一、草鱼“肠炎型”出血病的防治措施（论文文献综述）
张可[1]（2021）在《一株新型草鱼呼肠孤病毒的分离鉴定及其RPA-LFD检测方法的建立》文中指出草鱼（Grass carp,Ctenopharyngodon idella）是一种重要的淡水养殖鱼类,在我国广泛养殖。然而,草鱼易患多种疾病,尤其是由ds RNA组成的草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus,GCRV）引起的草鱼出血病（grass carp haemorrhagic disease,GCHD）影响最为严重。草鱼出血病主要危害当年鱼种或鱼苗,具有流行季节长,死亡率高等特点,对我国草鱼养殖行业造成巨大损失。截止目前,我国研究人员已经分离鉴定了50多株病毒,根据基因组序列的差异,可分为三种基因型:以GCRV-873毒株为代表的GCRV-Ⅰ型、GCRV-HZ08毒株为代表的GCRV-Ⅱ型和HGDRV毒株为代表的GCRV-Ⅲ型。不同基因型毒株的序列差异较大,其核苷酸的相似性一般低于50%;针对GCRV进行流行病学的调查表明,除了有各基因型毒株的单独感染外,还存在不同基因型毒株之间的混合感染。因此,不同基因型新毒株的基因组解析及其快速诊断方法的建立,对于草鱼出血病的及早发现和有效防控具有重要的意义。本文从监测的湖北草鱼样本中发现一株健康草鱼携带的新型草鱼呼肠孤病毒,暂命名为HGCRV（healthy grass carp reovirus）。针对该毒株开展了细胞培养、电镜观察、理化性质分析、SDS-PAGE带型分析、全基因组测序和序列比对分析,并通过构建载体建立标准曲线,利用RT-q PCR分析了该病毒在鱼体不同组织和不同细胞系中的动态增殖情况。此外,我们还利用重组酶聚合酶等温扩增技术（RPA）结合胶体金试纸条建立了新毒株的可视化快速检测方法,本研究为草鱼呼肠孤病毒的分子流行病学、遗传多样性分析以及草鱼出血病的快速诊断奠定了基础。主要研究结果如下:1.HGCRV毒株的分离鉴定及全基因组分析通过Illumina测序和RACE扩增技术,拼接得到该毒株的全基因组序列。结果表明:HGCRV的全基因组包含11个ds RNA,共编码12个蛋白。核苷酸总长度为23688 bp,G+C含量为57.2 mo1%,5’和3’末端具有保守基序（5’-GUUAUU……UCAUC-3’）。对其氨基酸分析表明,HGCRV与GCRV-873为代表的GCRV-I型毒株蛋白序列具有较高的同源性（69.57～96.71%）,而与GCRV-II型（GCRV-HZ08）和GCRV-III型（HGDRV）毒株的同源性相对较低,分别为22.65～45.85%和23.37～43.39%。基于Rd Rp蛋白的系统发育分析表明,HGCRV与水生呼肠孤病毒聚集在一个分支。并且该毒株与Aq RV-C种属亲缘关系较近,表明该毒株可能属于Aq RV-C。同时基于26株国内GCRV分离株VP6氨基酸序列构建的进化树显示,我国草鱼呼肠孤病毒毒株可明显的分为三个基因簇。相比于其他簇,HGCRV与GCRV-873株为代表的GCRV-I型分离株的关系更近,因此该分离株可能属于GCRV-Ⅰ型。2.HGCRV的体内体外增殖特性分析以102拷贝/μL的病毒稀释液分别接种于GCO、CIK、L8824、EPC和Gi CB细胞,结果显示:GCO、CIK、L8824、EPC和Gi CB五种细胞中均可以出现细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）。并且不同细胞对HGCRV的敏感性不同。根据其出现病变效应的时间,表明Gi CB和L8824细胞出现病变最早且最快。选取不同时间点的细胞收集样品对其定量分析表明,HGCRV在GCO、CIK、L8824、EPC和Gi CB细胞株中均能增殖,其中以L8824细胞和Gi CB细胞中的增殖量最高,病毒拷贝数可分别达到7.5×104拷贝/μL和6.4×104拷贝/μL。接种24h后,病毒在所有细胞中均开始明显增殖,其中在L8824、CIK和EPC细胞中,接种后72 h病毒增殖量达到最高,Gi CB和GCO细胞在接种后96 h病毒增殖量最高。HGCRV感染健康草鱼后,检测结果表明该病毒可以在其肝、肾、脾组织中增殖,且病毒拷贝数在肝、脾和肾脏组织中病毒RNA含量均表现出先升高后降低的趋势。在感染后3d,脾脏和肾脏中的病毒RNA含量达到最高,而肝脏在感染后4d达到峰值。3.针对HGCRV的RPA-LFD检测方法的建立针对HGCRV VP6基因片段设计RPA引物和探针,并对其反应条件进行优化,建立了针对HGCRV的RPA-LFD检测方法。温度优化结果表明,该方法的最佳反应温度为38℃。通过对该方法特异性检测,结果显示只有HGCRV检测出了阳性结果,而在GCRV-106、HGDRV、SVCV、Cre RV以及Cy HV-2等水生动物病毒样本和阴性模板样本中均未观察到阳性信号,表明该检测方法特异性较高。灵敏度分析表明,该方法的最低检测限为101copies/μL。选取102copies/μL和103copies/μL的质粒模板对其重复性验证,均可检出阳性信号,表明该检测方法的结果具有较高的可靠性。
母昌勇[2]（2020）在《基于杆状病毒表达系统的Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗制备及免疫效果评价》文中进行了进一步梳理草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国淡水养殖的主要品种之一,具有重要的经济价值。但是由草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus,GCRV）引起的草鱼出血病死亡率极高,给草鱼养殖业造成巨大的损失。GCRV基因组由11条分节段的双链RNA组成,编码11-12个蛋白,其中病毒的外衣壳蛋白由于具有较好的免疫原性,常作为亚单位疫苗制备的抗原蛋白。本论文以Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒分离株GCRV106为研究对象,基于杆状病毒表达系统制备了该病毒外衣壳蛋白VP35和VP4的亚单位疫苗,并通过注射和口服两种免疫方式对疫苗的免疫保护效果进行评价。主要研究结果如下:1.重组蛋白的表达及其对稀有鮈鲫的免疫保护效果研究（1）以GCRV 106病毒基因组为模板,通过PCR扩增获得VP35、VP4和VP35-VP4蛋白基因。利用杆状病毒表达系统构建供体质粒p Fast Bac-VP35、p Fast Bac-VP4和p Fast Bac-VP35-VP4并在SF9细胞中表达融合蛋白VP35和VP4。Ni柱亲和层析纯化重组蛋白VP35、VP4和VP35-VP4后,BCA测定浓度分别为0.4 mg/m L、0.3 mg/m L和0.3 mg/m L。以每尾3μg蛋白腹腔注射免疫稀有鲫。（2）实时荧光定量PCR检测免疫相关基因的表达。结果表明免疫组VP35、VP4和VP35-VP4中的Ig M、TNF-α、My D88、NF-Kb、IL-1β、Mx和TLR3的表达水平在免疫后不同时间点在肝、脾和肾中都有不同程度的上调,且三个免疫组变化趋势相同。与对照组相比,IL-1β和TLR3在脾脏和肾脏的表达量在第3 d显着上调并达到峰值,上调2-6倍（P<0.01）。肝脏和脾脏中Mx的相对表达量在第3 d开始上调,在第5 d达到最高值,上调3-6倍（P<0.01）。NF-k B和TNF-α在肝脏、脾脏和肾脏中在第14 d达到峰值,上调4-9倍（P<0.01）。Ig M第7 d开始上调,并在第21 d达到峰值,在肝脏、脾脏和肾脏中分别上调8-20倍（P<0.01）。（3）免疫后21 d攻毒,结果表明重组蛋白r VP35、r VP4和r VP35-VP4均可不同程度保护稀有鲫免受GCRV的感染,免疫保护率分别为33%、60%和67%。2.口服疫苗的制备及其对草鱼的免疫保护效果研究（1）利用Bac-to-Bac家蚕杆状病毒表达系统在Bm E细胞和5龄家蚕中表达重组蛋白r VP35-VP4。收集感染r Bm Bac-VP35-VP4 120 h后的5龄家蚕,真空冷冻干燥成冻干粉,以5%的比例添加到饲料中口服免疫草鱼。（2）红白细胞计数结果表明在免疫后第14、21和28 d,免疫组草鱼外周血中的白细胞的数量与对照组相比增加了1.4-1.7倍（P<0.05）。白细胞分类计数结果表明在免疫后第14 d,白细胞中的中性粒细胞和单核细胞的百分比增加并且显着高于对照组（19.82±1.18%,10.12±1.18%）（P<0.05）,随后在28 d下降,但此时在白细胞中淋巴细胞的百分比显着增加（93.14±0.82%）（P<0.05）。ELISA的实验结果表明,免疫组的Ig M抗体滴度在免疫后两周显着升高,在第28 d达到最高水平,OD450为0.71±0.04（P<0.01）)。实时荧光定量PCR检测结果表明,免疫相关基因IFN I、TLR22、IL-1β、MHC I、Mx和Ig M的表达水平在口服免疫草鱼后不同时间点显着上调。与对照组相比,肝脏和脾脏中的IFN I在免疫后21 d开始上调并达到峰值,分别上调2.2倍（p<0.05）和2.8倍（p<0.01）。脾脏中的IL-1β和MHCⅠ在第21 d开始上调并达到峰值,分别上调2.8倍（P<0.01）和2.2倍（P<0.05）。肝脏和后肠中的Ig M第14 d开始上调,在21 d达到最高值,分别上调3.1倍（P<0.01）和6.5倍（P<0.01）,而在肾脏和脾脏中,分别在第14 d和21 d时开始上调,在28d时达到峰值,上调9倍（p<0.01）和6.8倍（p<0.01）。（3）攻毒试验结果表明,口服家蚕冻干粉疫苗的草鱼免疫保护率为56%,显着高于对照组的4%（P<0.01）。以上结果表明口服家蚕冻干粉疫苗的草鱼可被诱导产生免疫应答,并有效保护草鱼免受GCRV的感染,该研究为GCRV口服亚单位疫苗的研制奠定基础。
郭志文[3]（2019）在《探究草鱼病害防控方略》文中指出近几年来,池养草鱼病害频发、治疗难、死亡率高一直困扰着广大养殖户,尤其是在季节交替的"桑尖瘟期"（4-6月）与"白露关"（7-9月）常引起集约化养殖的草鱼发生大量死亡。笔者总结认为草鱼疾病的发生呈现季节性强、病程长、易反复等
郝凯[4]（2017）在《利用大肠杆菌构建GCRV基因工程疫苗系统研究》文中研究指明草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）引起的草鱼出血病（Grass carp hemorrhage）是严重危害草鱼的传染性疾病。但是,草鱼出血病的有效防控仍然存在挑战。疫苗免疫是预防草鱼出血病的有效途径。核酸疫苗具有制备简单、安全性高和免疫应答有效持久等优点,但是作为一种外源物质,易被组织降解、清除,导致其不能长期稳定的发挥免疫效应。在本研究中借助细菌菌蜕技术,以大肠杆菌DH5α为载体,制备了大肠杆菌菌蜕载GCRV vp7核酸疫苗,以提高核酸疫苗的免疫效果为目的,评价菌蜕介导的核酸疫苗对草鱼出血病的防控效果。细菌表面展示疫苗因其具有良好的免疫应答效果使之在疫苗开发中具有优势。本研究借助细菌表面展示技术开发了大肠杆菌表面展示GCRV VP7蛋白疫苗;进一步分别构建了大肠杆菌BL21（DE3）载嗜水气单胞菌外膜A蛋白（Outer membrane protein A,OmpA）、主要黏附素蛋白（Major adhesin,Mah）与VP7蛋白共展示疫苗,以期通过浸浴免疫达到注射免疫抗病效果,对共展示疫苗浸浴特性及其机制进行了初步研究。取得结果如下:1.通过基因重组技术构建了pCAT-lysisE/SNA/Smap29温控裂解质粒,变温诱导表达,成功制备大肠杆菌DH5α菌蜕（DH5α-BG）。溶菌动力学试验结果显示:温度诱导质粒表达4 h后,大肠杆菌的裂解效率就达到了99%。扫描电镜观察结果显示绝大部分菌体经诱导形成菌蜕,中间和两极部位出现跨膜孔道。利用菌蜕形成的跨膜孔道,采用扩散法将GCRV vp7核酸疫苗（pcDNA-vp7）装载入菌蜕内,制备了大肠杆菌DH5α菌蜕载核酸疫苗（DH5α-BG/pcDNA-vp7）。肌肉注射DH5α-BG/pcDNA-vp7疫苗免疫草鱼（1.8-2.0 g）,结果显示:DH5α-BG/pcDNA-vp7疫苗可显着提高血清抗VP7蛋白特异性抗体的产生水平（P<0.05）,提高核酸疫苗在草鱼组织中的保留和表达时间,提高酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和总抗氧化能力（T-AOC）活性和免疫相关基因（TNF-α、IL-1β、IgM、MHCI和IgD）的表达水平（P<0.05）。免疫草鱼GCRV攻毒后,DH5α-BG/pcDNA-vp7疫苗组（5μg/尾）免疫保护率达到90%,显着高于相同剂量下纯pcDNA-vp7疫苗组（RPS=42.22%）（P<0.01）,上述结果表明菌蜕介导的vp7核酸疫苗能够在低剂量下实现对草鱼的免疫保护。2.通过基因重组技术构建了冰晶核蛋白N端结构域（InpN）和GCRV外衣壳蛋白vp7融合表达的pET28a-InpN/vp7质粒。重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后,Western blot检测到预期大小的目的蛋白条带,细胞组分检测发现目的蛋白定位于外层膜上,免疫荧光观察到重组菌的表面有特异性的绿色荧光信号。将大肠杆菌BL21（DE3）表面展示VP7蛋白疫苗（BL21/InpN/vp7）经腹腔注射和浸浴的方式免疫草鱼（2.7-3.0 g）,结果显示:疫苗注射免疫草鱼7到21 d,血清特异性抗VP7蛋白抗体产生水平,ACP、AKP和T-AOC活性以及免疫相关基因（TNF-α、IL-1β、IgM和MHCI）的表达水平均出现显着性的上升（20-10μg VP7蛋白/尾鱼,P<0.01）,并且存在疫苗注射剂量依赖效应,而疫苗浸浴免疫草鱼后,并不能有效的刺激上述免疫相关指标的上升。免疫草鱼GCRV攻毒后,疫苗注射免疫最高剂量组（20μg VP7蛋白/尾鱼）免疫保护率达到88.89%,而在疫苗浸浴免疫最高浓度组(20 mg L-1VP7蛋白)免疫保护率仅有18.89%。上述结果表明大肠杆菌BL21（DE3）表面展示VP7蛋白疫苗可以通过注射方式刺激草鱼产生强烈免疫应答反应,高效的保护草鱼对抗GCRV的感染。3.在pET28a-InpN/vp7质粒上分别插入了嗜水气单胞菌外膜蛋白中的外膜A蛋白基因（OmpA）和主要黏附素蛋白基因（Mah）,分别构建了含有pET28a-InpN/vp7-OmpA和pET28a-InpN/vp7-Mah质粒的大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导制备了大肠杆菌BL21（DE3）表面共展示vp7-OmpA和vp7-Mah蛋白疫苗（BL21/InpN/vp7-OmpA和BL21/InpN/vp7-Mah）。将2种疫苗经浸浴免疫草鱼,结果显示:草鱼免疫7到21 d,共展示vp7-Mah蛋白疫苗(20-10 mg L-1 VP7蛋白)能够显着提高血清特异性抗VP7蛋白抗体产生水平（P<0.01）,显着提高ACP、AKP和T-AOC活性以及免疫相关基因（TNF-α、IL-1β、IgM和MHCI）的表达水平（P<0.01）,并且存在疫苗浓度依赖效应;而共展示vp7-OmpA蛋白疫苗并不能有效的刺激上述免疫相关指标的上升。将2种疫苗经注射免疫草鱼,结果显示:草鱼免疫7到21 d,2种疫苗（20-10μg VP7蛋白/尾鱼）均能够显着诱导上述免疫相关指标的上升（P<0.01）。免疫草鱼GCRV攻毒结果显示:在20 mg L-1 VP7蛋白浓度下,表面共展示vp7-Mah蛋白疫苗浸浴免疫保护率达到51.11%,而表面共展示vp7-OmpA蛋白疫苗浸浴免疫保护率仅有20%。表面共展示vp7-OmpA和vp7-Mah蛋白疫苗注射免疫保护率分别达到82.22%和91.11%（20μg VP7蛋白/尾鱼）。上述结果表明在大肠杆菌表面展示VP7蛋白疫苗上锚定Mah蛋白后,疫苗能经浸浴方式刺激草鱼产生强烈免疫应答反应,有效的保护草鱼对抗GCRV的感染。4.以鲤上皮瘤细胞（EPC）为模型,采用细胞裂解计数法研究了BL21/InpN/vp7-Mah对EPC细胞的粘附和侵染性,我们发现Mah蛋白的表面展示能够显着提高大肠杆菌的粘附和侵染能力。囊泡介导的胞吞在BL21/InpN/vp7-Mah内化过程发挥主要作用。通过荧光显像和流式细胞术研究了BL21/InpN/vp7-Mah内化与微丝变化的关系,结果发现BL21/InpN/vp7-Mah内化过程可以引起细胞内微丝的重排以及聚合组装。微丝聚合抑制剂预处理细胞能够明显抑制BL21/InpN/vp7-Mah的内化,这些结果表明BL21/InpN/vp7-Mah的内化过程依赖微丝的重排和聚合。利用Western blot技术研究了BL21/InpN/vp7-Mah内化过程对具有微丝调控功能的p38-HSP27通路中p38激酶和HSP27磷酸化的影响,结果发现BL21/InpN/vp7-Mah内化过程能够明显促进p38激酶和HSP27发生磷酸化。之后,使用p38激酶抑制剂预处理细胞后,BL21/InpN/vp7-Mah的内化受到抑制,这些结果表明具有调控微丝功能的p38-HSP27通路的激活在BL21/InpN/vp7-Mah侵染EPC细胞过程中起到了一定作用。综上所示,菌蜕作为GCRV vp7核酸疫苗递送载体可以提高核酸疫苗在草鱼组织中的保留和表达时间,提高草鱼特异性抗体的产生水平和免疫应答水平,实现草鱼高效免疫保护。大肠杆菌BL21（DE3）表面展示VP7蛋白疫苗能通过注射方式实现对草鱼的高效免疫保护。进一步,利用表面展示技术锚定Mah蛋白后,大肠杆菌BL21（DE3）表面共展示vp7-Mah蛋白疫苗经浸浴方式提高了对草鱼的免疫保护,有效抵抗GCRV感染,这可能与Mah蛋白能够提高大肠杆菌BL21（DE3）的侵袭力有关。以上研究结果为预防草鱼出血病疫苗的开发提供了参考资料和新的思路。
曾伟伟[5]（2017）在《草鱼呼肠孤病毒分子流行病学、全基因组序列及流行株灭活疫苗研究》文中研究表明由草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus,GCRV）引起的草鱼出血病给我国草鱼养殖造成了巨大的经济损失,GCRV是我国第一个分离到的水生呼肠孤病毒,也是水生呼肠孤病毒中毒力最强,危害最大的病原,GCRV的基因组是分11个节段的双链RNA病毒,变异迅速和复杂的病原学及缺乏有效的防控措施是导致其广泛、快速、持续的流行主要原因。疫苗免疫是当前防治草鱼出血病最为有效的措施,但GCRV病原学复杂,毒株类型众多,各地流行株型不清楚,疫苗的研制和应用均没有针对性,导致免疫失败的现象时常发生。开展草鱼呼肠孤病毒的分子流行病学调查,弄清不同地区草鱼呼肠孤病毒的流行病学情况,根据不同地域的流行毒株,研制有针对性的适合不同区域使用的疫苗是当前草鱼出血病防控的关键。GCRV的基因组经聚丙烯酰胺凝胶电泳呈现特定电泳带型,电泳带型和与其基因分型、基因组特征之间存在密切关系,因此,对不同电泳带型的GCRV代表株进行全基因组序列分析,对深入了解GCRV遗传变异历程和强、弱毒株的分子差异具有重要意义。因此,本研究的主要内容包括以下3个方面:（1）草鱼呼肠孤病毒分子流行病学调查采用三重RT-PCR分型检测技术对2011至2016年6年时间采集自江西、广东、广西、山西、山东、湖南,湖北、重庆、天津等18个省市各地的未发病草鱼样品2274份和疑似草鱼出血病样品366份样品进行GCRV分型检测,并对各毒株的S7基因进行序列和遗传进化分析,系统比较GCRV各分离株的分子流行病学特征、地域和时间分布差异及遗传进化关系,建立我国草鱼出血病分子流行病学数据库。结果显示,未发病草鱼样品共检测到65份阳性,总阳性率为2.9%,其中I型和I,II型混合感染各2份,II型61份,占整个阳性样品的93.8%,未检测到III型GCRV;疑似草鱼出血病样品检测到146份阳性,总阳性率为40%,其中I型8份,占总阳性样品的5.5%,II型131份,占总阳性样品的89.7%;I,II型混合感染5份,III型2份。可见,GCRV II型是我国当前主要流行基因型。各分离株S7节段序列分析发现,I、II和III型GCRV各分离株S7节段核苷酸和氨基酸序列的同源性分别在90%至99%、95%至100%和99%以上,基于S7基因节段构建的遗传进化树表明我国的GCRV总体上可以分为3个基因型,其中GCRV II型又可以分为不同的亚型,且GCRV不同分离株遗传进化树没有明显的时间和地域分布规律。（2）不同电泳带型GCRV全基因组序列分析对21株GCRV新分离株的基因组进行SDS-PAGE电泳带型分析,然后对电泳带型有差异的5株代表株进行全基因组测序,并同其它已知的GCRV进行基因组序列和特征比较,分析不同分离株各节段的核苷酸和氨基酸序列同源性及遗传进化关系。结果表明,21株GCRV分离株的SDS-PAGE电泳带型共分为3大类,带型相似同一大类的一些分离株带型也存在一定的差异。对不同带型的分离株全基因组序列分析发现,基因组带型不同类的分离株其核苷酸和氨基酸序列的同源性均小于50%,而基因组带型相似只是分布位置有微小差异的不同分离株,其核苷酸和氨基酸序列的同源性均在90%以上,且带型差异越大,序列的同源性和基因组特征差异也越大。基因组特征分析表明,3’和5’末端保守序列、非编码区长度、倒置重复序列及一些特殊结构均与基因组带型有关,带型相似的不同分离株之间的这些特征都相似,反之则差异较大。进一步分析发现,各分离株之间的基因带型差异、序列差异、基因组特征差异等,与分离的地域和时间没有明显相关性。系统进化分析表明,基于不同分离株的11节段的核苷酸和氨基酸序列构建的遗传进化树存均聚为3大类,说明目前我国的GCRV共有3个基因型。（3）GCRV流行株型灭活疫苗研究分子流行病学调查结果显示,GCRV II型是当前导致草鱼出血病流行与爆发的主要病原,开展GCRVII型疫苗研制对草鱼出血病的防控具有至关重要的意义。本研究以流行的GCRV II型新分离株GCRV-HuNan1307为研究对象,首先采用PSF细胞大量扩增该病毒,并用不同灭活剂和灭活温度对该病毒的灭活效果及灭活后疫苗的免疫效果进行评价,筛选出最佳灭活条件,制备HuNan1307株灭活疫苗;其次是以HuNan1307灭活疫苗腹腔注射免疫草鱼,然后通过监测免疫草鱼体内的特异性抗体、中和抗体、6个免疫相关基因的相对表达量及对强毒攻击的保护效果来评价该灭活疫苗的最低免疫保护剂量及免疫效果。结果显示,GCRV-HuNan1307用0.1%的β-丙内酯溶液在4℃环境下对病毒灭活60h效果最佳,该灭活疫苗的最低免疫保护剂量是105.5 TCID50/0.2m L。所有免疫该灭活疫苗的草鱼都产生了较高的血清抗体滴度和针对GCRV的特异性中和抗体。此外,免疫草鱼的脾和头肾中6个免疫相关的基因表达明显增强,对强毒的攻毒保护率达到80%,保护期可持续一年。该研究成功地研制了II型GCRV灭活疫苗,为草鱼养殖过程中针对GCRV流行强毒株的感染提供有效的候选疫苗制剂。总之,本研究建立了我国草鱼呼肠孤病毒的分子流行病学数据库、明确了GCRV分型分布情况、分析和比较了不同分离株的基因组带型及不同带型分离株的全基因组序列差异,研制了GCRV流行株型的灭活疫苗。本研究不仅为草鱼出血病病原学的深入研究和精准防控产品的开发提供了理论依据,也为草鱼出血病的具体防控储备了候选产品。
余小波[6]（2017）在《盐酸吗啉胍抗草鱼呼肠孤病毒研究》文中认为草鱼养殖作为我国养殖产量最高的渔业产业为满足人类的蛋白食品需求提供了重要保障,但是长期以来的高密度养殖方式造成了草鱼出血病的频繁暴发并引起巨大的经济损失。目前草鱼出血病的疫苗防治研究虽取得了较大进展,但草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）频繁变异和疫苗商业化大规模应用瓶颈制约了病害防治研究应用进程,采用药物进行防治目前尚为大规模防治草鱼出血病的最为直接有效的途径。因此,抗病毒药物开发以及相关机制研究在草鱼出血病防治领域显得尤为重要。盐酸吗啉胍（Moroxydine hydrochloride,Mor）作为双胍结构药物因缺乏确切的药理学和毒理学研究证据在1999年被国家宣布停用,该药物一直以来未受重视。本研究前期发现Mor具有良好的抗GCRV活性,因此在对其进行安全性进行检测前提下,进一步对Mor的抗病毒和抗细胞凋亡等机制进行研究。取得结果如下:1.Mor体外抗GCRV活性研究通过借助体外抗病毒药物筛选模型,发现Mor对四株水产病毒感染下的体外培养细胞起到了不同程度的保护作用,尤其是在100μg mL-1的初筛试验中实现了对感染两株GCRV病毒的草鱼肾细胞（CIK）100%的保护;通过体外毒性试验得出Mor对CIK和GCO细胞的安全浓度分别是218.5±9.5μg mL-1和140.9±25.7μg mL-1。此外,高效液相色谱检测药物含量发现在4 h内Mor在每106个细胞中的含量迅速达到最高水平的16.7±0.6μg,表现出良好的代谢特性。选取高毒力的GCRV104为试验材料,通过进一步在CIK和草鱼卵巢细胞（GCO）中进行药物抗病毒梯度试验,结果发现Mor在39.8μg mL-1的浓度处理下能保证超过90%的细胞活力,并阻止了细胞病变效应的产生,其效果好于相同浓度的三氮唑核苷（Rib）对照组;通过进一步的试验得出在20μg mL-1的Mor处理72 h后能够使CIK和GCO细胞内病毒的滴定度分别降低7.7和5.7个自然指数级;同时抑制了各病毒基因在两种细胞内的表达,并呈现出一定的时间依赖效应;进一步的Western-blot检测结果验证了Mor的抗GCRV活性,表现出了较高的体外抗GCRV活性和对宿主细胞的安全性。2.Mor在体抗GCRV研究首先通过药物对草鱼的急性毒性试验发现,当Mor在1000μg mL-1浓度范围内对草鱼无毒性,表现出对草鱼良好的安全性。再以草鱼仔鱼的人工注射感染GCRV为基础,通过Mor的浸泡和注射处理对草鱼体内抗病毒作用进行研究,结果表明:GCRV病毒在感染后在组织内繁殖和并对草鱼造成机体氧化损伤,并在7 d后达到56.7%的死亡;而经Mor注射处理7 d后在肾脏、肝脏、鳃和肌肉中的病毒VP3和VP6的相对表达值均低于0.07,其抗病毒效果明显好于药物浸泡处理组;同时避免了血清超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和总抗氧化能力（T-AOC）活性的下降,在药物治疗的7d内无非正常死亡现象的发生。3.Mor抑制GCRV蛋白表达利用真核载体构建将GCRV VP6成功连入pIRES2-AcGFP1真核表达质粒中,并转染进入CIK细胞中进行蛋白表达,借助细胞活力检测和流式细胞检测发现重组质粒pIRES2-AcGFP1-VP6转染细胞48 h内不会引起明显的凋亡效应,细胞保持正常的活力;荧光显像技术检测发现质粒转染细胞48 h后显着表达,在经Mor处理后细胞内蛋白表达受到明显抑制,荧光表达强度显着降低,仅在细胞内局部位置显现;经实时荧光定量PCR测定表明,pIRES2-AcGFP1-VP6转染CIK细胞后72 h内VP6的表达逐步上调,相对病毒感染对照组其相对表达值达到0.59,但经20μg mL-1的Mor处理后VP6在细胞内的表达显着下调,相对表达值降至0.14,体现出药物对该病毒蛋白良好的抑制作用。4.Mor抗CIK细胞凋亡机制研究通过荧光显像、扫描透射电镜观察和DNA电泳等多种方式对细胞凋亡进行研究,发现GCRV感染48 h内宿主细胞产生一系列的细胞凋亡特征,包括细胞核质的融解消失、DNA片段化、细胞形态皱缩断裂、细胞内GCRV病毒粒子增殖复制、细胞包涵体空洞产生以及细胞破裂释放病毒等多种变化,进而导致严重的细胞凋亡。而凋亡抑制剂试验结果初步表明GCRV感染后CIK细胞经Caspase途径导致细胞凋亡,进一步利用Western-blot试验发现病毒感染导致了caspase-9和下游caspase-3的激活,其上游Bax促凋亡蛋白和Bcl-2凋亡抑制蛋白的表达也分别出现了相应的上调和下调,表明GCRV病毒感染后激活了细胞线粒体凋亡通路,进而导致凋亡的发生。在对细胞凋亡检测的同时,通过Mor处理后的细胞有效阻止了各凋亡现象的发生,并有效阻止了线粒体凋亡通路的启动,实现对细胞的保护作用。5.Mor对宿主免疫反应的影响通过对宿主免疫相关基因的检测,发现GCRV感染后会迅速引起宿主细胞内免疫相关基因Myd88、Mx1、IL-1β、IL-8、I-IFN和TNFα表达的普遍上调,而在药物处理下显着降低了病毒诱导的细胞免疫反应;进一步地对人工染毒草鱼组织的免疫相关基因进行检测,发现注射GCRV之后草鱼机体出现明显的免疫刺激反应,同样地,当Mor药物注射治疗能够显着抑制各组织内免疫相关基因IFN-I、IL-1β和TNF-α的上调。综上所述:Mor能够通过直接的抗病毒作用抑制GCRV病毒的增殖,同时阻止细胞凋亡信号的启动,对宿主保持正常的生理状态具有重要意义,实现了良好的体内外抗病毒效果,在草鱼出血病药物防治中具有较大的应用前景。
田飞焱,曾伟伟,张晓燕,徐节华,谢世红,花麒,刘文珍,银旭红,孟霞,刘彬,欧阳敏[7]（2016）在《2016年江西地区草鱼呼肠孤病毒（GCRV）分子流行病学分析》文中研究表明应用三重RT-PCR检测方法对2016年采自江西地区重要的水产养殖（苗种）场的50批草鱼样品和10份疑似草鱼出血病病例进行GCRV检测。结果显示,50批草鱼样品检出GCRV-Ⅱ型阳性样本5批,阳性检出率为10%;10份临床疑似病例检出GCRV-Ⅱ阳性样本6份,阳性检出率为60%,表明我省养殖的草鱼成鱼和草鱼苗种均携带有草鱼呼肠孤病毒（GCRV）,且阳性率较高,需加强苗种的引种检疫;当前我省草鱼主养区域草鱼出血病的流行株主要以基因Ⅱ型为主,这对我省进行草鱼出血病精准免疫预防有很强的指导意义。
曾伟伟,王庆,王英英,李莹莹,郝贵杰,石存斌,沈锦玉[8]（2017）在《草鱼呼肠孤病毒HZ08株抗体IPMA检测方法的建立及应用》文中研究说明为建立一种检测草鱼呼肠孤病毒HZ08株（HZ08）抗体的免疫学方法,本实验以接种HZ08病毒的细胞培养板为抗原板,以免疫弱毒疫苗的草鱼血清为抗体,通过反应条件优化,建立了检测GCRV HZ08血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞实验（IPMA）方法,并对该方法特异性、敏感性、重复性、与ELISA检测结果的符合率及对临床血清样品的检测效果等进行了验证。结果显示,HZ08株种毒按照1×103拷贝/μL浓度接种后72h固定,HRP-Ig G二抗1∶1000稀释,待检血清1∶100稀释时效果最佳;该IPMA方法与草鱼阴性血清、免疫细菌三联疫苗的草鱼血清、感染GCRV JX0901（GCRVⅠ型）的草鱼血清无交叉反应;GCRV HZ08株阳性血清稀释至1∶800时仍能检出;批内和批间重复性实验显示,该方法具有良好的重复性;符合性实验结果显示,该IPMA方法与ELSIA方法的阳性和阴性符合率分别为95.7%和87.5%;用建立的IPMA方法检测草鱼出血病弱毒疫苗免疫草鱼,免疫2周后抗体水平达到峰值;对现地送检的126份草鱼血清样本进行检测,平均检出阳性率为72.2%。研究表明,建立的HZ08株IPMA方法特异性强、重复性好、敏感性高,为GCRVⅡ型的流行病学调查、疫苗免疫效果评价及抗原抗体检测提供了一种有效的检测手段。
李贤[9]（2016）在《草鱼呼肠孤病毒GZ1208株的分离、鉴定及全基因组序列分析》文中指出草鱼呼肠孤病毒（Grass Crap Reovirus,GCRV）是水生呼肠孤病毒属中毒力最强、我国淡水鱼养殖业危害最大的一种病毒,该病毒能引起草鱼发生出血病导致大量死亡而给我国的草鱼养殖业造成非常大的经济损失。病原学复杂、毒株变异大、缺少针对性防控措施是导致该疫病持续流行的主要原因。至今,已报道的分离株有30多株,各分离株在细胞培养特性、毒力、基因组带型、基因序列等各方面均存在较大的不同。2012年8月,广州白云区某草鱼养殖场疑似发生出草鱼出血病疫情,患病草鱼主要临床症状为肠道出血严重,肠炎症状明显,鳃充血呈红色,其它部位症状不明显。采集病鱼的肠道、肝脏、脾脏和肾脏组织,剪碎研磨制备组织匀浆液接种草鱼吻端成纤维细胞（Proboscis Snout into Fibers,PSF）细胞进行病毒分离,盲传至第二代开始出现致细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE）。用感染病毒的PSF细胞制备电镜负染切片,电镜下观察到呈六边形,无囊膜,大小约70nm呈晶格状排列的病毒粒子。同时通过采用三重RT-PCR检测方法对采集的组织和接毒后的PSF细胞培养液进行病毒检测,在肠、肝、脾、肾脏及细胞培养液中均扩增出约500bp左右的单一条带,组织中以肠道的条带最明显。对RT-PCR检测结果为阳性的产物进行测序,测序结果进行BLAST比对,结果显示,与GCRV 873株和GSRV的核苷酸序列相似性分别为93%和92%。将PSF细胞增殖后的病毒液超速离心进行浓缩,提取浓缩后的GCRV基因组,进行SDS-PAGE电泳带型分析,结果发现,新分离毒株11个条带,和I型的873毒株的带型比较接近,只是3个大片段存在差异。结合临床症状、细胞感染实验、电镜观察、RT-PCR检测结果、基因序列同源性、全基因组SDS-PAGE电泳带型,初步鉴定分离到的毒株为一株新的草鱼呼肠孤病毒,暂时把它命名为GCRV GZ1208。将Z1208种毒接种PSF细胞,采用TCID50测定方法来测定该分离株接种PSF细胞后的病毒滴度,结果为10-8.5/0.1mL。用浓度为10-3.5/0.1mL TCID50的病毒液感染稀有鮈鲫和一月龄草鱼进行回归感染试验,回归感染2周后未死亡的鱼,以不同基因型的强度毒株攻毒,进行交叉免疫保护试验。回归感染试验表明,稀有鮈鲫和草鱼感染GZ1208毒株后感染率均为100%,但死亡率分别为43.3%和35%;交叉免疫保护试验表明,GZ1208毒株对II型强毒株HuNan1307没有免疫保护效果,但对I型毒株JX-01有较好的保护效果。参考GCRV其它分离株基因组序列设计引物,RT-PCR扩增和克隆了GZ1208毒株的全部基因节段,并测定了其全全因组序列。GZ1208基因组全长为23.696Kb,S1至S11节段的大小分别为3949bp、3877bp、3702bp、2320bp、2239bp、2039bp、1414bp、1297bp、1130bp、909bp、820bp。用DNAStar、ORF Finder软件和GenBank数据库对测定的全基因组序列进行基因组特征、编码氨基酸、同源性等进行分析,并基于各个节段编码的多肽序列制作系统发育树。结果表明,GZ1208基因组各节段在末端均有保守序列,大部分节段的都是5’GUUAUUU…UUCAUC3’。GZ1208各节段核苷酸序列与104毒株（III型）相应节段的相似性在32.4%至50.6%之间,与HZ08（II型）毒株的相似性为38.4%至52.8%之间,与AGCRV的相似性在52.3%至69.1%之间,与873（I型）毒株的相似性在90.7%至98.3%之间,与GSRV的相似性在91.5%至99.2%之间。基于各个节段基因编码的多肽序列建立的系统进化树表明,GZ1208株与873株和GSRV聚为同一支。序列同源性比较显示,GZ1208株S5节段与873株的S5同源性较高,而与GSRV则相对较低,而在S9节段与GSRV核苷酸序列的同源性显着高于GCRV 873,这个现象表明,该分离株可能是不同毒株通过重配形成的一个新分离株。综上所述,GZ1208为一株草鱼呼肠孤病毒新分离株,与873株同属I型GCRV。其基因组带型和基因组特征与I型的代表株GCRV 873和GSRV相似性最高,核苷酸和多肽序列相似性比较结果显示,GZ1208一些节段与873株相似性最高,而另一些节段与GSRV的相似性最高,推断新分离的GZ1208毒株可能是不同毒株之间通过重配形成的新毒株,该研究不但丰富了GCRV病毒库和全基因组序列数据库,而且也为GCRV遗传变异规律的研究奠定基础。
程文超,周亚,李万文,王敬,吴有华[10]（2016）在《草鱼老三病与新三病的分析》文中提出草鱼老三病为"烂鳃病"、"肠炎病"、"赤皮病",随着我国草鱼养殖业的发展,由于缺乏科学统筹的种业规划,养殖密度提高,养殖水体负荷增大,加上养殖技术缺乏更新提高、管理落后等因素导致草鱼"细菌性并发症"（赤皮、烂鳃、肠炎并发症）、"病毒性出血病"、"肝胆综合症"等新三病尤为常见,给草鱼养殖业造成了极大损失。本文通过病原、主要症状、发病
二、草鱼“肠炎型”出血病的防治措施（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、草鱼“肠炎型”出血病的防治措施（论文提纲范文）
（1）一株新型草鱼呼肠孤病毒的分离鉴定及其RPA-LFD检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRCT |
| 第一章 引言 |
| 1.草鱼出血病的研究进展 |
| 1.1 草鱼出血病简介 |
| 1.2 草鱼出血病的流行病学研究 |
| 1.2.1 草鱼呼肠孤病毒的感染对象 |
| 1.2.2 草鱼出血病的流行范围及季节 |
| 1.2.3 草鱼出血病的临床症状 |
| 1.2.4 草鱼出血病的细胞培养特性 |
| 1.3 草鱼呼肠孤病毒的分子生物学特性研究 |
| 1.3.1 草鱼呼肠孤病毒的形态特征 |
| 1.3.2 草鱼呼肠孤病毒的理化特性 |
| 1.3.3 草鱼呼肠孤病毒的基因组特征 |
| 1.3.4 草鱼呼肠孤病毒编码的蛋白 |
| 1.4 草鱼呼肠孤病毒的感染和复制特性研究 |
| 1.5 草鱼呼肠孤病毒的检测方法 |
| 1.6 草鱼出血病的防治 |
| 1.6.1 生态防治 |
| 1.6.2 疫苗防治 |
| 1.6.3 抗病毒药物和免疫增强剂 |
| 2.重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术原理和应用 |
| 2.1 RPA技术概述 |
| 2.1.1 RPA技术原理 |
| 2.1.2 RPA引物设计原则 |
| 2.1.3 扩增产物的检测方法 |
| 2.2 重组酶聚合酶等温扩增技术的应用 |
| 3.本论文研究的目的和意义 |
| 第二章 一株新型草鱼呼肠孤病毒的分离鉴定及全基因组分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物、细胞和病毒 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器和设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 病毒匀浆液制备 |
| 1.2.2 细胞培养与病毒分离 |
| 1.2.3 电镜观察 |
| 1.2.4 病毒RNA提取 |
| 1.2.5 反转录c DNA的合成 |
| 1.2.6 病毒的理化性质分析 |
| 1.2.7 病毒RNA的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)带型分析 |
| 1.2.8 病毒全基因组测序 |
| 1.2.9 全基因组序列分析和遗传进化分析 |
| 1.2.10 人工感染实验 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 病毒的分离传代 |
| 2.2 超薄切片电镜观察 |
| 2.3 病毒RT-PCR检测 |
| 2.4 病毒的理化特性分析 |
| 2.5 病毒RNA的 SDS-PAGE带型分析 |
| 2.6 全基因组序列获得和特征分析 |
| 2.6.1 RACE扩增结果 |
| 2.6.2 全基因组序列特征 |
| 2.7 全基因组序列分析及编码的蛋白功能预测 |
| 2.8 遗传进化分析 |
| 2.9 人工感染实验 |
| 3.讨论 |
| 第三章 HGCRV毒株的体内体外增殖特性 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验鱼和细胞 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器和设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 目的片段载体构建 |
| 1.2.2 标准品的制备 |
| 1.2.3 标准曲线的建立 |
| 1.2.4 人工感染实验及样品采集 |
| 1.2.5 细胞培养与病毒收集 |
| 1.2.6 接种浓度的优化 |
| 1.2.7 不同细胞上HGCRV增殖特性 |
| 1.2.8 草鱼体内HGCRV增殖特性 |
| 1.2.9 数据分析 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 VP7 蛋白基因扩增结果 |
| 2.2 载体构建验证 |
| 2.3 标准曲线的建立 |
| 2.4 细胞最佳接种浓度的确定 |
| 2.5 接种不同细胞的敏感性分析 |
| 2.6 感染不同细胞后病毒的体外动态增殖曲线 |
| 2.7 感染草鱼后病毒的体内动态增殖曲线 |
| 3.讨论 |
| 第四章 HGCRV的 RPA-LFD检测方法的建立 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 细胞及病毒 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器与设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物和探针设计 |
| 1.2.2 重组质粒构建 |
| 1.2.3 RPA-LFD检测体系建立 |
| 1.2.4 反应温度优化 |
| 1.2.5 特异性验证 |
| 1.2.6 灵敏度检测 |
| 1.2.7 在临床样品检测中的应用 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 重组质粒的验证 |
| 2.2 反应温度优化 |
| 2.3 特异性验证 |
| 2.4 灵敏性检测 |
| 2.5 重复性实验 |
| 2.6 临床检测 |
| 3.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）基于杆状病毒表达系统的Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗制备及免疫效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 草鱼出血病研究进展 |
| 1.1 草鱼出血病研究历史 |
| 1.2 草鱼出血病流行病学研究 |
| 1.3 草鱼呼肠孤病毒的分子生物学特性 |
| 1.3.1 草鱼呼肠孤病毒形态特征 |
| 1.3.2 草鱼呼肠孤病毒基因组结构 |
| 1.3.3 草鱼呼肠孤病毒的理化特性 |
| 1.3.4 草鱼呼肠孤病毒编码的蛋白 |
| 1.3.5 草鱼呼肠孤病毒细胞培养和感染特征 |
| 1.4 草鱼呼肠孤病毒的检测方法 |
| 1.5 草鱼出血病的防控措施 |
| 1.5.1 生态防控 |
| 1.5.2 药物防治 |
| 1.5.3 疫苗预防 |
| 1.6 疫苗免疫方法 |
| 1.7 杆状病毒表达系统 |
| 1.7.1 杆状病毒概述 |
| 1.7.2 杆状病毒表达系统的原理 |
| 1.7.3 杆状病毒表达系统研究进展 |
| 1.7.4 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建 |
| 1.7.5 杆状病毒表达系统的优点 |
| 1.7.6 杆状病毒表达系统在疫苗研究中的应用 |
| 1.8 本论文研究的目的与意义 |
| 第二章 Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒VP35、VP4和VP35-VP4 亚单位疫苗的制备与免疫效果评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验鱼、病毒与细胞系 |
| 1.2 主要试剂及药品 |
| 1.3 实验仪器与设备 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 所用软件 |
| 1.6 目的基因的扩增和克隆 |
| 1.6.1 总RNA的提取 |
| 1.6.2 cDNA的合成 |
| 1.6.3 目的基因的扩增 |
| 1.6.4 胶回收PCR产物 |
| 1.6.5 目的基因的T载体克隆 |
| 1.7 杆状病毒表达载体的构建 |
| 1.7.1 双酶切 |
| 1.7.2 连接 |
| 1.8 重组质粒Bacmid的获得 |
| 1.9 重组质粒Bacmid的鉴定 |
| 1.10 重组杆状病毒的获得 |
| 1.11 重组杆状病毒的扩增 |
| 1.12 重组杆状病毒的鉴定 |
| 1.13 重组杆状病毒滴度的测定 |
| 1.14 SDS-PAGE分析重组蛋白的表达并纯化 |
| 1.15 Western blot检测重组蛋白的表达 |
| 1.16 间接免疫荧光鉴定外源基因在SF9细胞中的表达 |
| 1.17 免疫鱼体与样品的采集 |
| 1.17.1 免疫稀有鲫 |
| 1.17.2 样品的采集 |
| 1.18 实时荧光定量PCR检测免疫相关基因的表达 |
| 1.19 免疫保护率的测定 |
| 1.20 实验数据与统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 VP35、VP4和VP35-T2A-VP4 蛋白基因的PCR扩增结果 |
| 2.2 杆状 病毒表达 载体 pFast Bac-VP35、 pFast Bac-VP4 和 pFast Bac-VP35-T2A-VP4 的鉴定 |
| 2.3 重组穿梭质粒 Bacmid-VP35、Bacmid-VP4 和 Bacmid-VP35-VP4 的产生及验证 |
| 2.4 重组杆状病毒 rBac-VP35、rBac-VP4 和 rBac-VP35-VP4 的获得和鉴定 |
| 2.5 重组杆状病毒r Bac-VP35、r Bac-VP4和r Bac-VP35-VP4 滴度的测定 |
| 2.6 重组蛋白的SDS-PAGE检测 |
| 2.7 Western blot检测重组蛋白的表达 |
| 2.8 IFA鉴定重组蛋白在SF9细胞中的表达 |
| 2.9 免疫相关基因的表达变化 |
| 2.10 免疫保护率 |
| 3 讨论 |
| 第三章 Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒VP35-VP4口服亚单位疫苗的制备及免疫效果评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 实验仪器与设备 |
| 1.3 重组质粒Bm Bacmid-VP35-VP4 的获得 |
| 1.4 重组质粒Bm Bacmid-VP35-VP4 的鉴定 |
| 1.5 重组家蚕杆状病毒的获得 |
| 1.6 重组家蚕杆状病毒的扩增 |
| 1.7 重组家蚕杆状病毒的PCR鉴定 |
| 1.8 重组家蚕杆状病毒滴度的测定 |
| 1.9 重组家蚕杆状病毒表达VP35-VP4 蛋白的Western blot分析 |
| 1.10 间接免疫荧光检测外源基因在BmE细胞中的表达 |
| 1.11 重组家蚕杆状病毒感染蚕体中目的基因的鉴定 |
| 1.12 家蚕中重组蛋白的表达检测 |
| 1.13 His标签ELISA检测试剂盒检测蛋白浓度 |
| 1.14 口服疫苗的制备 |
| 1.15 口服疫苗免疫与样品采集 |
| 1.15.1 鱼体免疫 |
| 1.15.2 样品采集 |
| 1.16 血细胞计数和白细胞分类计数 |
| 1.16.1 红细胞和白细胞计数 |
| 1.16.2 白细胞分类计数 |
| 1.17 酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清抗体效价 |
| 1.18 qRT-PCR检测样品中免疫相关基因的表达量 |
| 1.19 攻毒试验 |
| 1.20 数据分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 重组质粒Bm Bacmid-VP35-T2A-VP4 的产生及鉴定 |
| 2.2 重组家蚕杆状病毒的获得和鉴定 |
| 2.3 重组家蚕杆状病毒r Bm Bac-VP35-VP4 滴度的测定 |
| 2.4 Western blot检测重组蛋白的表达 |
| 2.5 IFA鉴定重组蛋白在Bm E细胞中的表达 |
| 2.6 重组家蚕杆状病毒感染家蚕及重组病毒DNA鉴定 |
| 2.7 Western blot检测重组蛋白在家蚕中的表达 |
| 2.8 家蚕体内重组蛋白浓度的测定 |
| 2.9 免疫后草鱼血细胞计数 |
| 2.10 免疫后草鱼白细胞分类计数 |
| 2.11 免疫后草鱼血清特异性抗体IgM效价 |
| 2.12 免疫相关基因的表达变化 |
| 2.13 免疫保护率 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略语表（按字母顺序排列） |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）探究草鱼病害防控方略（论文提纲范文）
| 一、草鱼病毒性出血病的防治 |
| 二、草鱼细菌性疾病的防治 |
| 三、草鱼肝胆综合症的防治 |
| 四、病害防治要点总结 |
（4）利用大肠杆菌构建GCRV基因工程疫苗系统研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 草鱼出血病研究概况 |
| 1.2 草鱼出血病流行病学研究 |
| 1.3 草鱼呼肠孤病毒（GCRV）生物学研究 |
| 1.3.1 GCRV形态特征 |
| 1.3.2 GCRV理化特征 |
| 1.3.3 GCRV细胞培养和感染特征 |
| 1.3.4 GCRV基因组特征 |
| 1.3.5 GCRV基因组转录与翻译 |
| 1.4 草鱼呼肠孤病毒（GCRV）的检测 |
| 1.5 草鱼出血病防治方法研究进展 |
| 1.5.1 草鱼出血病生态防治 |
| 1.5.2 草鱼出血病药物防控 |
| 1.5.3 RNA干扰技术预防草鱼出血病 |
| 1.5.4 草鱼出血病疫苗防治 |
| 1.6 疫苗免疫途径研究进展 |
| 1.6.1 注射免疫途径 |
| 1.6.2 口服免疫途径 |
| 1.6.3 浸泡免疫途径 |
| 1.7 菌蜕研究进展 |
| 1.7.1 菌蜕形成机制 |
| 1.7.2 菌蜕疫苗免疫效果研究 |
| 1.7.3 菌蜕作为药物载体研究 |
| 1.7.4 菌蜕作为抗原载体研究 |
| 1.7.5 菌蜕作为DNA载体研究 |
| 1.8 细菌表面展示研究进展 |
| 1.8.1 细菌表面展示系统简介 |
| 1.8.2 细菌表面展示在疫苗开发中的应用 |
| 1.8.3 基于冰核蛋白的细菌表面展示研究 |
| 1.8.4 基于冰核蛋白的细菌表面展示在疫苗开发中的应用 |
| 1.9 选题的目的和意义 |
| 第二章 大肠杆菌菌蜕载GCRV vp7核酸疫苗构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验动物和病毒 |
| 2.1.2 细菌和质粒 |
| 2.1.3 pCAT-lysisE/SNA/Smap29重组质粒构建 |
| 2.1.4 pCAT-lysisE/SNA/Smap29重组质粒表达 |
| 2.1.5 大肠杆菌DH5α菌蜕扫描电镜检测 |
| 2.1.6 大肠杆菌DH5α菌蜕载vp7核酸疫苗构建 |
| 2.1.7 大肠杆菌DH5α菌蜕载vp7核酸疫苗装载效果检测 |
| 2.1.8 疫苗免疫和攻毒试验 |
| 2.1.9 不同组织中pcDNA-vp7检测 |
| 2.1.10 肌肉组织中pcDNA-vp7表达检测 |
| 2.1.11 草鱼血清抗体免疫效价测定 |
| 2.1.12 免疫相关生理指标检测 |
| 2.1.13 免疫相关基因表达测定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 pCAT-lysisE/SNA/Smap29重组质粒构建结果 |
| 2.2.2 pCAT-lysisE/SNA/Smap29重组质粒诱导表达结果 |
| 2.2.3 大肠杆菌DH5α菌蜕扫描电镜检测 |
| 2.2.4 大肠杆菌菌蜕载核酸疫苗装载效果分析 |
| 2.2.5 不同组织中pcDNA-vp7检测结果 |
| 2.2.6 肾脏组织中pcDNA-vp7表达检测结果 |
| 2.2.7 草鱼血清抗体效价测定结果 |
| 2.2.8 免疫相关生理指标测定结果 |
| 2.2.9 免疫相关基因检测结果 |
| 2.2.10 免疫保护效果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 大肠杆菌表面展示VP7蛋白疫苗构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验动物和病毒 |
| 3.1.2 细菌和质粒 |
| 3.1.3 重组pET28a-InpN/vp7质粒构建 |
| 3.1.4 重组蛋白诱导表达 |
| 3.1.5 包涵体检测 |
| 3.1.6 细胞组分分离 |
| 3.1.7 免疫荧光检测 |
| 3.1.8 重组菌VP7蛋白表达量测定 |
| 3.1.9 草鱼免疫实验 |
| 3.1.10 抗体效价测定 |
| 3.1.11 免疫相关生理指标测定 |
| 3.1.12 免疫相关基因表达测定 |
| 3.1.13 GCRV攻毒试验 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 pET28a-InpN/vp7重组质粒构建结果 |
| 3.2.2 重组蛋白表达检测结果 |
| 3.2.3 包涵体检测结果 |
| 3.2.4 细胞组分超速离心分离检测结果 |
| 3.2.5 免疫荧光检测结果 |
| 3.2.6 重组菌VP7蛋白表达量测定结果 |
| 3.2.7 抗体效价测定结果 |
| 3.2.8 免疫相关生理指标测定结果 |
| 3.2.9 免疫相关基因检测结果 |
| 3.2.10 免疫保护效果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 大肠杆菌表面共展示vp7-OmpA和vp7-Mah蛋白疫苗构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验动物和病毒 |
| 4.1.2 细菌和质粒 |
| 4.1.3 重组pET28a-InpN/vp7-OmpA质粒构建 |
| 4.1.4 重组pET28a-InpN/vp7-Mah质粒构建 |
| 4.1.5 重组蛋白诱导表达 |
| 4.1.6 包涵体检测 |
| 4.1.7 细胞组分分离 |
| 4.1.8 免疫荧光检测 |
| 4.1.9 重组菌中VP7蛋白表达量测定 |
| 4.1.10 草鱼免疫实验 |
| 4.1.11 抗体效价测定 |
| 4.1.12 免疫相关生理指标测定 |
| 4.1.13 免疫相关基因表达测定 |
| 4.1.14 GCRV攻毒试验 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 重组质粒构建结果 |
| 4.2.2 重组蛋白表达检测结果 |
| 4.2.3 包涵体检测结果 |
| 4.2.4 细胞组分超速离心分离检测结果 |
| 4.2.5 免疫荧光检测结果 |
| 4.2.6 重组菌VP7蛋白表达量测定结果 |
| 4.2.7 草鱼血清抗体效价测定结果 |
| 4.2.8 免疫相关生理指标测定结果 |
| 4.2.9 草鱼免疫相关基因检测结果 |
| 4.2.10 免疫保护效果评价 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 大肠杆菌表面共展示vp7-Mah侵染机制初步研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞和细菌 |
| 5.1.2 BL21/InpN/vp7-Mah粘附和侵染试验 |
| 5.1.3 不同胞吞抑制剂对BL21/InpN/vp7-Mah侵染EPC细胞的影响 |
| 5.1.4 BL21/InpN/vp7-Mah侵染对EPC细胞F-肌动蛋白（F-actin）的影响 |
| 5.1.5 细胞松弛素D对BL21/InpN/vp7-Mah侵染EPC细胞的影响 |
| 5.1.6 BL21/InpN/vp7-Mah侵染对EPC细胞p38激酶和HSP27磷酸化的影响 |
| 5.1.7 p38 激酶抑制剂对 BL21/Inp N/vp7-Mah 侵染 EPC 细胞的影响 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 BL21/InpN/vp7-Mah粘附和侵染EPC细胞能力分析 |
| 5.2.2 不同胞吞抑制剂对BL21/InpN/vp7-Mah侵染EPC的影响 |
| 5.2.3 BL21/InpN/vp7-Mah侵染对EPC细胞F-actin的影响 |
| 5.2.4 细胞松弛素D对BL21/InpN/vp7-Mah侵染EPC的影响 |
| 5.2.5 BL21/InpN/vp7-Mah侵染对EPC细胞p38激酶和HSP27磷酸化的影响 |
| 5.2.6 p38 激酶抑制剂对 BL21/InpN/vp7-Mah 侵染 EPC 的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）草鱼呼肠孤病毒分子流行病学、全基因组序列及流行株灭活疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 草鱼出血病的危害 |
| 1.2 草鱼呼肠孤病毒的发现 |
| 1.3 草鱼出血病的症状及流行规律 |
| 1.4 草鱼呼肠孤病毒的生物学和理化特性 |
| 1.5 草鱼呼肠孤病毒细胞培养特性 |
| 1.6 草鱼呼肠孤病毒的组织嗜性与致病机理 |
| 1.7 草鱼呼肠孤病毒的基因组序列与基因分型 |
| 1.8 草鱼呼肠孤病毒基因组编码蛋白及其功能 |
| 1.9 草鱼呼肠孤病毒检测技术 |
| 1.10 草鱼出血病的防控 |
| 1.10.1 疫苗免疫免疫防控 |
| 1.10.2 抗病毒药物的研究 |
| 1.10.3 生态综合防控技术 |
| 1.11 本研究所要解决的问题 |
| 1.12 本研究目的和意义 |
| 1.12.1 分子流行病学研究 |
| 1.12.2 代表株基因组带型和全基因组序列分析 |
| 1.12.3 流行株型灭活疫苗研究 |
| 第2章 草鱼呼肠孤病毒分子流行病学研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验鱼、细胞、毒株、菌株和质粒 |
| 2.2.2 主要试剂及耗材 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 主要溶液配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 样品采集和处理 |
| 2.3.2 RNA提取 |
| 2.3.3 PCR检测和测序分析 |
| 2.3.4 代表株S7基因的克隆与测序 |
| 2.3.5 S7基因节段进化分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 无临床症状草鱼样品GCRV的PCR检测结果 |
| 2.4.2 疑似草鱼出血病样品GCRV的PCR检测结果 |
| 2.4.3 GCRV阳性率与温度的关系 |
| 2.4.4 基于S7基因节段的GCRV进化分析 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 代表株基因组带型和全基因组序列分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 样品的采集与处理 |
| 3.3.2 病毒的分离与鉴定 |
| 3.3.3 病毒的扩增 |
| 3.3.4 病毒的浓缩与纯化 |
| 3.3.6 病毒基因组的提取 |
| 3.3.7 病毒基因组的SDS-PAGE带型分析 |
| 3.3.8 病毒全基因组序列的测定 |
| 3.3.9 序列拼接 |
| 3.3.10 各分离株的核苷酸序列 |
| 3.3.11 各分离株核苷酸序列和推导的氨基酸序列分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 GCRV基因组电泳带型分析 |
| 3.4.2 GCRV代表株全基因组序列测定 |
| 3.4.3 基因组特征分析 |
| 3.4.4 基因分型和遗传进化树分析 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 草鱼呼肠孤病毒流行株灭活疫苗的研制及其免疫效果评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验鱼、细胞和毒株 |
| 4.2.2 病毒扩增 |
| 4.2.3 病毒灭活 |
| 4.2.4 残余的活病毒测试 |
| 4.2.5 最低免疫剂量试验 |
| 4.2.6 草鱼免疫试验 |
| 4.2.7 抗体效价测定 |
| 4.2.8 中和抗体测定 |
| 4.2.9 免疫相关基因的相对表达量测定 |
| 4.2.10 攻毒保护试验 |
| 4.2.11 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 病毒灭活 |
| 4.3.2 最低免疫剂量 |
| 4.3.3 血清特异性抗体的检测 |
| 4.3.4 中和抗体水平 |
| 4.3.5 免疫相关基因的表达量 |
| 4.3.6 免疫草鱼对强毒感染的免疫保护效果 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 全文讨论与总结 |
| 5.1 关于草鱼呼肠孤病毒分子流行病学 |
| 5.2 关于草鱼呼肠孤病毒基因组带型和全基因组序列研究 |
| 5.3 关于草鱼呼肠孤病毒流行株灭活疫苗研究 |
| 5.4 全文总结 |
| 5.4.1 关于草鱼呼肠孤病毒分子流行病学 |
| 5.4.2 关于草鱼呼肠孤病毒基因组带型和全基因组序列研究 |
| 5.4.3 草鱼呼肠孤病毒流行株灭活疫苗研究 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：攻读博士期间发表文章和专利 |
（6）盐酸吗啉胍抗草鱼呼肠孤病毒研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 GCRV研究历史 |
| 1.2 草鱼出血病的流行病学概况 |
| 1.3 GCRV生物学研究 |
| 1.3.1 GCRV形态特征 |
| 1.3.2 GCRV理化特性 |
| 1.3.3 GCRV的细胞培养及感染特性 |
| 1.3.4 GCRV的一般生物学特征 |
| 1.3.5 GCRV转录和翻译 |
| 1.4 GCRV的检测 |
| 1.5 病毒感染对宿主影响研究 |
| 1.5.1 水产动物病毒与宿主细胞的关系 |
| 1.5.2 GCRV与宿主细胞的相互关系 |
| 1.6 草鱼出血病病害防控技术研究 |
| 1.6.1 草鱼出血病疫苗免疫 |
| 1.6.2 草鱼机体免疫抗GCRV研究 |
| 1.6.3 基因干扰技术抑制草鱼出血病 |
| 1.6.4 草鱼出血病的生态防控 |
| 1.6.5 草鱼出血病药物防控 |
| 1.7 Mor抗病毒研究 |
| 1.7.1 Mor概述 |
| 1.7.2 Mor特性 |
| 1.7.3 Mor研究进展 |
| 1.8 药物抗病毒途径的相互关系 |
| 1.9 选题目的及意义 |
| 第二章 Mor体外抗GCRV活性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞、病毒和化合物 |
| 2.1.2 主要细胞培养基及溶液的配制 |
| 2.1.3 细胞的复苏与培养 |
| 2.1.4 病毒扩增与滴度 |
| 2.1.5 Mor抗病毒处理后对细胞活力检测 |
| 2.1.6 药物对细胞的安全性检测 |
| 2.1.7 Mor在CIK细胞的药物代谢检测 |
| 2.1.8 Mor抗GCRV病毒对宿主细胞的形态学检测 |
| 2.1.9 Mor抗GCRV病毒效果的浓度梯度检测 |
| 2.1.10 Mor处理后对病毒滴度的检测 |
| 2.1.11 Mor处理后对病毒基因表达的检测 |
| 2.1.12 Mor处理后对GCRV病毒蛋白表达的检测 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 Mor对GCRV病毒的体外抗病毒活性 |
| 2.2.2 Mor对细胞的急性毒性 |
| 2.2.3 Mor在CIK细胞内的代谢作用 |
| 2.2.4 Mor抗GCRV病毒对宿主细胞的形态学检测 |
| 2.2.5 Mor抗GCRV的浓度梯度检测结果 |
| 2.2.6 Mor处理后对病毒滴度的影响 |
| 2.2.7 Mor处理后对病毒基因表达的影响 |
| 2.2.8 Mor对GCRV病毒蛋白表达的抑制 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Mor在体抗GCRV研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 药物对草鱼的安全性 |
| 3.1.3 病毒攻毒及药物处理 |
| 3.1.4 Mor抗病毒效果检测 |
| 3.1.5 Mor抗病毒过程中对草鱼血液酶活检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Mor对草鱼的急性毒性 |
| 3.2.2 Mor处理后对草鱼死亡率的保护 |
| 3.2.3 药物浸泡和注射下对草鱼组织内GCRV的检测 |
| 3.2.4 药物注射处理下对草鱼相关生理指标测定 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Mor抑制GCRV蛋白表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 GCRV104病毒VP6目的基因扩增与回收 |
| 4.1.2 重组克隆质粒的构建与鉴定 |
| 4.1.3 重组表达载体的构建与鉴定 |
| 4.1.4 Mor对重组质粒在CIK细胞内的表达的荧光检测 |
| 4.1.5 重组质粒转染CIK细胞后对宿主细胞活力的检测 |
| 4.1.6 重组质粒转染CIK细胞后对宿主凋亡的流式细胞检测 |
| 4.1.7 Mor对重组质粒转染CIK细胞后VP6表达的影响 |
| 4.2 实验结果与分析 |
| 4.2.1 GCRV病毒VP6基因的扩增与鉴定 |
| 4.2.2 VP6基因真核表达载体酶切和测序鉴定 |
| 4.2.3 Mor 作用下对重组质粒在 CIK 细胞内表达的影响 |
| 4.2.4 pIRES2-AcGFP1-VP6转染后对CIK细胞活力的影响 |
| 4.2.5 pIRES2-AcGFP1-VP6转染后对CIK细胞凋亡的影响 |
| 4.2.6 Mor 对转染细胞内 VP6 表达的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 Mor抗CIK细胞凋亡机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 Mor处理后对防止细胞核损伤的检测 |
| 5.1.2 Mor处理后对防止DNA损伤的分子检测 |
| 5.1.3 Mor对细胞表面超微结构的检测 |
| 5.1.4 Mor抑制GCRV粒子在细胞内的复制以及抗凋亡检测 |
| 5.1.5 凋亡抑制剂作用下的细胞活力检测 |
| 5.1.6 分光光度法检测Caspase 3 的相对活性 |
| 5.1.7 Caspase- 9、-3 的Western-blot检测 |
| 5.1.8 GCRV感染对Bax和Bcl-2 蛋白表达的检测 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 Mor处理后对防止细胞核损伤的检测 |
| 5.2.2 Mor处理后对防止DNA断裂的检测 |
| 5.2.3 Mor处理后对细胞表面形态的影响 |
| 5.2.4 Mor处理后对细胞内部形态的影响 |
| 5.2.5 GCRV感染对Caspase 3 酶活性的影响 |
| 5.2.6 Mor作用下对线粒体凋亡通路的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 Mor对宿主免疫反应的调控作用 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 Mor处理后对宿主细胞免疫基因表达的检测 |
| 6.1.2 Mor抗病毒过程中对草鱼免疫影响试验 |
| 6.2 实验结果与分析 |
| 6.2.1 Mor处理后对CIK细胞免疫基因表达的影响 |
| 6.2.2 药物注射处理下对草鱼体内免疫基因表达的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）2016年江西地区草鱼呼肠孤病毒（GCRV）分子流行病学分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 采样 |
| 1.2 实验室检测 |
| 1.2.1 样品处理 |
| 1.2.2 RNA提取 |
| 1.2.3 三重RT-PCR扩增 |
| 1.2.4 电泳与测序 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 草鱼样品的检测结果 |
| 2.2 疑似病例的检测结果 |
| 2.3 基因测序结果 |
| 3 讨论 |
（9）草鱼呼肠孤病毒GZ1208株的分离、鉴定及全基因组序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1 草鱼出血病及其病原 |
| 2 病毒形态及生化特征 |
| 3 基因分型与流行病学 |
| 4 细胞培养特性 |
| 5 基因组序列 |
| 6 基因组特征及各基因节段编码的多肽 |
| 7 检测方法 |
| 8 草鱼出血病防控 |
| 9 本研究目的和意义 |
| 第二章 草鱼呼肠孤病毒GZ1208的分离与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验鱼、样品、细胞和毒株 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 患病草鱼样品收集 |
| 1.4 组织匀浆液制备 |
| 1.5 病毒分离 |
| 1.6 电镜切片制作 |
| 1.7 三重RT-PCR检测 |
| 1.8 扩增产物测序与比对 |
| 1.9 病毒浓缩 |
| 1.10 病毒基因组提取 |
| 1.11 基因组带型分析 |
| 1.12 病毒滴度测定 |
| 1.13 回归感染试验 |
| 1.14 交叉免疫实验 |
| 2. 结果 |
| 2.1 发病草鱼症状 |
| 2.2 6天内PSF细胞感染病毒后的形态变化 |
| 2.3 电镜下的病毒粒子 |
| 2.4 三重PCR电泳带型 |
| 2.5 扩增片段与873序列比较 |
| 2.6 SDS-PAGE电泳带型 |
| 2.7 病毒滴度测定 |
| 2.8 回归感染实验 |
| 2.9 交叉免疫实验 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 全基因组序列测定与特征分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验细胞、毒株及所用软件 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 序列扩增与测序 |
| 1.5 序列拼接 |
| 1.6 基因组特征 |
| 1.7 序列相似性分析 |
| 1.8 编码氨基酸分析 |
| 1.9 氨基酸相似性分析 |
| 1.10 系统进化树构建 |
| 2. 结果 |
| 2.1 全基因组序列 |
| 2.2 基因组特征 |
| 2.3 编码氨基酸 |
| 2.4 各节段的核酸序列相似性比较 |
| 2.5 各节段的氨基酸序列相似性比较 |
| 2.6 系统进化树 |
| 3. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 硕士期间参加会议 |
| 致谢 |
四、草鱼“肠炎型”出血病的防治措施（论文参考文献）
- [1]一株新型草鱼呼肠孤病毒的分离鉴定及其RPA-LFD检测方法的建立[D]. 张可. 上海海洋大学, 2021(01)
- [2]基于杆状病毒表达系统的Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗制备及免疫效果评价[D]. 母昌勇. 江西农业大学, 2020(07)
- [3]探究草鱼病害防控方略[J]. 郭志文. 渔业致富指南, 2019(19)
- [4]利用大肠杆菌构建GCRV基因工程疫苗系统研究[D]. 郝凯. 西北农林科技大学, 2017(02)
- [5]草鱼呼肠孤病毒分子流行病学、全基因组序列及流行株灭活疫苗研究[D]. 曾伟伟. 华南农业大学, 2017(08)
- [6]盐酸吗啉胍抗草鱼呼肠孤病毒研究[D]. 余小波. 西北农林科技大学, 2017(11)
- [7]2016年江西地区草鱼呼肠孤病毒（GCRV）分子流行病学分析[J]. 田飞焱,曾伟伟,张晓燕,徐节华,谢世红,花麒,刘文珍,银旭红,孟霞,刘彬,欧阳敏. 江西水产科技, 2016(06)
- [8]草鱼呼肠孤病毒HZ08株抗体IPMA检测方法的建立及应用[J]. 曾伟伟,王庆,王英英,李莹莹,郝贵杰,石存斌,沈锦玉. 水产学报, 2017(01)
- [9]草鱼呼肠孤病毒GZ1208株的分离、鉴定及全基因组序列分析[D]. 李贤. 上海海洋大学, 2016(02)
- [10]草鱼老三病与新三病的分析[J]. 程文超,周亚,李万文,王敬,吴有华. 海洋与渔业, 2016(04)