%。体外培养DC可以为基础科研和临床治疗提供丰富的DC来源。我们采用重组小鼠粒巨噬细胞集落刺激因子（recombinant mouse granulocyte-macrophage cell clone stimulate factor, rmGM-CSF）和rmIL-4共同刺激新鲜分离的小鼠骨髓细胞,培养小鼠骨髓来源DC,并根据小鼠骨髓来源DC高表达相对特异性表面分子CD11c,采用针对CD11c免疫磁珠分离法进一步富集DC。结果显示,刚制备的骨髓细胞极少有成簇或有树枝状突起的细胞,培养3天后有的散在克隆形成,带树枝状突起的细胞逐渐增多,培养5天后克隆较多,细胞的突起逐渐明显,成典型的未成熟DC表现。经免疫磁珠分离富集后,可以得到足够数量的DC,其纯度可以高达93%以上。腺病毒载体具有基因组结构简单、病毒滴度高、感染效率高、宿主细胞范围广、无插入突变等优势,因此我们构建了编码SOCS1基因的复制缺陷型腺病毒载体（Ad-SOCS1）, PCR、特异性酶切、测序鉴定以及Western Blotting等方法的检测结果已经证实,Ad-SOCS1载体构建成功,可以表达SOCS1蛋白。经过病毒扩增和滴度的检测,可以获得较高滴度的Ad-SOCS1载体。收获富集后的DC,按复合感染指数（MOI）1：100加入Ad-SOCS1或Ad-GFP病毒,未经病毒转染的未成熟DC作为对照。将上述三种细胞分别称为DC-SOCS1、DC-GFP、imDC（未成熟DC）。流式细胞仪分析DC-GFP组对照病毒载体转染效率；荧光实时定量PCR及Western Blotting检测各组DC内SOCS1基因的mRNA和蛋白表达。结果显示对照病毒载体Ad-GFP的转染效率可以达到70%以上；与imDC组及DC-GFP组相比,DC-SOCS1组SOCS1mRNA和蛋白表达水平明显升高（p<0.01）。上述结果表明我们构建的Ad-SOCS1载体能够有效转染DC,并明显上调DC内SOCS1基因的表达。第二部分SOCS1基因修饰的树突状细胞的表型特征及体外免疫学功能分析本部分实验,我们利用Ad-SOCS1腺病毒载体转染富集后的骨髓来源DC,观察了SOCS1基因修饰的DC的表型特征,并进一步研究其体外免疫学功能。采用rmGM-CSF及rmIL-4体外培养法扩增C57BL/6小鼠骨髓来源的DC,于培养第5天采用免疫磁珠分离法富集DC。通过Ad-SOCS1腺病毒载体将SOCS1基因转染DC,同时设Ad-GFP转染的DC及同期培养的未成熟DC作为对照组。分析脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激前、后DC的表型、细胞因子分泌、抗原吞噬以及抗原提呈能力的变化；SOCS1基因修饰的DC与同种BALB/c小鼠的CD4+T细胞混合淋巴反应（mixed lymphocyte reaction, MLR）后,检测同种CD4+T细胞的增殖能力,培养上清中Thl或Th2来源的细胞因子水平以及IL-10分泌性T细胞的产生；同时观察SOCS1基因修饰的DC在二次同种MLR中,对诱导抗原特异性T细胞低反应性的影响。分析各组DC表型发现,DC-SOCS1与imDC在LPS刺激前,CD40、CD8o及MHC分子的表达无明显的差异,但SOCS1基因修饰可明显抑制LPS刺激对DC的表面上述分子表达的上调作用；检测细胞培养液上清内细胞因子水平发现,LPS刺激前各组DC分泌的IL-12无明显差异（p>0.05）,但LPS刺激后DC-SOCS1分泌IL-12较imDC及DC-GFP明显降低（p<0.01）,而DC-SOCS1分泌IL-10水平在LPS刺激前或后均较imDC或DC-GFP明显升高（p<0.01）。上述结果表明通过基因转染技术增加未成熟DC内SOCS1表达,可阻断外源性LPS对DC的成熟刺激作用,使之维持在稳定的未成熟状态。通过FITC-Dextran吞噬实验检测各组DC的抗原吞噬功能,发现LPS刺激前各组DC均具有较强的吞噬能力,LPS刺激后,imDC及DC-GFP的吞噬能力明显降低,DC-SOCS1的吞噬能力仅有轻度下降；进一步检测各组DC的抗原提呈功能,发现DC-SOCS1抗原提呈能力明显低于imDC和DC-GFP组（p<0.01）。上述结果表明SOCS1基因修饰可以使DC维持较强的抗原吞噬能力并抑制DC抗原提呈功能。通过MLR分析各组DC的免疫刺激活性,发现SOCS1基因修饰的DC刺激同种CD4+T细胞增殖的能力明显减弱（p<0.01）；检测同种MLR反应体系上清中细胞因子水平,发现DC-SOCS1组Thl型的细胞因子IFN-γ水平明显降低（p<0.01）,Th2亚群的细胞因子IL-10水平明显升高（p<0.01）;进一步行细胞内细胞因子染色,结果表明DC-SOCS1刺激的同种CD4+T细胞,细胞内IL-10表达水平明显升高。上述结果表明,SOCS1基因修饰的DC,免疫刺激功能明显降低,可抑制Thl亚群的分化,促进免疫反应向Th2偏移,并促进IL-10分泌性T细胞的产生,能够诱导同种T细胞低反应。进一步研究SOCS1基因修饰的DC体外诱导同种抗原特异性T细胞低反应性。在初次MLR中接受C57BL/6来源的DC-SOCS1刺激的BALB/c脾脏CD4+T细胞,在二次MLR中再次接触同种抗原时,表现出明显较低的反应性（p<0.01）;在接触无关第三者抗原时,仍然具有与其他组类似的刺激活性（p>0.05）,表明SOCS1基因修饰的DC诱导的T细胞低反应性具有同种抗原特异性。上述结果提示SOCS1基因修饰的DC免疫后有可能减轻移植排斥反应并诱导受者对同种移植器官的免疫耐受。第三部分SOCS1基因修饰的树突状细胞治疗同种移植排斥的效果和免疫学机制为进一步观察SOCS1基因修饰的DC体内环境下是否具有减轻移植排斥反应并诱导免疫耐受的作用,我们将C57BL/6小鼠来源的imDC、DC-GFP以及DC-SOCS1免疫BLALB/c小鼠后,采用同种小鼠颈部异位心脏移植模型,研究SOCS1基因修饰的DC体内治疗同种排斥反应、诱导免疫耐受的效果,并分析了可能的机制。将体重在20-22克、周龄相同的BALB/c小鼠,随机分成四组,每组8只,作为受者。在心脏移植术前第7天,3组BALB/c受者小鼠分别经静脉注入2×106个C57BL/6供者来源的imDC、DC-GFP或DC-SOCS1,并设经尾静脉注入等量PBS的BALB/c受者小鼠为PBS对照。四组受体小鼠分别于同一条件下接受C57BL/6供者心脏的颈部异位移植。另设姊妹组,在心脏移植后第7天及第15天处死受者小鼠,进行病理学及相关免疫指标分析。结果发现,imDC和DC-GFP组的心脏移植物存活期分别为10.9±1.4天和9.5±1.1天,较PBS组同种异体心脏移植物存活期7.1±0.9天均有所延长（P<0.01）;DC-SOCS1免疫组的移植心脏存活期为25.5±6.9天,较imDC和DC-GFP组明显延长（P<0.01）。结果表明采用未成熟DC或对照基因修饰的DC免疫受体小鼠均可延长同种移植物存活期,但效果有限；采用SOCS1基因修饰的DC免疫受体小鼠,可以明显减轻移植排斥反应,在一定程度上诱导同种异体心脏移植物的免疫耐受,显着延长移植物的存活期（P<0.01）。组织学检查发现,PBS对照组移植心脏明显充血、肿胀,光镜下见心肌细胞明显变性、坏死,纤维断裂、间质水肿,肌束间及血管周围大量的炎性细胞浸润；imDC和DC-GFP组移植心脏仍有较明显的肿胀,光镜下见上述病变较PBS对照组有所减轻；DC-SOCS1组表现为心肌细胞无明显变性、水肿,血管周围仅有少量的淋巴细胞浸润。分析体内免疫学机制发现,imDC和DC-GFP免疫组受者小鼠的脾脏淋巴细胞对供者抗原刺激反应无明显区别（P>0.05）,均较PBS同种移植组降低（P<0.01）;而DC-SOCS1组与imDC和DC-GFP两组相比,脾脏淋巴细胞对供者抗原的刺激反应明显降低（P<0.01）。同时,DC-SOCS1免疫组受者小鼠的脾脏效应细胞在CTL反应中对靶细胞的杀伤活性明显减弱（P<0.01）。上述结果表明SOCS1基因修饰的DC免疫受体小鼠,其脾脏淋巴细胞对同种抗原的刺激呈低反应性,同时对同种抗原的杀伤活性亦明显降低。进一步分析各组受者小鼠脾脏及颈部淋巴结内CD4+CD25+Treg的产生,发现与PBS对照组相比,imDC和DC-GFP组受体脾脏及颈部淋巴结内CD4+CD25+Treg比例轻度增加（P<0.05）; DC-SoCS1组与imDC和DC-GFP组相比,受体脾脏及颈部淋巴结内CD4+CD25+Treg比例明显增加（P<0.01）。荧光实时定量PCR检测的结果显示,DC-SOCS1组受体脾脏及颈部淋巴结内CD4+T细胞内转录因子Foxp3的表达水平明显升高（P<0.01）。结果表明SOCS1基因修饰的DC免疫受体小鼠,可明显诱导体内CD4+CD25+Treg的产生并促进CD4+T细胞内Foxp3的表达。结论：重组复制缺欠型腺病毒载体介导的SOCS1基因转染可以明显增加DC内SOCS1表达,且病毒载体本身在转染过程中对DC的影响较小。即使存在外源性刺激物时,SOCS1基因修饰的未成熟DC仍然能够稳定于未成熟状态,表达低水平的MHC分子和共刺激分子,分泌高水平的免疫抑制性细胞因子IL-10,拥有较强抗原吞噬功能,较弱的抗原刺激能力,体外能够诱导同种T细胞抗原特异性低反应性。体内免疫SOCS1基因修饰的未成熟DC,能够抑制同种排斥反应,延长同种移植物存活期,抑制受体淋巴细胞的抗原反应性及CTL杀伤活性,诱导CD4+CD25+Treg的产生并促进Foxp3的表达,在一定程度上诱导受者形成免疫耐受。因此,进一步研究基于SOCS1基因修饰的DC的免疫治疗策略对于诱导移植免疫耐受有重要意义,具有潜在的临床应用价值
董博翰[5]（2009）在《肿瘤细胞裂解物—结核分枝杆菌热休克蛋白65的抗肺癌作用》文中进行了进一步梳理肿瘤细胞裂解物（TCL）是利用一定物理或者化学的方法将肿瘤细胞裂解,使细胞内的抗原物质释放到外周而形成的抗原肽混合物。理论上TCL中含有肿瘤细胞内的全部肿瘤抗原,因此除可以作为抗肿瘤疫苗应用于抗肿瘤治疗外,还能有效的解决目前的抗肿瘤疫苗抗原性比较单一的问题。但是,以外源性的方式免疫肿瘤抗原存在不能很好激活细胞免疫反应的问题,而解决这一问题的关键是如何使抗原物质更好的活化特异性CTL。要作到这一点,首先应该想办法使外源性应用的抗原被APC以MHC I途径递呈。目前的研究已经发现一些免疫细胞,如树突状细胞（DC）等,可以利用交叉递呈的机制将外源性抗原以MHC I类途径进行递呈,从而有效的诱生抗原特异性CTL。而这一过程的发生通常需要一些免疫佐剂物质的辅助。大量的实验事实已经证明热休克蛋白（HSP）就是这样一种可以辅助交叉递呈发生的物质,因此利用它和肿瘤抗原共同诱导抗肿瘤免疫应该是可行的肿瘤治疗策略。在本研究中,我们直接在体外将MHSP65和Lewis肺癌TCL混合制备出MHSP65-TCL抗肿瘤疫苗并探索了其对Lewis肺癌的治疗效果。结果发现,MHSP65-TCL可以在C57BL/6小鼠体内产生明显的抑制Lewis肺癌细胞生长的作用,并显着延长小鼠的生存期（P<0.05）。我们接下来的研究表明,这种抗肺癌的效果是由TCL特异性的CTL细胞所介导的,小鼠体内活化的CTL细胞可以在体外明显的杀伤Lewis肺癌细胞（P<0.05）。此外,我们还发现非特异性免疫在抗肿瘤过程中也发挥了重要的作用。MHSP65-TCL正是通过激活特异性免疫和非特异性免疫这两条途径来发挥抗肺癌作用的。因此,这种新型的抗肿瘤疫苗将很有希望应用于肺癌的免疫治疗。
高丰光[6]（2008）在《尼古丁刺激DCs抗肿瘤机制及肿瘤微环境DCs失能研究》文中提出树突状细胞（dendritic cells, DCs）是机体最为重要的抗原递呈细胞,其介导产生的抗原特异性CTL是机体抗肿瘤免疫的主要机制,因此DCs的功能状态直接影响肿瘤免疫治疗的效果,也可能与肿瘤在机体内的免疫逃避密切相关。为探讨尼古丁刺激未成熟DCs （immature DCs, imDCs）抗肿瘤机制和肿瘤细胞对imDCs功能状态的影响,imDCs先以尼古丁刺激或与表达肿瘤特异性抗原的小鼠淋巴瘤细胞EG7、表达肿瘤相关抗原的小鼠黑色素瘤细胞B16和小鼠肝癌细胞Hepa1-6体外直接共培养,次以流式细胞术检测imDCs的表面分子表达情况、吞噬能力及imDCs所介导的抗原特异性淋巴细胞增殖能力,再以ELISA、ELISPOT分别检测imDCs所介导抗原特异性淋巴细胞增殖反应中细胞因子IL-12分泌、抗原特异性CTL增殖分化情况,最后以表达肿瘤特异性抗原之小鼠淋巴瘤EG7细胞、表达肿瘤相关抗原之小鼠淋巴瘤EL4、肺癌LLC、肝癌Hepa 1-6细胞荷瘤小鼠,并经腹腔转输尼古丁刺激联合肿瘤抗原负载之imDCs,检验尼古丁刺激imDCs的抗肿瘤效果。结果显示:尼古丁刺激不但可明显增加imDCs CD80、CD86、CD40、CD54等表面分子和趋化因子受体CCR7表达,而且也明显增强imDCs对抗原的吞噬能力;尼古丁刺激也明显增强imDCs所介导的抗原特异性淋巴细胞增殖、IL-12分泌、CTL增殖分化能力;尤为重要的是,小鼠荷瘤实验证实,尼古丁刺激imDCs体内转输不但对表达肿瘤特异性抗原的淋巴瘤有预防和和治疗效果,而且也可用于表达肿瘤相关抗原的小鼠淋巴瘤、肺癌、肝癌的预防和治疗。肿瘤细胞-imDCs共培养不但显着降低imDCs表面分子CD80、CD54、CD11b、CD11a及MHC II类分子表达,而且也降低imDCs所介导的抗原特异性淋巴细胞增殖、IL-12分泌及CTL增殖分化能力。上述结果提示:尼古丁刺激能明显改善imDCs所介导的抗原特异性CTL增殖的能力,尼古丁刺激imDCs具有明显的抗肿瘤效应,尼古丁刺激imDCs可望成为肿瘤免疫治疗的有效策略。肿瘤细胞与imDCs共培养可直接损害imDCs所介导的抗原特异性CTL增殖的能力,可能是肿瘤逃避机体免疫打击的机制之一。
汤旭东[7]（2007）在《小鼠肝素酶H-2K～b限制性CTL表位的预测、鉴定及其体内抗肿瘤免疫效应研究》文中研究表明研究背景和目的恶性肿瘤是严重影响人类健康的重要疾病之一,目前对恶性肿瘤的治疗仍然以手术切除、放射治疗、化学治疗为主要手段。手术治疗对早期肿瘤具有良好的治疗效果,但中晚期患者由于多发生局部侵润和远处转移,已失去手术治疗的指针,而放化疗由于其毒副作用大而往往不为患者所接受。因此,有必要寻找一种新的、特异性强的、主要针对于中晚期肿瘤患者的治疗方式,以尽可能地减轻患者的痛苦,延长患者的生命。近年来,以树突状细胞（Dendritic cells, DC）为基础的肿瘤免疫治疗因毒副作用小、特异性强而越来越受到学者们的重视。肿瘤相关抗原（Tumor associated antigen, TAA）与DC的结合是目前以DC为基础的肿瘤免疫治疗的主要方式。目前已发现并克隆了许多肿瘤相关抗原,但这些TAA的组织特异性太强,如AFP来源于肝癌、PSA来源于前列腺癌、CEA来源于消化道及呼吸道肿瘤,以这些抗原为靶位的免疫治疗只能针对表达这些抗原的肿瘤细胞,因此治疗窗太小。因此有必要寻找一种广谱的肿瘤相关抗原用于肿瘤的免疫治疗。理想的肿瘤相关抗原应该具备:（1）在绝大多数肿瘤组织中表达从而可以广泛应用;（2）只表达于肿瘤细胞以避免自身免疫反应;（3）不表达于正常成熟组织以避免免疫耐受;（4）在肿瘤的发生发展过程中具有不可替代的作用,以避免抗原缺失;（5）能诱导足够强度的免疫反应并导致肿瘤消退;（6）同时包含有MHCⅠ和MHCⅡ类分子,从而可诱导CD4+和CD8+ T细胞反应。细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）介导的特异性细胞免疫在机体抗肿瘤中起着非常重要的作用,能有效激发特异性CTL应答是目前肿瘤免疫治疗的重要研究目标。随着对机体抗肿瘤免疫机制的深入研究,人们已经认识到诱发体内细胞毒T淋巴细胞发挥抗瘤作用的并不是整个肿瘤抗原分子而是与MHC分子结合的短肽即CTL表位（epitopes）,因此,寻找特异性肿瘤抗原及其相应的CTL表位成为肿瘤免疫治疗的热点。肝素酶（Heparanase, Hpa）是目前发现的唯一能够降解细胞外基质（Extracellular matrix ,ECM）及基底膜（Basal membrane, BM）中硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans, HSPG）的内源性糖苷内切酶,在正常组织中除淋巴细胞、骨髓等少有表达外,在正常成熟的非免疫组织中（如心、肺、肝脏、骨骼肌及胰腺等）均不表达,但在几乎所有的转移性恶性肿瘤细胞中普遍存在,抑制肝素酶的表达可以明显抑制肿瘤的增殖及转移。由于Hpa的活化,肿瘤细胞不仅可以突破ECM及BM屏障,而且还可以释放多种因子,促进肿瘤新生血管的生成及肿瘤细胞的局部定殖,Hpa的活化是肿瘤细胞发生转移的一个重要因素。某些肿瘤细胞为逃避免疫监视而下调肿瘤相关抗原的表达,但如果为逃避免疫监视而下调Hpa的表达,其本身就足以抑制肿瘤细胞的增殖及转移。因此,Hpa可以作为一种广谱的肿瘤转移相关抗原用于中晚期肿瘤的免疫治疗。我们既往的研究也发现负载了Hpa全长基因的DC可以诱导肝素酶特异性CTL反应,对Hpa阳性的且HLA匹配的胃癌细胞具有明显的免疫杀伤效应,对于Hpa阳性但HLA不匹配的胃癌细胞则不具有杀伤效应。该结果不仅提示Hpa是肿瘤免疫治疗的一个新的靶点,而且提示其氨基酸全长序列中肯定存在CTL抗原表位,这种表位经DC递呈后可以激活CTL,从而发挥抗肿瘤效应。基于以上分析,本研究拟在国家自然科学基金的资助下,从小鼠肝素酶（mHpa）抗原表位的预测和鉴定开始,系统研究mHpa抗原表位能否在动物体内诱导mHpa特异性的CTL反应,为肝素酶抗原表位的临床应用提供理论依据。方法1.应用表位预测的超基序、量化基序结合人工神经网络方案,在互联网上对小鼠肝素酶H-2Kb限制性CTL表位进行预测;根据预测结果,应用固相合成法正确地合成了高纯度的候选表位肽;使用小鼠TAP缺陷的RMA-S细胞在体外对合成的候选表位肽进行肽与H-2Kb分子的亲和力分析;采用标准51Cr释放试放实验检测候选表位诱导的CTL对同来源的鼠源性肿瘤细胞的免疫杀伤效应,初步筛选出能诱导mHpa特异性的抗原表位。2.分离培养C57BL/6（H-2Kb）小鼠骨髓来源的树突状细胞（mDC） ,联合rmGM-CSF、rmIL-4及rmTNF-α诱导mDC成熟,利用光镜及电镜技术从形态学上进行鉴定,并结合流式细胞术从细胞表面CD分子进行鉴定;用上述筛选的候选表位负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,然后取其脾淋巴细胞作为效应细胞,采用标准51Cr释放试验检测肝素酶特异性CTL对B16黑色素瘤细胞(mHpa+, H-2Kb+)、Lewis肺癌细胞(mHpa+, H-2Kb+)、EL-4淋巴瘤细胞(mHpa+, H-2Kb+)以及P815肥大细胞瘤细胞(mHpa+, H-2Kd+)的免疫杀伤效应;采用H-2Kb单克隆抗体封闭上述靶细胞的H-2Kb位点后再用肝素酶表位特异性CTL杀伤上述靶细胞,以研究筛选的肝素酶表位是否受H-2Kb限制;采用标准51Cr释放试验研究了肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞和mDC的免疫杀伤活性,以研究肝素酶特异性CTL可能产生的毒负作用;采用ELISPOT法检测了肝素酶特异的效应细胞的IFN-γ释放情况。3.为研究上述筛选的表位肽对实验动物的免疫保护效应,先用候选表位负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,再将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠皮下,一月后处死,观察肿瘤大小的变化;为研究上述筛选的表位肽对实验动物的免疫治疗效应,先将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠皮下,一周后待肿瘤长至1mm时,再用候选表位肽负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠,一月后处死荷瘤鼠,观察肿瘤大小的变化。结果1.采用生物信息学技术利用互联网上提供的表位预测程序预测出5条肝素酶候选表位肽,即mHpa386-393（VDENFEPL）、mHpa351-358（FAAGFMWL）、mHpa 398- 405 （LSLLFKKL）、mHpa234-241（LGEDFVEL）、mHpa519-526 （FSYGFFVI）;亲和力分析发现预测的5条多肽均能与RMA-S细胞表达的H-2Kb分子有效结合;采用标准51Cr释放实验检测上述肝素酶表位肽负载mDC后诱导的肝素酶特异性CTL对B16黑色素瘤细胞、Lewis肺癌细胞的免疫杀伤效应,结果表明,mHpa398-405、mHpa519-526诱导的CTL对靶细胞具有明显的杀伤效应,而mHpa386-393、mHpa351-358和mHpa234-241诱导的CTL对靶细胞的杀伤效应较弱,提示mHpa398-405、mHpa519-526可以作为小鼠肝素酶候选表位用于下一步的实验研究。2.分离培养C57BL/6（H-2Kb）小鼠骨髓来源的树突状细胞（mDC）,用重组小鼠细胞因子（rmGM-CSF、rmIL-4及rmTNF-α）联合诱导扩增,经形态学及细胞表面CD分子鉴定,成功制备小鼠骨髓来源的成熟DC;用mHpa398-405、mHpa519-526负载骨髓源的mDC,于皮下注射免疫C57BL/6小鼠三次,取其脾淋巴细胞作为效应细胞,采用标准51Cr释放实验检测肝素酶抗原表位特异性CTL对不同的鼠源性肿瘤细胞的免疫杀伤效应,结果表明,肝素酶特异性CTL对肝素酶阳性且H-2Kb阳性的B16黑色素瘤细胞、Lewis肺癌细胞以及EL-4淋巴瘤细胞具有明显的杀伤效应,而对肝素酶阳性但H-2Kb阴性的P815肥大细胞瘤细胞不具有杀伤效应,我们还发现,肝素酶特异性CTL对表达肝素酶的自体淋巴细胞和mDC没有明显的杀伤效应;用H-2Kb封闭靶细胞表面的H-2Kb标记,再用肝素酶特异性CTL对靶细胞进行杀伤研究,结果表明,肝素酶抗原表位特异性CTL对封闭了H-2Kb的靶细胞无明显杀伤效应,提示上述CTL反应是肝素酶特异、且受H-2Kb限制的;采用ELISPORT检测肝素酶特异性效应细胞IFN-γ的分泌能力,结果表明,肝素酶抗原表位能明显促进效应细胞IFN-γ的分泌。3.为在体研究mHpa398-405、mHpa519-526肝素酶表位肽对小鼠的免疫保护及免疫治疗效应,我们先将mHpa398-405、mHpa519-526负载的mDC疫苗分别免疫C57BL/6小鼠,每周一次,共免疫三次后,再将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠皮下,一月后处死,观察肿瘤大小的变化,结果表明,mHpa398-405、mHpa519-526免疫保护组小鼠皮下肿瘤体积明显小于阴性肽及未保护组,提示mHpa398-405、mHpa519-526对荷瘤小鼠具有明显的免疫保护效应;进一步我们先将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠皮下,一周后待肿瘤长至1mm时,再用mHpa398-405、mHpa519-526肽负载的mDC疫苗分别免疫C57BL/6小鼠,一月后处死荷瘤鼠,观察肿瘤大小的变化,结果表明,mHpa398-405、mHpa519-526免疫治疗组小鼠皮下肿瘤体积明显小于阴性肽及未治疗组,提示mHpa398-405、mHpa519-526对荷瘤小鼠具有明显的免疫治疗效应。结论1.采用生物信息学并结合实验技术首次从小鼠肝素酶全长氨基酸序列中筛选出2条受H-2Kb限制的CTL表位,即mHpa398-405 （LSLLFKKL）和mHpa519-526 （FSYGFFVI）2.动物实验表明mHpa398-405、mHpa519-526可以诱导产生肝素酶特异性CTL,对肝素酶阳性且H-2Kb相匹配的肿瘤细胞具有明显的免疫杀伤活性,对H-2Kb阴性的肿瘤细胞不具有杀伤效应,对封闭了H-2Kb的靶细胞亦无明显杀伤效应,提示小鼠肝素酶抗原表位诱导的CTL反应是肝素酶特异且受H-2Kb限制;小鼠肝素酶特异性CTL对表达肝素酶的自体淋巴细胞和mDC无免疫杀伤活性,提示小鼠肝素酶抗原表位的安全性;小鼠肝素酶抗原表位mHpa398-405、mHpa519-526负载的mDC可以促进效应细胞IFN-γ释放,提示小鼠肝素酶抗原表位可以促进非特异性的抗肿瘤免疫效应。3. mHpa398-405、mHpa519-526对荷瘤小鼠具有明显的免疫保护及治疗作用。以上研究表明,小鼠肝素酶特异性抗原表位mHpa398-405、mHpa519-526不仅能激发机体特异性的抗肿瘤效应,而且还能诱导一个非特异性抗肿瘤的良性循环,这种小鼠肝素酶多肽疫苗具有广谱、高效、特异、安全的优点。本研究从动物在体实验初步证实了肝素酶抗原表位多肽疫苗临床应用的可能性。
程光惠[8]（2007）在《低剂量电离辐射诱导免疫适应性反应的DNA修复机制》文中研究表明DNA修复是低剂量电离辐射诱导适应性反应的主要机制之一。辐射等因素主要引起DNA双链断裂（DSB）,损伤的修复以非同源末端连接（NHEJ）为主,NHEJ修复相关基因有p53、PI3K家族成员（ATM、DNA-PKcs）和PARP-1等。本实验采用分子生物学手段,在离体水平观察低剂量辐射诱导EL-4细胞凋亡及细胞周期进程的适应性反应,伴随其相关基因蛋白和mRNA水平的变化。同时,应用ATM和DNA-PK阻断剂渥曼青霉素,PARP-1阻断剂3-AB进一步证实上述基因在适应性反应中的作用。实验表明,低剂量辐射可以在体外诱导EL-4细胞凋亡及细胞周期进程的适应性反应。在低剂量辐射诱导适应性反应中,p53表达减少,ATM和DNA-PKcs表达无明显变化,PARP-1表达增加;应用3-AB后未出现适应性反应。渥曼青霉素对适应性反应无影响,可能与渥曼青霉素作用机制有关,即其抑制ATM和DNA-PK,但不抑制p38MAPK及PKC,而后者可激活p53蛋白。以上结果显示:p53和PARP-1基因均在适应性反应中起作用。其中,p53基因在适应性反应中起决定性作用,而ATM和DNA-PK无明显作用。表明DNA修复可能是低剂量电离辐射诱导适应性反应的主要机制。
罗小玲[9]（2006）在《树突状细胞介导肝癌免疫治疗的实验与临床研究》文中研究指明原发性肝癌（简称肝癌）是我国常见的恶性肿瘤，发病率呈上升趋势。近二十年来肝癌的疗效虽然有明显提高，但复发转移仍然严重阻碍着治疗效果的进一步提高，威胁着患者的生命。因此，预防和治疗肝癌复发转移的研究具有重大意义。肝癌的免疫治疗一直是研究的热点，树突状细胞（dendritic，DC）作为目前发现的功能最强大的专职抗原提呈细胞，具有独特的抗原提呈和激发功能，是免疫反应的核心和关键，在机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用。本课题设想通过研究肝癌组织中浸润性树突状细胞（tumor infiltrating dendritic cell，TIDC）数量和表型变化及其临床意义，阐明DC与肝癌发生发展和预后的关系及作用机制；然后从肝癌患者外周血诱导扩增DC，制备负载肝癌抗原的DC瘤苗，观察其体内外抗肿瘤作用，并应用于临床对肝癌进行免疫治疗，旨在探讨一种DC介导的肝癌免疫治疗的有效手段。 第一部分，我们首先探讨了肝癌组织中DC浸润的数量及其临床意义。采用免疫组化方法和原位末端标记技术检测了60例原发性肝癌患者术后组织标本中DC标志蛋白S-100+DC、记忆性T淋巴细胞标志CD45RO分子、CD4+、CD8+T淋巴细胞浸润和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表达以及肝癌细胞凋亡指数（apoptosis index，AI），分析肝癌组织中浸润DC数量变化及其临床意义，并分析DC浸润与CD45RO+T淋巴细胞浸润、肝癌细胞增殖和凋亡的相关性。结果显示，在60例肝癌组织中，DC浸润的数量范围为8～76个/10个HPF，平均数为（20.45±11.76）个/10个HPF。浸润DC的数量与年龄、肿瘤大小、AFP水平、HBV感染等因素无关；与肿瘤分化程度、门静脉癌栓形成有关。高分化肝癌中浸润DC的数量高于低分化肝癌；在无门静脉癌栓形成的肝癌组织中浸润DC的数量显着高于有门静脉癌栓的肝癌组织。多因素Cox Regression分析和Pearson相关分析表明DC浸润可影响预后，与术后无瘤生存期显着相关。DC高浸润组患者
徐洁洁[10]（2006）在《EB病毒潜伏膜蛋白2A转染树突状细胞诱导特异性CTL杀伤鼻咽癌的体外、体内研究》文中研究表明鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）为上皮来源的恶性肿瘤，高发于东南亚及我国华南地区。鼻咽癌通常不亦采用手术切除，放、化疗虽然对其有效，然而对部分病例并不能完全杀灭、清除肿瘤细胞，尤其是转移病灶和循环血液中的肿瘤细胞更难清除，并且治疗产生的副作用可进一步损伤机体免疫系统功能，部分患者易复发和转移。籍此，寻求有效的免疫治疗方法是鼻咽癌治疗研究的热点问题。 研究证实，机体抗肿瘤效应主要以细胞毒性T细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）介导的细胞免疫为主，肿瘤抗原必须经过抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC）加工、处理，才能激发有效的抗肿瘤免疫反应。树突状细胞（dendritic cell，DC）是目前发现功能最强、唯一能激活初始型T细胞并诱导机体产生初次免疫应答的APC。越来越多的证据表明，应用各种形式的抗原修饰DC，可在体内外诱导出特异性CTL，激发出有效的抗肿瘤免疫效应。近期体外、动物及临床研究已显示出DC在肿瘤治疗中的巨大应用前景。 进行CTL为基础的治疗前提是需选择一合适的肿瘤靶抗原。研究已证实EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）与鼻咽癌关系密切，该病毒是比较明确的DNA肿瘤病毒，近年血清流行病学、肿瘤EB病
二、B7-1基因转染小鼠EL-4淋巴瘤细胞体外诱导免疫小鼠脾细胞产生的白细胞介素-2（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、B7-1基因转染小鼠EL-4淋巴瘤细胞体外诱导免疫小鼠脾细胞产生的白细胞介素-2（论文提纲范文）
（1）Th17细胞中SOX-5介导RORγt基因新的增强子RORCE2与启动子相互作用的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 增强子RORCE2 通过增强RORγt的表达促进Th17 细胞的分化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 SOX-5 介导增强子RORCE2与RORγt启动子的相互作用影响Th17 细胞的分化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 Th17 细胞中SOX-5与STAT3 协同诱导增强子RORCE2 的染色质开放 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Th17 细胞中RORγt转录调控及转录后调控的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（2）长链非编码RNA Snhg1在记忆CD8+T细胞分化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 在急性病毒感染中lncRNA Snhg1 促进病毒特异性记忆CD8~+T细胞分化 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 本章小结与讨论 |
| 第二章 Snhg1 通过与囊泡运输蛋白Vps13D相互作用调控记忆CD8~+T细胞分化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 本章小结与讨论 |
| 第三章 Snhg1-Vps13D通过IL-7-IL-7R-STAT3-TCF-1 轴调控记忆CD8~+T细胞分化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 本章小结与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 记忆CD8~+T细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）IL-6和TNF-α经NF-κB-miR-34a/miR-31-Foxp3信号轴导致Treg/Th17细胞失衡（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 自身免疫性疾病 |
| 1.1.1 Treg细胞与自身免疫性疾病 |
| 1.1.2 Th17细胞与自身免疫性疾病 |
| 1.1.3 炎症微环境与Treg/Th17比例失衡 |
| 1.2 miRNA |
| 1.2.1 miRNA的生物合成与作用机制 |
| 1.2.2 miRNA与免疫 |
| 1.2.3 miRNA与自身免疫性疾病 |
| 1.3 NF-κB及其信号通路 |
| 1.3.1 NF-κB通路概述 |
| 1.3.2 NF-κB与免疫 |
| 1.3.3 NF-κB与自身免疫性疾病 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 本研究的目的、内容、方法、实验方案以及意义 |
| 2.1 研究目的 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.4 实验方案 |
| 2.4.1 体外验证miR-34a和miR-31对Foxp3表达水平的调控 |
| 2.4.2 探讨Foxp3~+细胞中miR-34a和miR-31的表达水平 |
| 2.4.3 IL-6、TNF-α 介导miR-34a和miR-31调控Foxp3的机制初探 |
| 2.5 研究意义 |
| 第三章 实验材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物与试剂 |
| 3.1.2 主要仪器和耗材 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.2 实验内容与方法 |
| 3.2.1 体外验证miR-34a和miR-31对Foxp3表达水平的调控 |
| 3.2.1.1 相关质粒图谱及引物 |
| 3.2.1.2 小鼠逆转录病毒重组质粒MGP-31构建 |
| 3.2.1.3 小鼠慢病毒重组质粒p LV-miR-31构建 |
| 3.2.1.4 质粒转染HEK-293T细胞 |
| 3.2.1.5 qPCR检测miR-34a、miR-31和Foxp3 mRNA水平 |
| 3.2.1.6 Immunoblot技术检测Foxp3蛋白水平 |
| 3.2.2 Foxp3~+细胞中miR-34a和miR-31的表达水平 |
| 3.2.2.1 体外诱导iTreg细胞 |
| 3.2.2.2 qPCR检测Foxp3 mRNA、miR-34a和miR-31的表达水平 |
| 3.2.2.3 体外Foxp3~+ EL4细胞 |
| 3.2.2.4 普通PCR检测Foxp3基因水平，qPCR检测Foxp3 mRNA、miR-34a和miR-31 |
| 3.2.3 IL-6、TNF-α 介导miR-34a和miR-31调控Foxp3的机制初探 |
| 3.2.3.1 体外诱导小鼠Th17细胞 |
| 3.2.3.2 qPCR检测miR-34a和miR-31的表达水平 |
| 3.2.3.3 IL-6 及TNF-α 分别刺激小鼠CD4~+T和EL4细胞 |
| 3.2.3.4 qPCR检测miR-34a和miR-31的表达水平 |
| 3.2.3.5 IL-6 刺激Treg细胞 |
| 3.2.3.6 流式细胞术鉴定Treg细胞 |
| 3.2.3.7 IL-6、TNF-α 及NF-κB抑制剂分别刺激Foxp3~+ EL4细胞 |
| 3.2.3.8 Immunoblot技术检测NF-κB活性以及Foxp3表达水平 |
| 3.2.3.9 qPCR检测miR-34a和miR-31的表达水平 |
| 3.2.4 统计学方法 |
| 第四章 实验结果及讨论 |
| 4.1 体外验证miR-34a和miR-31对Foxp3表达水平的调控 |
| 4.1.0 aMGP-31逆转录病毒重组质粒构建成功 |
| 4.1.1 bpLV-miR-31慢病毒重组质粒构建成功 |
| 4.1.2 miR-31抑制Foxp3 mRNA水平 |
| 4.1.3 miR-34a和miR-31抑制Foxp3的蛋白水平 |
| 4.1.4 小结 |
| 4.2 Foxp3~+细胞中miR-34a和miR-31的表达水平 |
| 4.2.1 iTreg细胞中Foxp3与miR-34a和miR-31的表达水平呈负相关 |
| 4.2.2 Foxp3~+ EL4细胞中Foxp3与miR-34a和miR-31的表达水平呈负相关 |
| 4.2.3 小结 |
| 4.3 IL-6、TNF-α 介导miR-34a和miR-31调控Foxp3的机制初探 |
| 4.3.1 Th17细胞中miR-34a和miR-31的表达水平上调 |
| 4.3.2 IL-6 和TNF-α 上调miR-34a和miR-31的表达水平 |
| 4.3.3 IL-6 和TNF-α 抑制Foxp3蛋白水平 |
| 4.3.4 NF-κB参与miR-34a和miR-31对Foxp3表达的调控 |
| 4.3.5 小结 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 主要结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 综述：小鼠Treg细胞治疗自身免疫性疾病的实验室研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章及参加的会议 |
（4）SOCS1基因修饰的骨髓树突状细胞对同种移植排斥的治疗作用及其机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 小鼠骨髓树突状细胞体外培养及SOCS1基因转染 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SOCS1基因修饰的树突状细胞的表型特征及体外免疫学功能分析 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 SOCS1基因修饰的树突状细胞治疗同种移植排斥的效果和免疫学机制 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 综述Ⅰ 树突状细胞诱导移植免疫耐受的研究进展 |
| 综述Ⅱ SOCS1对机体固有免疫及获得性免疫调控作用的研究进展 |
| 博士期间发表论文及参与科研情况 |
| 致谢 |
（5）肿瘤细胞裂解物—结核分枝杆菌热休克蛋白65的抗肺癌作用（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 热休克蛋白 |
| 1.2.2 肿瘤细胞裂解物（TCL） |
| 1.2.3 抗肿瘤疫苗研究进展 |
| 1.3 材料与方法 |
| 1.3.1 实验材料 |
| 1.3.2 实验方法 |
| 第2章 论文主体 |
| 2.1 实验结果 |
| 2.1.1 MHSP65-TCL 的制备及鉴定 |
| 2.1.2 MHSP65-TCL 的抗Lewis 肺癌作用 |
| 2.1.3 B16 细胞来源 MHSP65-TCL 抗黑色素瘤作用的初步探索 |
| 2.2 讨论 |
| 2.2.1 MHSP65-TCL 抗肿瘤疫苗的制备方式与组成成分的初步探索 |
| 2.2.2 MHSP65-TCL 诱导特异性抗肿瘤免疫 |
| 2.2.3 MHSP65-TCL 诱导非特异性抗肿瘤免疫 |
| 2.2.4 MHSP65-TCL 诱导的特异性与非特异性免疫的关系 |
| 2.2.5 MHSP65-TCL 免疫流程与治疗效果 |
| 2.2.6 MHSP65-TCL 免疫剂量与治疗效果 |
| 2.2.7 问题与展望 |
| 第3章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 学术成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 个人简历 |
（6）尼古丁刺激DCs抗肿瘤机制及肿瘤微环境DCs失能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 尼古丁体外刺激增强树突状细胞所介导抗肿瘤效应研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 方法 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 设备 |
| 2.3 动物 |
| 2.4 细胞系 |
| 2.5 骨髓来源DCs的诱导 |
| 2.6 DCs的尼古丁刺激 |
| 2.7 细胞凋亡检测 |
| 2.8 肿瘤细胞溶解物制备 |
| 2.9 流式细胞胞内染色 |
| 2.10 流式细胞分析术 |
| 2.11 细胞吞噬功能检测 |
| 2.12 DCs介导抗原特异性淋巴细胞增殖实验 |
| 2.13 IL-12细胞因子检测 |
| 2.14 IFN-γELISPOT检测 |
| 2.15 BrdU掺入法检测细胞增殖实验 |
| 2.16 CTL杀伤肿瘤细胞需要抗原特异性CTL实验 |
| 2.17 淋巴瘤模型预防性肿瘤保护实验 |
| 2.18 淋巴瘤模型治疗性肿瘤保护试验 |
| 2.19 肺癌LLC肿瘤模型预防性肿瘤保护实验 |
| 2.20 肺癌LLC肿瘤模型治疗性肿瘤保护实验 |
| 2.21 肝癌Hepa1-6肿瘤模型预防性肿瘤保护实验 |
| 2.22 肝癌Hepa1-6肿瘤模型治疗性肿瘤保护实验 |
| 2.23 尼古丁腹腔直接注射治疗肿瘤实验 |
| 2.24 统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 α7 nAchR组成性表达于DCs表面，并受尼古丁刺激而表达上调 |
| 3.2 尼古丁剂量依赖性的诱导im DCs凋亡 |
| 3.3 尼古丁促进imDCs表达表面共刺激分子和趋化因子受体 |
| 3.4 尼古丁增加im DCs共刺激分子表达的作用可被筒箭毒硷所拮抗 |
| 3.5 尼古丁刺激不增加maDCs表面分子表达 |
| 3.6 尼古丁刺激可促进im DCs介导的T细胞增殖和IL-12分泌 |
| 3.7 尼古丁刺激增强DCs介导CTL增殖分化能力 |
| 3.8 CTL杀伤肿瘤细胞具有抗原特异性 |
| 3.9 尼古丁刺激im DCs体内转输对淋巴瘤形成有预防作用 |
| 3.10 尼古丁刺激imDCs体内转输对淋巴瘤成瘤有治疗作用 |
| 3.11 尼古丁刺激增强DCs介导的肺癌LLC抗原特异性淋巴细胞增殖反应 |
| 3.12 尼古丁刺激im DCs体内转输对肺癌LLC形成有预防作用 |
| 3.13 尼古丁刺激imDCs体内转输对肺癌LLC荷瘤小鼠有治疗作用 |
| 3.14 尼古丁刺激增强DCs介导的Hepa 1-6抗原特异性TH 1免疫反应 |
| 3.15 尼古丁刺激im DCs体内转输对肝癌Hepa 1-6形成有预防作用 |
| 3.16 尼古丁刺激im DCs体内转输对肝癌Hepa 1-6荷瘤小鼠有治疗作用 |
| 3.17 尼古丁体内直接注射无抗肿瘤效应 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 6. 参考文献 |
| 第二部分 体外模拟肿瘤微环境中树突状细胞失能研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 方法 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 设备 |
| 2.3 动物 |
| 2.4 细胞系 |
| 2.5 肿瘤细胞溶解物制备 |
| 2.6 骨髓来源DCs的诱导 |
| 2.7 肿瘤细胞-DCs共培养 |
| 2.8 流式细胞分析术 |
| 2.9 抗原特异性淋巴细胞增殖实验 |
| 2.10 IL-12细胞因子检测 |
| 2.11 IFN-γELISPOT 检测 |
| 2.12 统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 TSA肿瘤细胞-DCs共培养下调DCs表面分子表达 |
| 3.2 TAA肿瘤细胞-DCs共培养下调DCs表面分子表达 |
| 3.3 肿瘤细胞-DCs共培养降低DCs介导抗原特异性T细胞增殖能力 |
| 3.4 肿瘤细胞-DCs共培养显着降低DCs介导TH1 T细胞增殖能力 |
| 3.5 肿瘤细胞-DCs共培养降低DCs介导抗原特异性CTL分化增殖能力 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 6. 参考文献 |
| 第三部分 尼古丁对免疫细胞功能影响研究进展(综述) |
| 1. 尼古丁对单核-巨噬细胞功能影响 |
| 2. 尼古丁对树突状细胞功能的影响 |
| 3. 尼古丁对 T 淋巴细胞功能的影响 |
| 4. 尼古丁对 B 淋巴细胞功能的影响 |
| 5. 烟草成分不等同于区别于尼古丁 |
| 6. 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及成果 |
（7）小鼠肝素酶H-2K～b限制性CTL表位的预测、鉴定及其体内抗肿瘤免疫效应研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 小鼠肝素酶H-2K~b限制性CTL表位的预测、鉴定及其体内抗肿瘤免疫效应研究 |
| 第一部分 小鼠肝素酶H-2K~b限制性CTL 表位的预测及初步鉴定 |
| 前言 |
| 第一节 小鼠肝素酶H-2K~b限制性CTL 表位的预测 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第二节 小鼠肝素酶候选表位的合成、纯化与鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第三节 小鼠肝素酶候选表位与H-2K~b分子的亲和力分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第四节 小鼠肝素酶H-2K~b限制性CTL 表位的实验鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 小鼠肝素酶H-2K~b限制性CTL 表位体内抗肿瘤效应研究 |
| 前言 |
| 第一节 小鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第二节 小鼠肝素酶CTL 表位负载的mDC 疫苗体内诱导肝素酶特异性CTL 反应的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第三节 小鼠肝素酶CTL 表位对荷瘤小鼠的免疫保护和免疫治疗效应研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 实验图片 |
| 文献综述 CTL 表位预测的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（8）低剂量电离辐射诱导免疫适应性反应的DNA修复机制（论文提纲范文）
| 提要 |
| 前言 |
| 英文缩写 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 电离辐射诱导适应性反应及其规律性 |
| 2 低剂量辐射诱导适应性反应机制 |
| 3 低剂量辐射兴奋效应的共同机理问题 |
| 4 DNA 损伤修复/细胞周期调控/凋亡 |
| 5 低剂量辐射诱导适应性反应的信号传导通路[104] |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 主要试剂 |
| 2 器材 |
| 3 仪器 |
| 4 低剂量辐射诱导 EL-4 细胞适应性反应的时间、剂量和剂量率效应 |
| 5 EL-4 细胞 P53 蛋白表达的检测 |
| 6 EL-4 细胞中 P53 MRNA 表达含量的影响 |
| 7 3-AB 对小鼠 EL-4 淋巴瘤细胞中 PARP-1 蛋白表达的时程变化 |
| 8 3-AB阻断后电离辐射对小鼠EL-4淋巴瘤细胞PARP-1蛋白表达的影响 |
| 9 WORTMANNIN阻断后电离辐射对小鼠 EL-4 淋巴瘤细胞 ATM 和 DNA- PKC蛋白表达的影响 |
| 10 统计学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 1 LDR 诱导体外 EL-4 淋巴瘤细胞凋亡及细胞周期进程适应性反应的剂量效应 |
| 2 LDR 诱导体外 EL-4 淋巴瘤细胞凋亡及细胞周期进程适应性反应的剂量率效应 |
| 3 LDR 诱导体外 EL-4 淋巴瘤细胞凋亡及细胞周期进程适应性反应的时间效应 |
| 4 大剂量照射前给予75 MGY 照射对 EL-4 细胞 P53 的影响 |
| 5 大剂量照射前给予75 MGY照射及3-AB 对EL-4 细胞适应性反应的影响 |
| 6 大剂量照射前给予75 MGY 照射及3-AB 对 EL-4 细胞 PARP-1 表达的影响 |
| 7 大剂量照射前给予75 MGY照射及WORTMANNIN 对EL-4 细胞适应性反应的影响 |
| 8 大剂量照射前给予75 MGY照射及WORTMANNIN 对EL-4 细胞 ATM 表达的影响 |
| 9 大剂量照射前给予75 MGY 照射及 WORTMANNIN对 EL-4 细胞 DNA-PKcs表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 1 低剂量辐射诱导EL-4 细胞适应性反应及其规律性 |
| 2 NHEJ 修复有可能是低剂量电离辐射诱导适应性反应的主要机制 |
| 3 攻击剂量照射联合阻断剂对细胞凋亡和细胞周期进程的影响及相关基因变化 |
| 4 D1 + D2 照射联合阻断剂对细胞凋亡和细胞周期进程的影响及相关基因变化 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间已发表及待发表论文 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）树突状细胞介导肝癌免疫治疗的实验与临床研究（论文提纲范文）
| 缩写词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 第一部分：肿瘤浸润性树突状细胞的数量和表型变化与原发性肝癌发生发展和预后关系的研究 |
| 1 人肝癌组织中浸润性树突状细胞的数量变化及其临床意义 |
| 2 人肝癌组织中浸润性树突状细胞的表型变化和原因分析 |
| 3 肝癌细胞培养上清对人外周血来源树突状细胞分化发育的影响 |
| 第二部分：体外诱导肝癌患者外周血树突状细胞及其抗肿瘤作用 |
| 1 肝癌患者外周血树突状细胞的诱导扩增及其免疫学功能研究 |
| 2 负载肝癌抗原的树突状细胞瘤苗增强CD_3AK细胞的抗肿瘤作用 |
| 3 负载肝癌抗原的树突状细胞瘤苗诱导的抗肿瘤免疫效应 |
| 第三部分：负载肝癌抗原树突状细胞瘤苗诱导的体内抗肿瘤作用研究 |
| 1 负载肝癌抗原树突状细胞瘤菌免疫小鼠诱导的免疫保护作用 |
| 2 负载肝癌抗原树突状细胞瘤苗对荷瘤小鼠的治疗作用 |
| 第四部分：负载肝癌抗原树突状细胞瘤苗治疗原发性肝癌的临床研究 |
| 1 负载肝癌抗原树突状细胞瘤苗的临床前质量控制研究 |
| 2 应用负载肝癌抗原树突状细胞瘤苗治疗原发性肝癌的临床研究 |
| (1) 肝动脉化疗栓塞(TACE)联合DC激活的CD_3AK细胞治疗不能行手术切除的中晚期原发性肝癌疗效观察 |
| (2) 应用负载肝癌抗原DC瘤苗预防原发性肝癌术后复发转移研究 |
| 全文总结 |
| 本研究的创新点及意义 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 1 肿瘤浸润性树突状细胞的研究进展 |
| 2 以树突状细胞为基础的肝癌免疫基因治疗研究进展 |
| 在读期间发表的相关论文 |
| 致谢 |
（10）EB病毒潜伏膜蛋白2A转染树突状细胞诱导特异性CTL杀伤鼻咽癌的体外、体内研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景 |
| 第一部分：EB病毒潜伏膜蛋白2A在鼻咽癌患者肿瘤组织中的表达检测 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分：人外周血树突状细胞的诱导及转染EB病毒潜伏膜蛋白2A基因 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分：EB病毒潜伏膜蛋白2A特异性CTLs的诱导及对鼻咽癌细胞体外杀伤活性观察 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分：EB病毒潜伏膜蛋白2A特异性CTLs对裸鼠鼻咽癌模型体内抗瘤效果研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 综述1：肿瘤疫苗免疫疗法的研究及应用进展 |
| 综述2：鼻咽癌的免疫治疗研究现状 |
| 博士期间发表的文章及获得的资助课题 |
| 论文独创性声明、论文使用授权声明 |
四、B7-1基因转染小鼠EL-4淋巴瘤细胞体外诱导免疫小鼠脾细胞产生的白细胞介素-2（论文参考文献）
- [1]Th17细胞中SOX-5介导RORγt基因新的增强子RORCE2与启动子相互作用的机制研究[D]. 韩超. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [2]长链非编码RNA Snhg1在记忆CD8+T细胞分化中的作用及机制研究[D]. 李保华. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [3]IL-6和TNF-α经NF-κB-miR-34a/miR-31-Foxp3信号轴导致Treg/Th17细胞失衡[D]. 谢梦晓. 江苏大学, 2016(08)
- [4]SOCS1基因修饰的骨髓树突状细胞对同种移植排斥的治疗作用及其机理[D]. 宋少华. 第二军医大学, 2010(10)
- [5]肿瘤细胞裂解物—结核分枝杆菌热休克蛋白65的抗肺癌作用[D]. 董博翰. 吉林大学, 2009(08)
- [6]尼古丁刺激DCs抗肿瘤机制及肿瘤微环境DCs失能研究[D]. 高丰光. 上海交通大学, 2008(12)
- [7]小鼠肝素酶H-2K～b限制性CTL表位的预测、鉴定及其体内抗肿瘤免疫效应研究[D]. 汤旭东. 第三军医大学, 2007(03)
- [8]低剂量电离辐射诱导免疫适应性反应的DNA修复机制[D]. 程光惠. 吉林大学, 2007(03)
- [9]树突状细胞介导肝癌免疫治疗的实验与临床研究[D]. 罗小玲. 广西医科大学, 2006(02)
- [10]EB病毒潜伏膜蛋白2A转染树突状细胞诱导特异性CTL杀伤鼻咽癌的体外、体内研究[D]. 徐洁洁. 南京医科大学, 2006(12)