一、嗜水气单胞菌研究进展(综述)（论文文献综述）
文峥嵘,罗鸣钟,柴毅,杨代勤,李锐,魏巍[1]（2021）在《黄鳝出血病研究进展》文中提出黄鳝出血病是黄鳝（Monopterus albus）养殖中频发的一种细菌性疾病,其暴发速度快、传染力强、死亡率高,给黄鳝养殖业带来巨大经济损失。本研究对关于嗜水气单胞菌的生物学特性、鉴定方式、分子生物学与生理生化学研究进展以及黄鳝出血病常见的预防和治疗措施等进行了综述,并在对目前黄鳝出血病防控过程中出现的问题和未来发展趋势进行了总结。
郭雅萌[2]（2021）在《抗嗜水气单胞菌三味中药水煎液及联用对鲫鱼免疫效果的评价》文中进行了进一步梳理嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）隶属于气单胞菌科（Aeromonadaceae）、气单胞菌属,是一种人畜共患的致病菌。当人类感染嗜水气单胞菌时可出现严重腹泻、败血症等症状。目前,在水产养殖业中治疗由嗜水气单胞菌引起的水生动物疾病主要方式是使用抗生素,抗生素的大量使用也带来了日益严重的问题。因此,研究和开发绿色健康的药物来替代抗生素是水产养殖业的一项紧迫任务。中药因其无残留、无环境污染且抗菌效果明显等诸多优点备受关注。鉴于此本研究选取了黄芪、地榆、五倍子三味中药,通过体外抑菌试验探究三味中药水煎液及联用对嗜水气单胞菌的体外抑制效果,并分析其对嗜水气单胞菌相关毒力基因表达的影响。利用口服免疫的方式将三种单味中药水煎液及联用包被鱼粮饲喂鲫鱼,检测其生长指标、相关免疫指标、细胞因子的表达水平及对嗜水气单胞菌攻毒后的保护率等来探究三味中药水煎液及联用对鱼体的免疫保护作用。本试验主要分为两个部分:试验一:三味中药水煎液及联用对嗜水气单胞菌的体外抑制试验通过测定黄芪、地榆、五倍子三种单味中药水煎液及联用对嗜水气单胞菌最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）、生长曲线、生物被膜、抑制毒力基因的表达。来探讨单味中药水煎液及联用的体外抑菌效果。采用二倍稀释法测定各中药对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。结果显示:单味黄芪和地榆的MIC和MBC分别为2.5g/ml、5g/ml;单味五倍子的MIC和MBC分别为1.25g/ml、2.5g/ml;联用后的MIC和MBC浓度最低,分别为0.625g/ml、2.5g/ml。选择各中药水煎液的最小抑菌浓度作用于嗜水气单胞菌,在10h内每1h测定菌液的OD600,并绘制成曲线后发现:三种单味中药在4h前对嗜水气单胞菌有明显的抑制作用,而联用后则表现在7h内对嗜水气单胞菌均有抑制作用。检测其对嗜水气单胞菌生物被膜的影响发现:单味黄芪、地榆、五倍子在浓度为25%时表现可抑制嗜水气单胞菌生物被膜,联用后则在浓度为15%时就可抑制嗜水气单胞菌生物被膜。各体外抑制试验表明:联用后的中药水煎液对嗜水气单胞菌的抑制效果强于单味中药水煎液。用各中药测得的最小抑菌浓度作用于嗜水气单胞菌,分析其对嗜水气单胞菌相关毒力基因表达水平的影响。结果表明各中药对嗜水气单胞菌溶血素hly基因的表达量同空白对照组相比差异不明显（P<0.05）,黄芪组和联用组对嗜水气单胞菌omp基因的表达量同空白对照组差异较显着（P<0.01）,地榆组和联用组对嗜水气单胞菌luxs基因的表达量同空白对照组相比差异显着（P<0.001）。说明各中药能抑制嗜水气单胞菌omp基因和luxs基因的表达。试验二:三种单味中药水煎液及联用免疫保护作用的研究用鲫鱼作为试验动物,将中药包被饲料后对鲫鱼进行定时定量投喂,在免疫前及各免疫周期内取各组鲫鱼的组织和血液,检测免疫相关指标。并在免疫结束后进行嗜水气单胞菌攻毒来检测免疫保护率。用ELISA方法检测血清中Ig M、l ZM、SOD、CAT、C4、C3、GSH-PX指标。结果表明:经过中药饲喂鲫鱼的各项指标都有所提升,口服免疫后的鲫鱼血清中能检测到较高含量的Ig M,同时血清中LZM、SOD、CAT、C3、C4、GSH-PX各项指标均呈现不同程度的上调趋势。初步说明各中药可增强鱼类的体液免疫。利用q RT-PCR检测鲫鱼各组织NF-KB、MYD88、IL-1β、TNF-α和IFN-γ细胞因子的转录水平。结果表明各试验组中鲫鱼肾、脾脏中IL-1β、TNF-α、IFN-γ、NF-KB、MYD88各基因的转率水平都呈现上调趋势。尤其是鲫鱼肠道中IL-10、IL-1β、IFN-γ、TNF-α、NF-KB及MYD88基因的表达量上调趋势显着,表明中药可能刺激鱼肠道内的相关细胞因子,来达到提升鲫鱼免疫水平的作用。嗜水气单胞菌攻毒后观察14d,发现中药能缓解嗜水气单胞菌对鲫鱼的感染,提高了鲫鱼的存活率,在一定程度上起到了保护作用。综上所述,本研究选取的中药体内外均可抑制嗜水气单胞菌,将其作为饲料添加剂投喂鱼群,可为由该菌引起的鱼病防治提供用药依据参考并对鱼类免疫起到了促进作用。
刘志刚[3]（2020）在《患病江豚微生态变化及迁地背景下江豚保护性研究》文中认为长江江豚是生活在长江中下游及鄱阳湖、洞庭湖等沿江大型湖泊的淡水豚类物种。近年来,随着工农业经济的快速发展,长江生态遭受严重破坏,长江江豚的栖息地环境持续恶化,导致其种群数量快速下降,由20世纪90年代的2700头,下降至2017年的1014头。目前,长江江豚处于极度濒危状态。迁地保护是进行长江江豚保护的重要举措之一,在江豚保种和科学研究中发挥了重要作用。然而,疾病感染和饲养管理技术欠缺严重制约了迁地保护区江豚的健康生长和种群繁育。近年来,长江江豚疾病频发,而关于长江江豚病原学（细菌和病毒）方面的研究几乎处于空白,迁地保护区饲养管理不当又时常引起江豚死亡率高和繁殖效率低。因此,有必要对长江江豚感染性疾病和迁地保护区江豚的饲养管理开展系统性研究,初步了解长江江豚细菌性疾病和病毒性疾病的流行病原,掌握长江江豚主要致病菌的生物学特性;建立迁地保护区长江江豚饲养管理和疾病防治的技术规范。本研究开展了长江江豚细菌性疾病的病原学调查;长江江豚病料样本的病毒群落研究;长江江豚6种危害较大细菌的生物学特性研究;迁地保护区长江江豚的饲养管理与疾病防治研究,研究结果如下:1长江江豚细菌性疾病流行病学调查通过细菌的分离培养、染色镜检、理化鉴定、PCR鉴定等,对462份长江江豚呼吸孔、粪便、血液、内脏组织、皮肤病灶、腹腔积液、胸腔积液等样品进行了细菌的分离鉴定,同时使用16S r DNA高通量测序对患病长江江豚和健康长江江豚的肠道菌群进行了研究。结果从462份长江江豚样本中,获得655个细菌纯培养,分离鉴定成功31种细菌,分别为温和气单胞菌（Aeromonas sobria）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、微球菌（Micrococcus）、坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、变形杆菌（Proteus）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、嗜麦芽窄杆菌（Stenotrophomonas maltophilia）、大肠杆菌（Escherichia coli）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）、乳酸杆菌（Lactobacillus）、链球菌（Streptococcus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、诺卡氏菌（Nocardia）、弧菌（Vibrio）、不动杆菌（Acinetobacter）、魔氏摩根菌（Morganella morganii）、肠球菌（Enterococcus）、幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）、弯曲杆菌（Campylobacter）、黄杆菌（Flavobacterium）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、志贺样邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）、爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）和丹毒丝菌（Erysipelothrix）,其中产气荚膜梭菌、弧菌、爱德华菌等11种细菌在长江江豚属首次发现,大肠杆菌、气单胞菌、铜绿假单胞菌、葡萄球菌在所有样品中检出率相对较高;肠道内容物高通量测序,共检测到菌属340种,其中15种为潜在致病菌属,分别为埃希氏菌属、乳杆菌属、链球菌属、绿脓杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、气单胞菌属、诺卡氏菌属、弧菌属、巴氏杆菌属、葡萄球菌属、魔氏摩根菌、肠球菌、幽门螺旋杆菌、弯曲杆菌。2长江江豚主要致病菌生物学特性研究利用微生物学、分子生物学、兽医药理学和兽医病理学方法对分离自长江江豚的6种主要致病菌（嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、杀鲑气单胞菌、魔氏摩根菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）进行了生物学特性研究。结果显示,分离菌株按照常规方法进行培养,均可良好生长,与其他动物源细菌无明显差异;生化研究和16s r RNA序列测定结果与各菌最初鉴定结果表型一致;细菌耐药性研究结果显示,6种菌均存在一定程度的耐药性,以大肠杆菌的耐药性最强,金黄色葡萄球菌的最弱,气单胞菌属不同菌之间耐药性存在一定差异;BALB/c小鼠致病性试验证实,6种菌对小白鼠均有致病性,以维氏气单胞菌和杀鲑气单胞菌的致病力最强,金黄色葡萄球菌的致病力最弱,感染小白鼠剖解病理变化存在一定差异,但主要以肺脏瘀血、出血和肝脏瘀血、变性和坏死为主。3长江江豚病毒性疾病研究初探通过病毒宏基因组学研究方法,对收集自2017-2019年野外患病死亡的长江江豚组织病料（心脏、肝脏、脾脏、肾脏、皮肤等）进行了病毒群落研究和分析。结果共获得10600个重叠序列（contigs）,检测到病毒65个,其中,基于参考序列鉴定出病毒25种,Denovo序列鉴定病毒42种。科水平上,两种方法鉴定出的优势病毒为肌尾噬菌体科（Myoviridae）、疱疹病毒科（Herpesviridae）、逆转录病毒科（Retroviridae）、长尾噬菌体科（Siphoviridae）、线头病毒科（Nimaviridae）、阿克曼病毒科（Ackermannviridae）、痘病毒科（Poxviridae）、丝状噬菌体科（Inoviridae）、短尾噬菌体科（Podoviridae）、砂粒病毒科（Arenaviridae）、有尾噬菌体目未分类病毒科（Caudovirales unclassified）。除疱疹病毒外,噬菌体病毒、逆转录病毒、线头病毒、痘病毒和砂粒病毒等均为首次在长江江豚上发现。4迁地保护区长江江豚的饲养管理与疾病防治研究通过临床大量实践和数据分析,分别对迁地保护区大水域、围网环境下和疗养池中生长的长江江豚的饲养管理和疾病防治技术进行了研究,结果,总结制定出迁地保护区大水域、围网环境下和疗养池中长江江豚饲养管理的技术规范,计算统计出长江江豚血常规和血液生化的正常阈值,发现了长江江豚各生理生化指标与江豚疾病诊断间的相关性,建立了长江江豚健康体检的技术规范和健康评价标准,基本形成了长江江豚常见疾病诊断与治疗的方法技术体系,其中通过静脉滴注对患病长江江豚进行治疗的技术在国内处于领先水平。综上所述本研究首次系统阐明了长江江豚细菌性疾病的流行特点;初步探明了长江江豚病料样本病毒群落的结构和组成,并首次发现了大量的长江江豚源病毒;揭示了6种常见致病菌的生物学特性,提供了细菌性疾病药物治疗和疫苗研发的参考信息;建立了迁地保护区长江江豚饲养管理和疾病诊疗的技术规范。饲养管理和疾病防控是迁地保护区长江江豚管理的两个重要方面,也是当前长江江豚保种面临的主要问题,知己（不断提高长江江豚的饲养管理和疾病防治水平等）和知彼（掌握长江江豚传染性疾病的流行特点、病原的生物学特性、长江江豚生长特性和各个生长阶段的饲养管理要点等）,方能有效解决长江江豚在迁地保护过程中疾病防控盲目和饲养管理欠缺的现状,为长江江豚、中华白海豚等鲸类动物的健康成长和种群繁育提供理论支持。
郎朗[4]（2020）在《河南华溪蟹ShToll1和ShToll3对镉暴露和嗜水气单胞菌攻毒的免疫应答研究》文中进行了进一步梳理Toll信号通路是无脊椎动物先天性免疫中的重要一环,对于无脊椎动物抵抗细菌、真菌和病毒等感染具有重要作用。虽然,在甲壳动物中已经鉴定出一些Toll基因,但是在河南华溪蟹（Sinopotamon henanense）中还没有发现。此外,镉（cadmium,Cd）对Toll基因的影响,在生活于底泥中、易累积重金属的溪蟹类中尚未见报道。我们对河南华溪蟹肝胰腺组织的转录组分析发现,Cd暴露使Toll3基因表达降低。因此,本课题将从以下四个方面对河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因在Cd暴露和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）攻毒的应答模式进行研究。主要研究内容包括以下四个方面:1.河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因的序列分析与分布模式。通过RACE方法,克隆获得Shtoll1和Shtoll3基因全长序列;预测ShToll1和ShToll3的蛋白结构域,分析ShToll1和ShToll3蛋白各功能结构域的特点;同时,构建相似物种间的系统发育进化树,预测ShToll1和ShToll3的进化地位,并推测它们的功能。同时,取河南华溪蟹血淋巴、鳃、肝胰腺、中肠、肌肉、精巢和卵巢7种组织,提取总RNA并反转录成cDNA,设计特异性引物,用qPCR方法检测Shtoll1和Shtoll3在7种组织的分布模式,分析Shtoll1和Shtoll3参与免疫应答的目标组织。2.建立嗜水气单胞菌攻毒模型和分析河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3基因的应答模式。对获得的嗜水气单胞菌菌株进行毒力基因检验,将具有毒力的菌株扩大培养并保存;测定嗜水气单胞菌菌株的菌落形成单位（colony-forming unit,CFU）,并构建其与菌液浓度OD600的线性关系;通过统计嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹死亡个体数,计算出嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹的半数致死浓度LD50,构建嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹的攻毒模型。通过qPCR方法,分析Shtoll1和Shtoll3基因应答嗜水气单胞菌攻毒的表达模式。3.分析河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因对镉暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答模式。河南华溪蟹经Cd暴露7 d并注射嗜水气单胞菌24 h后,提取河南华溪蟹鳃、中肠、血淋巴细胞和肝胰腺四种组织的总RNA并反转录成cDNA;采用qPCR方法,检测河南华溪蟹鳃、中肠、血淋巴细胞和肝胰腺四种组织中,Shtoll1和Shtoll3基因应答Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的表达模式;同时,通过免疫组化方法,分析河南华溪蟹ShToll1蛋白在血淋巴细胞、ShToll3蛋白在中肠和鳃组织中对Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答模式。4.通过功能缺失手段验证河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因对镉暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答模式。合成分别用于RNAi干扰Shtoll1和Shtoll3的siRNA,并验证干扰效率。利用western blotting方法,比较RNAi干扰河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3前后,ShToll1和ShToll3蛋白对Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答变化;同时,利用qPCR方法,分析在RNAi干扰Shtoll1和Shtoll3后,河南华溪蟹Toll信号通路下游AMPs对Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答变化。综上所述,主要研究结果如下:第一,河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因的序列分析与分布模式。河南华溪蟹Shtoll1全长4746 bp,其中编码区（open reading frame,ORF）3033 bp,可编码含1011个氨基酸的蛋白;Shtoll3全长4488 bp,其中编码区3693 bp,可编码含1230个氨基酸的蛋白。ShToll1和ShToll3具有典型的Toll结构,即胞外LRR重复结构、跨膜结构和胞内TIR结构。ShToll1和ShToll3胞外LRR结构符合"xLxxLxLxxNxφxxφxxxxFxx"的保守序列模式。ShToll1与大部分甲壳动物Toll1和Toll2聚为一类,ShToll3与甲壳动物Toll3聚为一类。全长序列同一性结果显示ShToll1与CmToll的同一性最高为68.59%,与DmToll3的同一性最低为22.71%;ShToll3与PtToll3的同一性最高为93.22%,与DmToll2的同一性最低为39.31%。组织分布模式结果显示ShToll主要分布在河南华溪蟹血淋巴细胞中,ShToll3主要分布在鳃组织中。第二,建立嗜水气单胞菌攻毒模型和分析河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3基因的应答模式。嗜水气单胞菌菌株检测到了aerA、hlyA、alt、ast、ahpB、lip和fla七个毒力基因,其菌落形成单位为3.82×106 cfu/mL,其与OD600的关系为y=0.191x+0.045（R2=0.973）,其攻毒河南华溪蟹的LD50为5.2×105 cfu/mL。成功构建了嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹的攻毒模型。嗜水气单胞菌攻毒6 h后,Shtoll1在血淋巴细胞中表达量升高,攻毒3 h后,Shtoll1在中肠组织中表达量升高,攻毒3、6、12 h后,Shtoll1在肝胰腺组织中表达量升高;嗜水气单胞菌攻毒12 h后,Shtoll3在中肠组织中表达量下降。第三,分析河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因对镉暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答模式。qPCR和免疫组化实验结果显示,在河南华溪蟹血淋巴细胞中,29 mg/L浓度Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒使Shtoll1表达量升高,Shtoll1主要在血淋巴细胞中应答Cd暴露。在鳃和中肠组织中,14.5 mg/L浓度Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒使ShToll3表达量升高,ShToll3主要在鳃和中肠等上皮细胞组织应答Cd暴露。免疫组化结果表明,Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒,使河南华溪蟹血淋巴细胞中ShToll1显色加深;鳃组织中ShToll3显色加深;而中肠组织中ShToll3显色无明显变化。第四,通过功能缺失手段验证河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因对镉暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答模式。成功合成了RNAi干扰河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3的siRNA,且在血淋巴细胞中,Shtoll1的干扰效率为90%;在鳃和中肠中,Shtoll3的干扰效率分别为68%和78%。分别干扰河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3后,在Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒条件下,ShToll1和ShToll3蛋白水平表达量得到抑制。干扰河南华溪蟹ShToll1后,检测到Toll信号通路下游抗菌肽alf5、alf6和c-lys可能通过Shtoll1参与Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的免疫应答;干扰河南华溪蟹Shtoll3后,检测到Toll信号通路下游抗菌肽crustin和c-lys可能通过Shtoll3参与Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的免疫应答。
朱璐丹[5]（2020）在《秦皮素对嗜水气单胞菌的抗感染机制研究》文中进行了进一步梳理嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是一种常见的条件致病菌,能引起淡水鱼类出血、败血、肠炎等疾病。对嗜水气单胞菌病的传统治疗方案以抗生素为主,然而抗生素的不规范使用不仅会造成病原菌耐药性增强,甚至会引起人们对水产品食用安全性的担忧。因此,研究和开发新型抗菌药物成为一项迫切的任务。在水产养殖细菌性疾病的预防和治疗领域,对中草药及其提取物的研究越来越多。秦皮素（fraxetin）别名白蜡树内酯,是中草药秦皮的有效成分,是一种天然的香豆素类化合物,具有抗病原微生物、抗氧化、抗炎以及抗肿瘤等多种药理活性。本研究通过测定秦皮素对嗜水气单胞菌最低抑菌浓度（MIC）、生长曲线以及非抑菌浓度下对其脂肪酶活性、运动能力、蛋白酶活性和溶血能力等毒力相关表型的影响,来探讨秦皮素的体外抑菌机制;采用MTT法测定秦皮素对草鱼肾脏细胞（CIK）的细胞毒性;通过检测秦皮素对团头鲂（Megalobrama amblycephala）感染嗜水气单胞菌后的血液生化指标、抗氧化能力的影响,来分析秦皮素对感染嗜水气单胞菌鱼体的保护机制。主要研究结果如下:1.以含药培养基培养嗜水气单胞菌24 h后,观察到秦皮素浓度为128μg/m L和256μg/m L的培养液澄清透明,表明秦皮素对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度为128μg/m L。此外,在秦皮素浓度≥16μg/m L时,能显着抑制嗜水气单胞菌生长（P<0.05）,并且对嗜水气单胞菌的抑制效果与秦皮素浓度呈正相关。而在非抑菌浓度下,对嗜水气单胞菌的运动能力和的溶血能力无显着影响（2～8μg/m L,P>0.05）,但对嗜水气单胞菌的脂肪酶活性（8μg/m L）和蛋白酶活性（2～8μg/m L）有显着抑制作用（P<0.05）。2.细胞毒性研究显示:秦皮素作用CIK细胞2 h时,秦皮素（1μg/m L～256μg/m L）对CIK细胞活性无显着性影响（P>0.05）;作用时间延长至24 h时,秦皮素浓度≥32μg/m L会对细胞活性产生显着影响（P<0.05）,其IC50为83.22μg/m L;当作用时间进一步延长至48 h时,秦皮素浓度≥16μg/m L即会对细胞活性产生显着影响（P<0.05）,其IC50为59.72μg/m L。3.鱼体试验结果表明,试验腹腔注射的秦皮素能提高团头鲂存活率。秦皮素浓度在16μg/g和4μg/g时,对鱼体保护效果较好。秦皮素（64?g/g、16?g/g和4?g/g）对鱼体血浆GLU含量无明显影响（P>0.05）,但能显着降低其血浆TG和补体C3含量（P<0.05）;秦皮素（64?g/g和4?g/g）能显着降低嗜水气单胞菌感染引起的血液TC、TP和ALB含量升高（P<0.05）。秦皮素给药（64?g/g、16?g/g和4?g/g）能明显提高感染引起的血液ALP活性降低（P<0.05）,以及降低感染引起的AST活性升高（P<0.05）。与抗生素治疗方案相比,秦皮素给药（64?g/g、16?g/g和4?g/g）后能明显降低LDH活性（P<0.05）,仅在秦皮素浓度为64?g/g时观察到ALT活性升高的现象（P<0.05）。肝脏抗氧化能力指标结果为:嗜水气单胞菌感染使团头鲂肝脏T-SOD活力明显下降（P<0.05）;秦皮素在低浓度处理（16?g/g和4?g/g）时,能缓解T-SOD活力的降低,效果与抗生素处理相当,但在高浓度（64?g/g）时,T-SOD活力出现了进一步降低的现象（P<0.05）。秦皮素给药（64?g/g、16?g/g和4?g/g）时,能显着提高由于感染造成的CAT活力降低（P<0.05）,其效果明显优于抗生素处理。抗生素和秦皮素处理均不能显着改善感染所致的GSH含量降低（P>0.05）,秦皮素浓度为16?g/g时,效果比抗生素处理稍差（P<0.05）。秦皮素给药（16?g/g和4?g/g）时,团头鲂肝脏MDA含量均显着下降（P<0.05）,其抗脂质过氧化的能力比抗生素更好。组织基因表达结果为:秦皮素给药（64?g/g和16?g/g）时,能显着性下调感染嗜水气单胞菌后鱼体肝脏组织中Nrf2、Keap1、SOD和GSH-Px表达（P<0.05）,显着下调其CAT表达量（P<0.05）。感染组的脾脏Nrf2、Keap1、GSH-Px、CAT和SOD表达量均显着性上调（P<0.05）,而在进行药物治疗后（秦皮素64?g/g、16?g/g、4?g/g和恩诺沙星20?g/g）,脾脏中Nrf2、Keap1、GSH-Px、CAT和SOD表达量均显着性下调（P<0.05）。在秦皮素给药（64?g/g）时,显着性下调被感染鱼体肾脏中Keap1和CAT表达（P<0.05）。
蒋艳红[6]（2020）在《灭活嗜水气单胞菌刺激草鱼肾细胞（CIK）转录组研究及免疫相关分析》文中提出草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国重要的淡水养殖鱼类,其产量及产值在最近几年一直位于淡水养殖鱼类前列。然而当前病害问题已成为制约草鱼养殖业发展的瓶颈,其中由嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）引发的败血症一直是草鱼养殖过程中的重要疾病。本研究从理论和实际两方面考虑,立足我国国情,以草鱼肾细胞（C.idellus kidney,CIK）为研究对象,开展以发掘草鱼免疫相关基因为目标的转录组研究。以期为今后草鱼相关基因的克隆和草鱼免疫学研究,尤其是草鱼细菌性败血症的发病机理提供重要的基础理念。本研究采用CCK-8和ELISA检测试剂盒分别测定CIK细胞经热灭活嗜水气单胞菌刺激后的细胞活力和相关酶活指标;依据半定量RT-PCR技术确定灭活病原菌刺激CIK细胞的最适浓度和最佳时长,并对该刺激条件下的细胞样品进行转录组测序;利用Illumina测序技术构建了CIK细胞经灭活病原菌刺激后的转录组文库,结合生物信息学分析的方法,探究CIK细胞的抗菌免疫应答机制。主要结果如下:1.在细胞活力测定中,随着刺激时间的延长,CIK细胞数目逐渐减少,细胞活性逐渐减弱,12 h后显现出较强的细胞毒性效应,其活力指数降至0.05以下。2.以MOI=100的灭活病原浓度刺激CIK细胞0、1、3、6、9、12、24 h后,细胞总抗氧化水平、超氧化物歧化酶活性、酸性磷酸酶活性随时间的变化均呈现先显着升高（P<0.05）,继而下降,后显着升高（P<0.05）的趋势。表明在受到刺激的早期阶段,CIK细胞启动自身防御机制来抵御病原菌引起的氧化应激,而在刺激中期,细胞总抗氧化水平明显降低,可能是CIK细胞产生过量的活性氧簇,自身抗氧化系统无法抵御氧化应激造成的损伤,从而导致总抗氧化能力下降。3.半定量RT-PCR结果显示,目的基因IFN-γ2和NF-κB2的表达量在不同灭活病原菌浓度和刺激时长下存在差异（P<0.05）。目的基因在灭活病原菌浓度MOI=10,刺激时长为1小时的条件下表达量均较高,在灭活病原菌浓度MOI=10,刺激时长为6小时的条件下表达量均较低;于是选择这两个处理条件下的细胞样品和对照组细胞（未加菌刺激）进行后续的转录组测序工作。4.转录组分析共检测到表达基因30430个,其中已知基因23241个,新基因7189个。三组样品（A,刺激1 h样品组;B,刺激6 h样品组;未刺激对照样品组）共确定有差异表达基因1046个,与对照组相比,A组中566个基因表达上调,165个基因表达下调;B组中453个基因表达上调,183个基因表达下调;321个基因在两个处理组中呈现共同表达。5.利用数据库GO和KEGG对1046个差异基因行使的功能进行分类,发现多个基因参与到受体识别、细胞吞噬、凝血与补体级联反应等固有免疫应答反应中。"ck VS A"与"ck VS B"两个差异基因集中基因GO功能注释率较高的几个条目为:细胞代谢（cellular process和single-organism process）、应激反应（response to biotic stimulus）、细胞组成（cell和cell part）和结合功能（binding）;差异基因富集率较高的KEGG代谢通路为:信号转导（Signal transduction）、癌症通路（Cancers:Overview）和免疫系统（Immune system）。功能分类结果表明差异表达基因在病原识别,细胞表面受体信号,免疫防御反应等免疫进程中起重要的调节作用。6.关键免疫功能基因筛选及部分差异基因的qRT-PCR验证通过对"ck VS A"与"ck VS B"两个差异基因集中注释到免疫系统（Immune system）代谢通路中的基因进行表达相关性分析,筛选出12个与免疫功能相关的关键基因。从转录组数据中筛选注释到“免疫系统”代谢通路中的5个差异基因进行qRT-PCR分析,以验证本研究转录组测序结果的准确性。本研究通过RNA-seq的方法对CIK细胞受到灭活嗜水气单胞菌刺激后的转录模式有了一定了解,系统筛选鉴定了CIK细胞中与抗菌应答相关的免疫功能基因及调控通路。我们认为这些重要的免疫相关基因可以为草鱼细菌性败血症的发病机理研究提供重要的参考信息,为草鱼抗病品系的培育提供遗传学参考。
邸军[7]（2020）在《鲟细菌性败血症病原学及其防治研究》文中研究指明鲟形目（Acipenseriformes）鱼类是硬骨鱼纲中唯一现存的大型软骨硬鳞鱼类,具有极高的科学价值和经济价值。受过度捕捞、水利工程建设、栖息地破坏等人类活动的影响,全球27种鲟鱼类中已有25种处于不同程度的濒危状态。为拯救濒危的鲟鱼类,同时满足市场对鲟鱼子酱日益增长的需求,许多国家和地区先后开展了鲟鱼的人工养殖,全球鲟鱼养殖业蓬勃发展。自2003年以来,我国已经成为全球最大的鲟鱼养殖国。然而,随着鲟鱼种质资源的衰退和集约化养殖程度的不断提高,鲟鱼病害问题日益凸显,严重制约着濒危鲟人工保种及鲟鱼养殖业的可持续发展。本文主要针对湖北省3个养殖基地中华鲟（Acipenser sinensis）成鱼和幼鱼爆发的细菌性败血症,开展病原生物学、病理学、致病机制等方面的研究。同时,从健康的中华鲟和长江鲟（Acipenser dabryanus）肠道中分离筛选潜在的益生菌,以期为鲟鱼频发的细菌性疾病的防治提供科学依据。本研究采用的主要方法和得到的主要结果如下:1.2015至2017年间,湖北省3个养殖基地子二代中华鲟成鱼和幼鱼发生了严重的细菌性败血症。采用传统的病原菌分离培养方法,从濒死的中华鲟肝脏和脾脏中分离获得11株优势菌株。根据科赫法则人工感染健康的长江鲟,发现其中9株为致病菌,且从受感染的长江鲟肝脏中再次分离得到相同的病原菌。通过对菌株形态特征,生理生化特征,16S rRNA、gyrB、rpoD基因序列及系统发育树分析,确定9株病原菌均为运动性气单胞菌,且以维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）和嗜水气单胞（Aeromonas hydrophila）为主。另外,观察了长江鲟感染维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌后的组织病理变化,并对2种病原菌进行了药物敏感性分析。组织病理学研究表明,长江鲟感染嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌后表现出相似的病理特征,即肝脏实质细胞坏死、局灶性出血;脾脏红髓和白髓坏死;肾小球水肿、肾小管上皮细胞凝固性坏死;肠道粘膜脱落、结构完整性被破坏。药物敏感性试验结果表明,嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌均对氟喹诺酮类、第三代和第四代头孢类抗生素敏感,而对苯唑西林、氨苄西林、青霉素等抗生素耐药。2.为探究嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌对鲟鱼的致病机制,对长江鲟人工感染上述2种病原菌前后的脾脏组织进行转录组学分析。高通量测序共获得410996612条Clean reads,组装成26939820条Contigs,521713条Transcripts,254211条Unigenes。差异表达基因分析表明,嗜水气单胞菌感染组长江鲟的脾脏共有5574个显着性差异表达基因,其中2716个基因上调表达,2854个基因下调表达;维氏气单胞菌感染组长江鲟的脾脏共有1724个显着性差异表达基因,其中835个基因上调表达,889个基因下调表达,两组共有差异表达基因1087个。进一步分析表明,嗜水气单胞菌感染组长江鲟脾脏的差异表达基因主要富集于8条免疫相关的信号通路中,分别是Toll-like受体信号通路、吞噬体、细胞因子与细胞因子受体相互作用、溶酶体、肠道IgA产生的免疫网络、神经活性配体与受体相互作用、单纯疱疹感染和Jak-STAT受体信号通路;维氏气单胞菌感染组长江鲟脾脏的差异表达基因主要富集于5条免疫相关的信号通路中,分别是吞噬体、细胞因子与细胞因子受体相互作用、神经活性配体与受体相互作用、溶酶体和单纯疱疹感染。最后,随机挑选6个免疫相关的差异表达基因（LTBR、MHC2、Integrin、CD40L、V-type ATPase和CDH3）进行实时荧光定量PCR验证,发现荧光定量PCR与转录组分析结果的表达趋势基本一致,从而证明了转录组测序结果的可靠性。3.为探究嗜水气单胞菌感染对长江鲟肠道菌群的影响,采用Illumina Miseq高通量测序技术比较分析了嗜水气单胞菌感染组（患病组）和对照组（健康组）长江鲟肠道菌群的差异。基于Unweighted unifrac距离算法的主成分分析（PCoA）比较健康组和患病组长江鲟肠道菌群的结构差异。结果显示,健康组和患病组长江鲟的肠道菌群分布于不同的聚类群,表明嗜水气单胞菌感染对长江鲟肠道菌群结构造成了明显的改变。进一步分析表明,患病组长江鲟的肠道菌群Alpha多样性指数（Invsimpson index）显着性低于健康组（P<0.05）。群落组成分析表明,患病组长江鲟肠道菌群中梭杆菌门（Fusobacteria）、软壁菌门（Tenericutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度明显高于健康组,而厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）丰度明显低于健康组。最后,对健康组和患病组长江鲟肠道菌群中的差异物种进行组间Wilcox秩和检验分析。结果显示,患病组长江鲟肠道菌群中支原体属（Mycoplasma）的丰度显着性高于健康组（P<0.05）,而芽孢杆菌属（Bacillus）的丰度显着性低于健康组（P<0.05）。4.本研究旨在从健康的中华鲟和长江鲟肠道中分离筛选具有益生特性的芽孢杆菌,以增强鲟鱼的免疫力和抗病性。结果显示,从健康的长江鲟肠道中分离获得3株芽孢杆菌（BSth-1、BSth-4和BSth-5）;健康的中华鲟肠道中分离获得1株芽孢杆菌（BSth-19）。通过对菌株形态特征,生理生化特征,16S rRNA、gyrB基因序列及系统发育树分析,确定4株分离菌株均为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。为探究分离获得的菌株是否具有饲料添加剂的特性,开展了体外抑菌试验、体外产酶试验、芽孢对肠道内环境（低pH和高浓度胆汁）耐受性试验及动物安全性试验。结果表明,枯草芽孢杆菌BSth-5和BSth-19均可以产生蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶,并对4种中华鲟病原菌,即嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌（Aeromonas media）和海豚链球菌（Streptocccus iniae）具有明显的拮抗作用。同时,枯草芽孢杆菌BSth-5和BSth-19能够耐受pH=3.0的酸性环境和5.0%长江鲟胆汁酸环境。动物安全性试验结果表明,枯草芽孢杆菌BSth-5和BSth-19对长江鲟均无致病性。为探究筛选得到的枯草芽孢杆菌对长江鲟生长性能、非特异性免疫反应、肠道消化酶活性及抗病性的影响。将360尾健康的长江鲟幼鱼随机分成3组,每组3个平行,每个平行40尾鱼。对照组（C）投喂鲟鱼基础饲料;试验组T1和T2分别投喂添加了2.0×108 CFU/g枯草芽孢杆菌BSth-5和BSth-19的鲟鱼基础饲料,试验期为8周。投喂4周和8周后测定试验鱼的生长性能,结果表明,投喂4周和8周后试验组（T1和T2）的终末体重、增重率、特定生长率与对照组无显着性差异（P>0.05）,而存活率均显着性高于对照组（P<0.05）。投喂4周和8周后测定试验鱼的血清免疫酶活性,结果显示,投喂8周后试验组（T1和T2）的总抗氧化能力（T-AOC）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和免疫球蛋白M（IgM）活性均显着性高于对照组（P<0.05）。投喂4周和8周后试验组T1的溶菌酶（LZM）活性显着性高于对照组（P<0.05）,而T2组与对照组间无显着性差异（P>0.05）。投喂4周后试验组（T1和T2）的丙二醛（MDA）含量显着性低于对照组（P<0.05）。投喂8周后测定试验鱼的肠道消化酶活性,结果显示,试验组（T1和T2）的肠道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均高于对照组,但无显着性差异（P>0.05）。投喂8周后对试验鱼进行嗜水气单胞菌人工感染试验,结果显示,试验组T1存活率最高为66.67%,试验组T2次之为53.33%,对照组为33.33%。5.为探究投喂枯草芽孢杆菌BSth-5和BSth-19对长江鲟肠道菌群的影响,采用Illumina Miseq高通量测序技术对投喂8周后的试验组和对照组长江鲟肠道菌群进行了比较分析。基于Unweighted unifrac距离算法的主成分分析（PCoA）比较试验组和对照组长江鲟肠道菌群的结构差异。结果显示,试验组（T1和T2）和对照组长江鲟肠道菌群分布于不同的聚类群,表明投喂枯草芽孢杆菌对长江鲟的肠道菌群结构造成了明显的改变。进一步分析表明,试验组（T1和T2）长江鲟肠道菌群Alpha多样性指数（Shannon index和Chao index）均高于对照组,且试验组T1与对照组之间存在显着性差异（P<0.05）。群落组成分析表明,试验组（T1和T2）长江鲟肠道菌群中厚壁菌门、梭杆菌门、拟杆菌门的丰度明显高于对照组,而变形菌门的丰度明显低于对照组。最后,对试验组和对照组长江鲟肠道菌群中的差异物种进行组间Wilcox秩和检验分析。结果显示,试验组（T1和T2）长江鲟肠道菌群中潜在致病菌属如气单胞菌属（Aeromonas）的丰度显着性低于对照组（P<0.05）,而潜在的益生菌属如芽孢杆菌属（Bacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）的丰度明显高于对照组。综上所述,本研究首次证实中华鲟频发的细菌性败血症的病原为运动性气单胞菌,且以维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌为主,并根据药敏试验筛选出防治中华鲟细菌性败血症潜在的药物;长江鲟人工感染嗜水气单胞菌前后的脾脏转录组分析表明,嗜水气单胞菌可抑制抗原呈递相关因子的表达,并引起宿主细胞的凋亡;通过比较分析健康组和嗜水气单胞菌感染组长江鲟肠道菌群的差异,发现芽孢杆菌可能是长江鲟肠道中潜在的益生菌;随后从健康的长江鲟和中华鲟肠道中分离筛选出具有益生特性的枯草芽孢杆菌BSth-5和BSth-19,分别添加进鲟鱼基础饲料中并投喂长江鲟幼鱼8周后,发现投喂枯草芽孢杆菌可以显着性提高长江鲟的存活率、抗氧化能力、非特异性免疫反应及抗病性;同时,发现投喂枯草芽孢杆菌BSth-5和BSth-19可以提高长江鲟幼鱼肠道菌群中潜在益生菌属的丰度,并显着性降低潜在致病菌属的丰度。
吴振超[8]（2020）在《洛氏鱥肠道产酶益生菌的筛选及其粘附特性分析》文中研究指明目前水产养殖中常用益生菌制剂的菌种多数筛选自畜禽动物肠道或者其生存环境中,这类益生菌在鱼类肠道中的粘附定植效果较差,导致它们对鱼类的益生作用并不理想。因此,从鱼类肠道中筛选鱼源益生菌是解决这一问题的主要途径之一。本研究以吉林省特色经济鱼类洛氏鱥Rhynchocypris lagowskii（Dybowski,1869）为研究对象,从其肠道分离筛选具有产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力的益生菌,通过产酶能力检测、体外抑菌试验及对抗生素敏感性试验筛选出产酶能力强的细菌,进一步通过检测细菌的耐高温能力、耐酸性能力、耐胃液能力、耐肠液能力、耐胆盐能力及菌株安全性对细菌益生特性作出评价,并通过体外粘附模型研究了潜在益生菌的粘附能力和粘附机制。相关试验结果如下:试验一:本试验共从健康洛氏鱥肠道分离出214株细菌,其中具有:产蛋白酶能力的细菌86株,占40.19%;产淀粉酶的细菌53株,占24.77%;产脂肪酶的细菌47株,占21.96%;能同时产三种酶的细菌28株,占13.08%。采用琼脂打孔扩散法测定了15株产酶能力较强的细菌分别对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、大肠杆菌（Escherichia coli）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、爱德华氏菌（Edwardsiella）和温和气单胞菌（Aeromonas sobria）等常见病原菌的拮抗能力。然后根据拮抗试验结果筛选出10株拮抗能力较强的细菌,进一步采用纸片法测定这10株细菌对17种抗生素的敏感性。最终筛选出8株产酶能力和拮抗病原菌能力较强,且携带耐药因子较少的细菌作为潜在益生菌,分别命名为LSG1-1、LSG2-1、LSG2-3-2、LSG2-5、LSG2-8、LSG3-3、LSG3-7和LSG3-8。试验二:结合细菌形态学、生理生化特征和16S r RNA序列分析对8株潜在益生菌进行鉴定,结果显示菌株LSG1-1、LSG2-1、LSG2-3-2、LSG2-5、LSG2-8、LSG3-3、LSG3-7和LSG3-8分别与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subt ilis）、甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezen sis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）、阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）和莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）具有最高的相似性。构建系统发育树进一步分析后最终鉴定8株细菌分别为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和莫海威芽孢杆菌。试验三:体外模拟鱼类肠道消化环境检测细菌的益生特性。通过细菌的耐高温试验、耐酸性试验、耐胆盐试验、耐胃液试验、耐肠液试验和安全性检测试验对细菌的益生特性作出评价。试验结果显示:各菌株均具有良好的耐受性。其中LSG2-1和LSG2-8对高温的耐受能力显着高于其它菌株（P<0.05）,而LSG2-3-2和LSG3-6对高温的耐受能力显着较低（P<0.05）;LSG3-7耐酸能力显着较高（P<0.05）,LSG2-5耐酸能力显着较低（P<0.05）;LSG3-7对胃液的耐受能力显着较高（P<0.05）,LSG2-1和LSG3-8对胃液的耐受能力显着较低（P<0.05）;LSG2-5对肠液耐受能力较高（P<0.05）,LSG3-8的对肠液的耐受能力显着较低（P<0.05）;LSG3-6对胆盐的耐受能力较高（P<0.05）,LSG2-3-2对胆盐的耐受能力显着较低（P<0.05）。菌株的安全性试验结果表明各菌株对洛氏鱥均有很好的安全性。试验四:采用洛氏鱥的肠道黏液蛋白建立体外肠道黏液蛋白模型,结合荧光标记物hoechst3325标记细菌法,检测了8株潜在益生菌对洛氏鱥肠道黏液蛋白的粘附能力。试验结果显示:LSG1-1的粘附率为10%,LSG2-1的粘附率为16%,LSG2-3-2粘附率为18%,LSG2-5粘附率为35%,LSG2-8粘附率为36%,LSG3-6粘附率为24%,LSG3-7粘附率为34%,LSG3-8粘附率为33%。再以高碘酸钠、蛋白酶K和胰蛋白酶分别修饰各细菌及洛氏鱥肠道黏液蛋白,分析各细菌表面凝集素和肠道黏液蛋白上粘附受体的主要性质,结果显示:LSG1-1、LSG2-1、LSG2-5、LSG2-8、LSG3-6和LSG3-7细胞表面凝结素主要表现出的是糖蛋白性质,而LSG2-3-2和LSG3-8菌株细胞表面的凝结素主要表现出蛋白质性质;LSG1-1、LSG2-3-2、LSG2-5、LSG2-8和LSG3-6在黏液蛋白中的粘附受体为蛋白质类物质,而LSG2-1、LSG3-7和LSG3-8在黏液蛋白中的粘附受体为糖蛋白类物质。最后分别采用排斥、竞争和取代试验研究了8株潜在益生菌对嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌2株病原菌的粘附抑制作用。结果显示:竞争试验中LSG2-5、LSG2-8和LSG3-6对嗜水气单胞菌的粘附抑制力显着高于其它菌株（P<0.05）,而LSG1-1和LSG2-1对维氏气单胞菌的粘附抑制力显着高于其它菌株（P<0.05）;排斥试验中LSG2-5、LSG2-8和LSG3-6对嗜水气单胞菌的粘附抑制力显着高于其它菌株（P<0.05）,LSG3-8和LSG2-8对维氏气单胞菌的粘附抑制力显着高于其它菌株（P<0.05）;取代试验中LSG2-5、LSG2-8和LSG3-6对嗜水气单胞菌的粘附抑制力显着高于其它菌株（P<0.05）,LSG3-7和LSG2-8对维氏气单胞菌的粘附抑制力显着高于其它菌株（P<0.05）。试验最终筛选出8株洛氏鱥源芽孢杆菌,均具有良好的益生特性。其中LSG3-3特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）、LSG3-7阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）、LSG3-8莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）均是首次在鱼体内筛选出来,具有良好的应用前景。本研究为洛氏鱥益生菌制剂的研发与应用提供了菌株参考和科学依据。
朱泽亮[9]（2020）在《灞河气单胞菌（Aeromonas）抗生素耐药性和重金属抗性研究》文中研究指明气单胞菌（Aeromonas）是一类常见的人畜鱼共患致病菌,广泛存在于自然界,主要通过感染宿主肠道引起宿主发病。且该菌作为一种水源性和食源性致病菌容易大范围流行,严重威胁养殖业发展和大众健康。目前相关行业防治气单胞菌的主要方法之一是使用抗生素。而抗生素滥用引起的抗生素耐药性问题随之显现,在抗生素的长期作用下,抗生素耐药基因（Antibiotic resistance genes,ARGs）在自然环境和菌体中被多次筛选和富集,从而导致细菌的耐药表型水平整体升高。灞河作为西安城区的主要河流之一,是周边人类活动的重要水源地。为了调查灞河水体中气单胞菌的抗生素耐药性情况,本文选用了灞河西安城区段水体及从中筛选的气单胞菌作为研究对象,在2018年6月和2019年8月进行了两次采样,进行了灞河水体中抗生素水平的测定、重金属水平和理化因子的测定;并检测了气单胞菌抗生素的耐药表型以及重金属的耐药表型。最后挑选了部分在耐药表型、种类方面具有代表性的气单胞菌菌株,利用PCR扩增技术定性检测了菌体中抗生素耐药基因(blaTEM、blaSHV、bla CTX-M、blaIMP、blaOXA等)和重金属耐药基因（czc A、cop A、mer A、chr R）的情况,结果如下:（1）灞河中下游水体（S2、S3和S4）中污染情况较上游（S1）更为严重,重金属和抗生素在灞河中下游水体中含量较高。（2）两次采样中重金属耐药表型情况较为稳定,不同位点以及不同采样时间的气单胞菌对同种重金属的最小抑菌浓度均处于同一水平。检测的气单胞菌中大部分都对头孢噻肟、头孢吡肟、磺胺甲恶唑和美罗培南这4种抗生素有着较强耐药性,对氯霉素和喹诺酮类抗生素较为敏感。（3）定性检测的29种耐药基因有26种被检出,其中四种重金属耐药基因均被检出,β-内酰胺类抗生素耐药基因的blaOXA和blaIMP以及喹诺酮类抗生素耐药基因qnr B在所有菌株中均未检出,blaTEM是所有种类的气单胞菌中检出率最高的β-内酰胺类基因。表明气单胞菌是环境中部分耐药基因的储存库,且嗜水气单胞菌检出了高比例和多种类的抗生素和重金属耐药基因,是耐药基因的主要传播者。（4）不同采样点环境条件或是菌种的改变会导致耐药基因的分布产生差异,外界环境理化因子的污染会导致水体中细菌耐药基因增多,引起细菌耐药性情况的加重。
郭玉丹[10]（2019）在《细鳞鱼三种细菌的快速检测方法的建立》文中认为细鳞鱼（Brachymystax lenok）属鲑形目（Salmoniformes）,鲑形科（Salmonidae）,鲑亚科（Salmoninae）,细鳞鱼属（Brachymystax）,近年来野生细鳞鱼分布范围逐渐缩小,野生种群急剧衰退,为了阻止该种群灭绝,对细鳞鱼保护和驯养显得尤为重要,在细鳞鱼驯养繁育中发现细鳞鱼会出现厌食、独居、水中打转、体表溃疡和肝肾脏出血症状,从患病鱼肝、肾、肠液和鳃中分离出三种细菌,它们分别是温和气单胞菌（Aeromonas sobria,AS）、迟钝爱德华菌（Edwardsiella tarda,Et）和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,AH）。迫切需要一种快捷、简便方法对病原菌进行准确、快速诊断,用于疫病早期预防和治疗。目的:建立一种快速检测三种菌的方法,及时早发现细鳞鱼感染的这三种细菌,阻止细鳞鱼疫情暴发和大规模蔓延,为细鳞鱼驯化带来保障。方法:本试验取患病鱼的肝、肾、肠积液或者腮丝经过一系列的分离纯化得到了三种菌株,使用四种鉴别培养基,根据在培养基上的形态特征初步确定菌株种类,并用20余种抗生素进行药敏实验,使用16S rRNA来对分离纯化后的菌进行测序。利用环介导恒温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）建立嗜水气单胞菌、迟钝爱德华菌、温和气单胞菌的快速检测方法。针对嗜单胞菌pilin基因、迟钝爱德华菌eth A基因、温和气单胞菌的zipA基因设计特异性LAMP引物。每种菌设计五套引物进行优化筛选,反应体系是25μL,其中环引物浓度为40 pmol,内引物浓度为40 pmol,外引物反应浓度为5 pmol,缓冲液浓度为2.5 mol/L,镁离子浓度为150 mmol/L,dNTP浓度为10 mmol/L,聚合酶浓度为8U,模板为2μL,补加去离子水至25μL,在61-65℃之间设定温度梯度,优化出最佳的反应温度,在该恒温条件下进行LAMP扩增,进而优化出最佳镁离子、缓冲液、引物比例和dNTP的量,采用琼脂糖电泳和核酸染料颜色法对扩增结果进行比较判定。将模板DNA进行10倍倍比稀释以后,分别用10-11至10-2倍比稀释的DNA为模板来检测其灵敏性;提取杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌的基因组DNA作为模版,用上述优化体系进行反应,观察有无白色沉淀,加入染料后有无颜色变化和梯形条带,检验建立的方法特异性;将建立的LAMP方法与传统鉴定方法和实时荧光定量方法比较,检测所建立LAMP方法的准确性。结果:建立的LAMP快速检测方法中每种菌筛选出一套最佳引物,最佳反应体系是环引物浓度为40 pmol,内引物浓度为30 pmol,外引物反应浓度为5 pmol,缓冲液浓度为2.5 mol/L,镁离子浓度为150 mmol/L,dNTP浓度为10 mmol/L,聚合酶浓度为8U,模板为2μL,60 min内观察结果。嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和迟钝爱德华菌的最低检出浓度分别是6.35×10-10、1.663×10-9、9.86×10-1010 ng/μL,该方法特异性好、灵敏度高,可将病源检测时间控制在1天以内,传统检测方法所需时间至少两天,实时荧光定量PCR能够扩增浓度为10-1111 ng/μL基因组DNA,但所需加样环境有较高要求,不适宜在基层推广。结论:该方法所需仪器简单、准确高效、操作方便、适宜在临床、生产上推广使用。
二、嗜水气单胞菌研究进展(综述)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、嗜水气单胞菌研究进展(综述)（论文提纲范文）
（1）黄鳝出血病研究进展（论文提纲范文）
| 1 黄鳝出血病的病原及其特性 |
| 1.1 嗜水气单胞菌菌体形态 |
| 1.2 嗜水气单胞菌菌落的形态特征 |
| 1.3 嗜水气单胞菌致病性 |
| 1.4 嗜水气单胞菌致病机理 |
| 2 黄鳝出血病的病征及病理特征 |
| 3 黄鳝出血病病原菌的诊断与检测 |
| 3.1 生化方法 |
| 3.2 免疫学方法 |
| 3.3 分子生物学方法 |
| 4 黄鳝出血病病原菌研究进展 |
| 4.1 黄鳝免疫系统对嗜水气单胞菌侵染的应答机制 |
| 4.2 抗菌肽对嗜水气单胞菌的抑菌作用 |
| 5 黄鳝出血病的防治 |
| 5.1 抗生素 |
| 5.2 中药 |
| 5.3 全菌灭活苗 |
| 5.4 养殖管理 |
| 6 结论 |
（2）抗嗜水气单胞菌三味中药水煎液及联用对鲫鱼免疫效果的评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 嗜水气单胞菌的研究进展 |
| 1.1 嗜水气单胞菌 |
| 1.2 毒力因子 |
| 第二章 中药及其在水产中应用的研究现状 |
| 1.1 中药抑制嗜水气单胞菌的研究进展 |
| 1.2 中药防治水产动物疾病的研究进展 |
| 1.3 中药促进水产动物相关免疫活性的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 三种中药水煎液及联用对嗜水气单胞菌的体外抑制试验 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 第二章 三味中药水煎液及联用免疫保护作用研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）患病江豚微生态变化及迁地背景下江豚保护性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 长江江豚概况 |
| 1.1 江豚分类 |
| 1.2 江豚的地理分布 |
| 1.3 长江江豚的生活习性及特征 |
| 1.4 长江江豚现状 |
| 1.5 长江江豚保护生物学研究进展 |
| 2 长江江豚迁地保护概述 |
| 2.1 迁地保护 |
| 2.2 江豚迁地保护历史 |
| 2.3 长江江豚迁地保护现状 |
| 2.3.1 湖北石首天鹅洲江豚保护区天鹅洲故道江豚繁育群体 |
| 2.3.2 安徽铜陵淡水豚保护区夹江江豚繁育群体 |
| 2.3.3 安徽安庆西江迁地保护区江豚繁育群体 |
| 2.3.4 湖北何王庙/湖南集成垸迁地保护区江豚繁育群体 |
| 2.3.5 中国科学院水生生物研究所白鱀豚馆人工养殖种群 |
| 2.4 长江江豚迁地保护面临的问题 |
| 2.4.1 半自然水域长江江豚的繁殖生物学研究欠缺 |
| 2.4.2 长江江豚疫病防控体系不健全 |
| 2.4.3 人工调控和生态补偿机制不足 |
| 2.4.4 人为伤害和气候条件是潜在的致危因素 |
| 3 鲸豚类动物疾病研究进展 |
| 3.1 海洋鲸豚类动物细菌性疾病研究进展 |
| 3.2 海洋鲸豚类动物病毒性疾病研究进展 |
| 3.2.1 鲸豚源麻疹病毒 |
| 3.2.2 鲸类痘病毒 |
| 3.2.3 鲸类乳头状瘤病毒 |
| 3.2.4 疱疹病毒/类疱疹病毒 |
| 3.2.5 流感病毒 |
| 3.2.6 其他病毒 |
| 3.3 海洋鲸豚类动物真菌性疾病研究进展 |
| 3.4 海洋鲸豚类动物寄生虫性疾病研究进展 |
| 4 长江江豚疾病研究概况 |
| 4.1 长江江豚疾病研究现状 |
| 4.1.1 解剖学研究 |
| 4.1.2 血液生理学研究 |
| 4.1.3 饲养管理研究 |
| 4.1.4 疾病相关研究 |
| 4.2 有关长江江豚疾病防控的几点讨论 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 第二部分 试验部分 |
| 第一章 长江江豚细菌性疾病流行病学调查 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 试验试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品采集 |
| 2.2.2 长江江豚源细菌的分离鉴定 |
| 2.2.3 长江江豚肠道菌群16SrDNA测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 长江江豚细菌性样品采集结果 |
| 3.2 细菌分离鉴定结果 |
| 3.2.1 呼吸孔样本细菌分离鉴定结果 |
| 3.2.2 粪便样本细菌分离鉴定结果 |
| 3.2.3 内脏组织细菌分离鉴定结果 |
| 3.2.4 皮肤病灶细菌分离鉴定结果 |
| 3.2.5 腹腔积液细菌分离鉴定结果 |
| 3.2.6 胸腔积液细菌分离鉴定结果 |
| 3.2.7 血液样本细菌分离鉴定结果 |
| 3.3 细菌分离培养形态及染色镜检结果 |
| 3.4 细菌理化鉴定结果 |
| 3.5 细菌PCR鉴定结果 |
| 3.6 长江江豚肠道菌群16SrDNA测定结果 |
| 3.6.1 测序数据处理 |
| 3.6.2 OTU分析和物种注释 |
| 3.6.3 各样品细菌多样性及相关性分析 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 长江江豚样品采集方法和处理方法的选择 |
| 4.2 水生哺乳动物细菌性疾病检测方法 |
| 4.3 长江江豚细菌性疾病流行情况 |
| 4.4 江豚呼吸道菌群与疾病的相关性 |
| 4.5 江豚胃肠道菌群与疾病的相关性 |
| 4.6 长江江豚的主要致病菌 |
| 5 总结 |
| 第二章 长江江豚主要致病菌生物学特性研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 细菌样本 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 试验试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细菌培养特性观察 |
| 2.2.2 细菌理化特性鉴定 |
| 2.2.3 PCR扩增和测序 |
| 2.2.4 基因序列分析 |
| 2.2.5 药物敏感性试验 |
| 2.2.6 细菌致病性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 嗜水气单胞菌YHA-AQ株生物学特性研究结果 |
| 3.1.1 嗜水气单胞菌YHA-AQ株细菌培养特性 |
| 3.1.2 嗜水气单胞菌YHA-AQ株理化特性鉴定结果 |
| 3.1.3 嗜水气单胞菌YHA-AQ株遗传进化关系 |
| 3.1.4 嗜水气单胞菌YHA-AQ株药物敏感性试验结果 |
| 3.1.5 嗜水气单胞菌YHA-AQ株小鼠致病力试验 |
| 3.2 维氏气单胞菌YVA-AQ株生物学特性研究结果 |
| 3.2.1 维氏气单胞菌YVA-AQ株细菌培养特性 |
| 3.2.2 维氏气单胞菌YVA-AQ株理化特性鉴定结果 |
| 3.2.3 维氏气单胞菌YVA-AQ株遗传进化关系 |
| 3.2.4 维氏气单胞菌YVA-AQ株药物敏感性试验结果 |
| 3.2.5 维氏气单胞菌YVA-AQ株小鼠致病力试验 |
| 3.3 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株生物学特性研究结果 |
| 3.3.1 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株细菌培养特性 |
| 3.3.2 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株理化特性鉴定结果 |
| 3.3.3 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株遗传进化关系 |
| 3.3.4 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株药物敏感性试验结果 |
| 3.3.5 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株小鼠致病力试验 |
| 3.4 魔氏摩根菌YMM-AQ株生物学特性研究结果 |
| 3.4.1 魔氏摩根菌YMM-AQ株细菌培养特性 |
| 3.4.2 魔氏摩根菌YMM-AQ株理化特性鉴定结果 |
| 3.4.3 魔氏摩根菌YMM-AQ株遗传进化关系 |
| 3.4.4 魔氏摩根菌YMM-AQ株药物敏感性试验结果 |
| 3.4.5 魔氏摩根菌YMM-AQ株小鼠致病力试验 |
| 3.5 大肠杆菌YE-AQ株生物学特性研究结果 |
| 3.5.1 大肠杆菌YE-AQ株细菌培养特性 |
| 3.5.2 大肠杆菌YE-AQ株理化特性鉴定结果 |
| 3.5.3 大肠杆菌YE-AQ株遗传进化关系 |
| 3.5.4 大肠杆菌YE-AQ株药物敏感性试验结果 |
| 3.5.5 大肠杆菌YE-AQ株小鼠致病力试验 |
| 3.6 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株生物学特性研究结果 |
| 3.6.1 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株细菌培养特性 |
| 3.6.2 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株理化特性鉴定结果 |
| 3.6.3 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株遗传进化关系 |
| 3.6.4 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株药物敏感性试验结果 |
| 3.6.5 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株小鼠致病力试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 长江江豚常见致病菌的培养特性 |
| 4.2 长江江豚源细菌的鉴定方法 |
| 4.3 长江江豚源细菌的耐药性 |
| 4.4 长江江豚源细菌的致病性 |
| 5 结论 |
| 第三章 长江江豚病毒性疾病研究初探 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 病毒性疾病对人和动物的危害 |
| 1.2 长江江豚病毒性疾病研究现状 |
| 1.3 未知病毒检测方法研究进展 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料样本 |
| 2.1.2 试验仪器 |
| 2.1.3 试验试剂耗材 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 试验流程 |
| 2.2.2 测序数据质控 |
| 3 结果 |
| 3.1 测序数据质控 |
| 3.2 去除宿主污染 |
| 3.3 病毒组成分析 |
| 3.4 数据组装 |
| 3.5 病毒序列鉴定 |
| 3.5.1 基于参考序列的鉴定 |
| 3.5.2 Denovo病毒序列鉴定 |
| 3.5.3 基于参考序列鉴定与Denovo序列鉴定的比较 |
| 3.6 病毒丰度 |
| 3.7 基因预测 |
| 3.8 功能分析 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 高通量测序技术与未知病毒检测 |
| 4.2 长江江豚病毒宏基因组学样本的处理 |
| 4.3 检测相关病毒分析 |
| 5 总结 |
| 第四章 长江江豚的饲养管理与疾病防治研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 长江江豚的饲养管理 |
| 2.2.2 长江江豚血液学研究 |
| 2.2.3 长江江豚健康体检方法的建立 |
| 2.2.4 长江江豚疾病诊断与治疗方法研究 |
| 2.2.5 长江江豚典型病例诊治分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 长江江豚的饲养管理 |
| 3.1.1 围网环境下长江江豚的饲养管理 |
| 3.1.2 迁地保护区大面积水域长江江豚的饲养管理 |
| 3.1.3 疗养池长江江豚的饲养管理 |
| 3.2 长江江豚血液学研究 |
| 3.2.1 长江江豚血常规和血液生化指标测定方法的建立 |
| 3.2.2 长江江豚正常生理生化指标参考范围的确定 |
| 3.2.3 长江江豚生理生化指标与其疾病的相关性 |
| 3.2.4 长江江豚健康体检技术规范 |
| 3.2.5 长江江豚疾病诊断与治疗方法研究 |
| 3.2.6 长江江豚典型病例诊治分析 |
| 4 分析与讨论 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（4）河南华溪蟹ShToll1和ShToll3对镉暴露和嗜水气单胞菌攻毒的免疫应答研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1.1 Cd与免疫及信号通路 |
| 1.1.1 Cd与免疫的关系 |
| 1.1.2 参与Cd应答的信号通路 |
| 1.2 Toll的免疫功能 |
| 1.2.1 Toll的发现与结构 |
| 1.2.2 Toll的种类与功能 |
| 1.2.3 Toll的参与的免疫应答 |
| 1.3 无脊椎动物Toll相关研究进展 |
| 1.3.1 昆虫 |
| 1.3.2 甲壳动物 |
| 1.3.3 软体动物 |
| 1.3.4 线虫 |
| 1.4 本学位论文的研究意义与研究内容 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3 基因的克隆、生物信息学分析与组织表达模式 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 数据统计与分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3 基因c DNA全长序列及蛋白结构域分析 |
| 2.2.2 河南华溪蟹ShToll1和ShToll3 氨基酸序列系统进化树与LRR-TM-TIR结构 |
| 2.2.3 河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3 基因的组织分布情况 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3 基因序列结构 |
| 2.3.2 河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3 基因在各组织的分布情况 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3 基因应答嗜水气单胞菌攻毒的表达模式 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 数据统计与分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 嗜水气单胞菌与金黄色葡萄球菌毒力基因 |
| 3.2.2 嗜水气单胞菌菌落形成单位及与OD600 关系 |
| 3.2.3 嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹半数致死剂量LD50 |
| 3.2.4 嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3 基因免疫应答. |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 嗜水气单胞菌毒力基因 |
| 3.3.2 嗜水气单胞菌攻毒模型 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 河南华溪蟹ShToll1和ShToll3 基因应答Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的表达模式 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 数据统计与分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 Cd胁迫及嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹Shtoll1 基因免疫应答.. |
| 4.2.2 Cd胁迫及嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹Shtoll3 基因免疫应答.. |
| 4.2.3 高浓度Cd胁迫及嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹ShToll1 蛋白免疫应答 |
| 4.2.4 中浓度Cd胁迫及嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹ShToll3 蛋白免疫应答 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 Cd对免疫系统的影响作用 |
| 4.3.2 Cd对 Toll的影响作用 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 RNAi干扰Shtoll1和Shtoll3 后河南华溪蟹ShToll1、ShToll3 及下游AMPs应答Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的情况研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.1.3 数据统计与分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 Shtoll1-siRNA和 Shtoll3-siRNA干扰效率 |
| 5.2.2 Western blot检测河南华溪蟹ShToll1和ShToll3 蛋白免疫应答.. |
| 5.2.3 RNAi干扰Shtoll1和Shtoll3 后下游抗菌肽基因AMPs的免疫应答 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 抗菌肽alf与河南华溪蟹ShToll |
| 5.3.2 抗菌肽crustin与河南华溪蟹ShToll |
| 5.3.3 抗菌肽c-lys与河南华溪蟹ShToll |
| 5.4 小结 |
| 全文总结与创新之处 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（5）秦皮素对嗜水气单胞菌的抗感染机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 嗜水气单胞菌的研究概况 |
| 1.1 菌名与分类地位 |
| 1.2 血清学分型 |
| 1.3 感染途径 |
| 1.4 临床症状及病理特征 |
| 1.5 毒力因子 |
| 1.6 检测方法 |
| 1.7 治疗方法 |
| 2 秦皮素的研究概况 |
| 2.1 来源 |
| 2.2 提取和测定方法 |
| 2.3 结构和理化性质 |
| 2.4 抗菌作用 |
| 2.5 抗氧化作用 |
| 2.6 抗癌作用 |
| 2.7 抗炎作用 |
| 2.8 抗骨质疏松作用 |
| 2.9 其他生理作用 |
| 2.10 毒性 |
| 3 本研究的目的及意义 |
| 第二章 秦皮素对嗜水气单胞菌的体外生长及毒力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验菌株和培养条件 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 最低抑菌浓度的测定 |
| 1.4 细菌生长曲线测定 |
| 1.5 脂肪酶活性的测定 |
| 1.6 菌体运动能力的测定 |
| 1.7 蛋白酶活性的测定 |
| 1.8 溶血能力的测定 |
| 1.9 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 秦皮素对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度 |
| 2.2 不同浓度秦皮素对嗜水气单胞菌的生长曲线的影响 |
| 2.3 秦皮素在非抑菌浓度下对嗜水气单胞菌毒力的影响 |
| 3 讨论 |
| 第三章 秦皮素的细胞毒性及其对嗜水气单胞菌感染鱼体的保护作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验菌株和培养条件 |
| 1.2 细胞培养 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 细胞毒性 |
| 1.5 团头鲂样品采集 |
| 1.6 血液生化指标测定 |
| 1.7 肝脏抗氧化能力指标测定 |
| 1.8 基因表达荧光定量PCR检测 |
| 1.9 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 秦皮素对CIK细胞增殖的影响 |
| 2.2 攻毒鱼的存活率 |
| 2.3 秦皮素对团头鲂血浆指标的影响 |
| 2.4 秦皮素对团头鲂肝脏抗氧化能力的影响 |
| 2.5 秦皮素对团头鲂肝、脾、肾组织抗氧化基因表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）灭活嗜水气单胞菌刺激草鱼肾细胞（CIK）转录组研究及免疫相关分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 嗜水气单胞菌国内外研究进展 |
| 1.1.1 嗜水气单胞菌生物学特性及流行病学 |
| 1.1.2 鱼源嗜水气单胞菌的毒力因子及致病性 |
| 1.2 草鱼与病原菌相互作用机制研究进展 |
| 1.2.1 草鱼自身免疫系统与病原菌侵染 |
| 1.2.2 草鱼抗菌免疫应答及相关信号通路 |
| 1.3 转录组学研究进展 |
| 1.3.1 转录组技术概述 |
| 1.3.2 转录组测序技术在鱼类免疫学中的应用 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 1.4.1 选题依据 |
| 1.4.2 研究目的及意义 |
| 1.5 主要研究内容和论文技术路线 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第2章 嗜水气单胞菌对草鱼肾细胞致病性研究 |
| 2.1 供试材料 |
| 2.1.1 细胞和病原菌 |
| 2.1.2 主要试剂及耗材 |
| 2.1.3 实验用培养基及主要试剂的配制 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 CIK细胞培养 |
| 2.2.2 嗜水气单胞菌的活化和灭活 |
| 2.2.3 细胞吞噬实验 |
| 2.2.4 细胞活性检测 |
| 2.2.5 细胞非特异性免疫指标测定 |
| 2.2.6 灭活病原菌刺激转录组测序CIK细胞所用浓度及时长摸索 |
| 2.2.7 数据分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 细胞形态变化及吞噬活性 |
| 2.3.2 细胞活性检测结果 |
| 2.3.3 细胞膜渗透性相关指标变化 |
| 2.3.4 细胞抗氧化相关指标变化 |
| 2.3.5 细胞总RNA检测结果 |
| 2.3.6 各基因半定量RT-PCR最佳循环数的确定 |
| 2.3.7 不同样品中目的基因表达量情况 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 灭活病原对CIK细胞的毒性作用及细胞吞噬作用 |
| 2.4.2 病原菌刺激对CIK细胞抗氧化系统的影响 |
| 2.4.3 CIK细胞转录组测序时灭活病原菌的浓度及刺激时长确定 |
| 第3章 草鱼肾细胞经病原菌刺激前后转录组分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 测序文库构建 |
| 3.2.2 RNA-Seq生物信息学分析 |
| 3.2.3 部分表达基因的qRT-PCR验证 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 质控数据统计及序列比对 |
| 3.3.2 转录本组装结果统计 |
| 3.3.3 基因表达量统计及样本关系分析 |
| 3.3.4 各组间差异表达基因筛选及基因集创建与分析 |
| 3.3.5 定量PCR验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 总结与展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）鲟细菌性败血症病原学及其防治研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 鲟形目鱼类及其养殖状况概述 |
| 1.1.1 鲟鱼类物种概述 |
| 1.1.2 鲟鱼类养殖状况概述 |
| 1.2 鲟鱼类病原性疾病的研究概述 |
| 1.2.1 病毒性疾病 |
| 1.2.2 细菌性疾病 |
| 1.2.3 真菌性疾病 |
| 1.2.4 寄生虫病 |
| 1.3 鱼类肠道菌群的研究概述 |
| 1.3.1 鱼类肠道菌群的组成 |
| 1.3.2 影响鱼类肠道菌群的因素 |
| 1.4 益生菌的筛选和应用 |
| 1.4.1 益生菌的筛选原则 |
| 1.4.2 益生菌在水产动物病害防治中的应用 |
| 1.5 本研究的目的意义和技术路线 |
| 1.5.1 本研究的目的意义 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第2章 中华鲟细菌性败血症及其病原研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 样品的采集 |
| 2.2.2 病原菌的分离和培养 |
| 2.2.3 分离菌株对长江鲟的攻毒试验 |
| 2.2.4 分离菌株的分子生物学鉴定 |
| 2.2.5 病原菌的生理生化特征 |
| 2.2.6 药物敏感性试验 |
| 2.2.7 组织病理学观察 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 患病中华鲟的症状 |
| 2.3.2 分离菌株对长江鲟的致病性 |
| 2.3.3 病原菌的形态特征 |
| 2.3.4 病原菌的分子生物学鉴定 |
| 2.3.5 病原菌的生理生化特征 |
| 2.3.6 药物敏感性试验结果 |
| 2.3.7 病原菌回归感染试验结果 |
| 2.3.8 长江鲟感染病原菌后的组织病理特征 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 病原菌的分类鉴定 |
| 2.4.2 中华鲟运动性气单胞菌的流行特征 |
| 2.4.3 嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的药物敏感性分析 |
| 2.4.4 长江鲟感染嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌后的病理特征 |
| 2.4.5 中华鲟细菌性败血症的防治 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 长江鲟感染两种气单胞菌的转录组学分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验鱼及其处理 |
| 3.2.2 样品的采集 |
| 3.2.3 样品RNA提取和纯化 |
| 3.2.4 cDNA文库的制备 |
| 3.2.5 转录组测序和分析 |
| 3.2.6 差异表达基因验证 |
| 3.2.7 数据统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 RNA-seq分析和de novo组装 |
| 3.3.2 基因功能注释 |
| 3.3.3 差异表达基因的鉴定和注释 |
| 3.3.4 差异表达基因的GO富集分析 |
| 3.3.5 差异表达基因的代谢通路(KEGG)分析 |
| 3.3.6 实时荧光定量PCR验证差异表达基因 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 长江鲟脾脏的免疫功能 |
| 3.4.2 模式识别受体 |
| 3.4.3 酪氨酸激酶-信号转导与转录激活子信号通路 |
| 3.4.4 细胞凋亡通路 |
| 3.4.5 肠道免疫网络IgA的产生通路 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 嗜水气单胞菌感染对长江鲟肠道菌群的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验鱼及其处理 |
| 4.2.2 样品的采集 |
| 4.2.3 肠道微生物DNA提取和16S r RNA基因扩增 |
| 4.2.4 Miseq高通量测序 |
| 4.2.5 高通量测序数据处理和分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 样本数据统计 |
| 4.3.2 样本比较分析 |
| 4.3.3 肠道菌群Alpha多样性分析 |
| 4.3.4 肠道菌群物种组成分析 |
| 4.3.5 肠道菌群物种差异分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 嗜水气单胞菌对长江鲟肠道菌群结构和多样性的影响 |
| 4.4.2 嗜水气单胞菌对长江鲟肠道菌群组成的影响 |
| 4.4.3 健康组和患病组长江鲟肠道差异物种分析 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 中华鲟和长江鲟肠道中潜在益生菌的筛选及应用研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 芽孢杆菌的分离和筛选 |
| 5.2.2 试验饲料的制备 |
| 5.2.3 试验鱼及饲养管理 |
| 5.2.4 生长性能指标的测定 |
| 5.2.5 样品的采集和处理 |
| 5.2.6 血清免疫酶活性的测定 |
| 5.2.7 肠道消化酶活性的测定 |
| 5.2.8 人工感染试验 |
| 5.2.9 数据统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 枯草芽孢杆菌的分离和鉴定 |
| 5.3.2 枯草芽孢杆菌体外抑菌试验 |
| 5.3.3 枯草芽孢杆菌体外产酶试验 |
| 5.3.4 枯草芽孢杆菌体外压力耐受性试验 |
| 5.3.5 枯草芽孢杆菌的安全性评价 |
| 5.3.6 投喂枯草芽孢杆菌对长江鲟生长性能的影响 |
| 5.3.7 投喂枯草芽孢杆菌对长江鲟血清免疫酶活性的影响 |
| 5.3.8 投喂枯草芽孢杆菌对长江鲟肠道消化酶活性的影响 |
| 5.3.9 投喂枯草芽孢杆菌对长江鲟抗病性的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 枯草芽孢杆菌体外益生特性分析 |
| 5.4.2 投喂枯草芽孢杆菌对长江鲟生长性能的影响 |
| 5.4.3 投喂枯草芽孢杆菌对长江鲟免疫酶活性的影响 |
| 5.4.4 投喂枯草芽孢杆菌对长江鲟抗病性的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 投喂枯草芽孢杆菌对长江鲟肠道菌群的影响 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试验鱼及其处理 |
| 6.2.2 样品的采集 |
| 6.2.3 肠道微生物DNA提取和16S r RNA基因扩增 |
| 6.2.4 Miseq高通量测序 |
| 6.2.5 高通量测序数据处理和分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 样本数据统计 |
| 6.3.2 样本比较分析 |
| 6.3.3 肠道菌群Alpha多样性分析 |
| 6.3.4 肠道菌群物种组成分析 |
| 6.3.5 肠道菌群物种差异分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 投喂枯草芽孢杆菌对长江鲟肠道菌群结构和多样性的影响 |
| 6.4.2 投喂枯草芽孢杆菌对长江鲟肠道菌群组成的影响 |
| 6.4.3 投喂枯草芽孢杆菌对长江鲟肠道物种的影响 |
| 6.5 小结 |
| 本研究的主要创新点 |
| 本研究的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略语 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文情况 |
| 攻读学位期间主持及参与的项目情况 |
| 攻读学位期间获得的奖励 |
（8）洛氏鱥肠道产酶益生菌的筛选及其粘附特性分析（论文提纲范文）
| 符号说明(Symbol description) |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 抗生素在水产养殖上应用现状及危害 |
| 2 益生菌的研究进展 |
| 2.1 益生菌的定义 |
| 2.2 益生菌在水产养殖业上的应用与研究 |
| 2.3 益生菌的作用及机理 |
| 3 益生菌常用种类 |
| 4 存在问题与对策 |
| 4.1 益生菌种缺乏 |
| 4.2 活菌制剂易失活 |
| 4.3 菌种在体内耐受性差 |
| 4.4 难以形成优势菌群 |
| 4.5 益生菌的安全性 |
| 4.6 作用机理不清晰 |
| 5 本课题研究的目的与意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 洛氏鱥肠道产酶益生菌的筛选 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 洛氏鱥肠道产酶益生菌的鉴定 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 洛氏鱥肠道产酶益生菌的益生特性分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 洛氏鱥肠道产酶益生菌的粘附机制分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论与创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（9）灞河气单胞菌（Aeromonas）抗生素耐药性和重金属抗性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 气单胞菌简介 |
| 1.2.1 气单胞菌的生物学特性 |
| 1.2.2 气单胞菌的分类 |
| 1.2.3 气单胞菌的耐药特点 |
| 1.3 抗生素耐药的作用机制 |
| 1.4 重金属与抗生素协同选择抗性机制 |
| 1.4.1 协同抗性机制 |
| 1.4.2 交叉抗性机制 |
| 1.4.3 协同调控机制 |
| 1.4.4 生物膜形成诱导机制 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 灞河水体中理化因子的检测及气单胞菌的耐药表型检测 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.2.2 样品采集处理及理化因子的检测 |
| 2.2.3 气单胞菌的提取与鉴定 |
| 2.2.4 药敏纸片法测定气单胞菌抗生素耐药表型 |
| 2.2.5 琼脂稀释法测定气单胞菌重金属耐药表型 |
| 2.2.6 数据处理及分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 水体理化因子 |
| 2.3.2 灞河水体中重金属水平 |
| 2.3.3 灞河水体中抗生素水平 |
| 2.3.4 菌株鉴定结果 |
| 2.3.5 气单胞菌重金属耐药表型结果 |
| 2.3.6 气单胞菌抗生素耐药表型结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 灞河水体中气单胞菌抗生素和重金属抗性基因的分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要仪器与试剂 |
| 3.2.2 试验菌株的选择 |
| 3.2.3 抗性基因的选择及引物合成 |
| 3.2.4 抗生素抗性基因和重金属抗性基因的定性检测 |
| 3.2.5 数据处理及分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 气单胞菌属各种菌株的重金属抗性基因水平 |
| 3.3.2 气单胞菌属各种菌株的抗生素抗性基因水平 |
| 3.3.3 气单胞菌抗性基因的分布 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 本研究创新点 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）细鳞鱼三种细菌的快速检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 论文研究的目的与意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 细鳞鱼的概况 |
| 2.1.1 形态特征 |
| 2.1.2 生态特征 |
| 2.1.3 繁殖 |
| 2.1.4 人工养殖的概况 |
| 2.2 三种菌的研究进展 |
| 2.2.1 迟钝爱德华菌的研究进展 |
| 2.2.2 嗜水气单胞菌的研究进展 |
| 2.2.3 温和气单胞菌的研究进展 |
| 2.3 环介导等温扩增的研究进展 |
| 2.3.1 环介导等温扩增的原理 |
| 2.3.2 环介导等温扩增的应用 |
| 3 研究内容与技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 细鳞鱼三种细菌的分离与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 三种菌的分离培养 |
| 1.2.2 生化鉴定 |
| 1.2.3 药敏试验 |
| 1.2.4 DNA的提取 |
| 1.2.5 16srRNA扩增核苷酸序列 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 分离菌株的培养特性 |
| 2.2 生化特性 |
| 2.3 药敏结果 |
| 2.4 16S rRNA扩增核苷酸序列结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 检测结果准确性 |
| 3.2 检测所需的时间 |
| 4 小结 |
| 试验二 细鳞鱼三种细菌的LAMP检测方法的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细菌DNA模板的制备 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 LAMP反应体系的建立 |
| 1.2.4 LAMP反应引物的筛选 |
| 1.2.5 三种菌的LAMP反应体系的优化分析 |
| 1.2.6 三种菌LAMP的特异性和重复性试验 |
| 1.2.7 LAMP、常规PCR方法的灵敏度分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 三种菌LAMP引物的筛选 |
| 2.2 LAMP反应条件和体系的优化 |
| 2.3 LAMP方法的特异性和重复性结果 |
| 2.4 LAMP、常规PCR方法的灵敏度分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 所选基因的优越性 |
| 3.2 结果的判定 |
| 3.3 该方法的可行性 |
| 4 小结 |
| 试验三 细鳞鱼嗜水气单胞菌的实时荧光定量检测 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要的试剂 |
| 1.2 菌株及其来源 |
| 1.3 DNA的提取 |
| 1.4 引物的设计 |
| 1.5 梯度PCR |
| 1.6 引物特异性和通用性检测 |
| 1.7 荧光定量PCR结果 |
| 2 结果 |
| 2.1 荧光定量扩增条件的确定 |
| 2.2 引物特异性及通用性检测结果 |
| 2.3 标准曲线的构建 |
| 3 讨论 |
| 3.1 两个方法的印证 |
| 3.2 两个方法的优缺点 |
| 4 小结 |
| 第三章 结论 |
| 第四章 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
四、嗜水气单胞菌研究进展(综述)（论文参考文献）
- [1]黄鳝出血病研究进展[J]. 文峥嵘,罗鸣钟,柴毅,杨代勤,李锐,魏巍. 湖北农业科学, 2021
- [2]抗嗜水气单胞菌三味中药水煎液及联用对鲫鱼免疫效果的评价[D]. 郭雅萌. 吉林农业大学, 2021
- [3]患病江豚微生态变化及迁地背景下江豚保护性研究[D]. 刘志刚. 华中农业大学, 2020
- [4]河南华溪蟹ShToll1和ShToll3对镉暴露和嗜水气单胞菌攻毒的免疫应答研究[D]. 郎朗. 山西大学, 2020(12)
- [5]秦皮素对嗜水气单胞菌的抗感染机制研究[D]. 朱璐丹. 上海海洋大学, 2020(02)
- [6]灭活嗜水气单胞菌刺激草鱼肾细胞（CIK）转录组研究及免疫相关分析[D]. 蒋艳红. 西南大学, 2020(01)
- [7]鲟细菌性败血症病原学及其防治研究[D]. 邸军. 西南大学, 2020
- [8]洛氏鱥肠道产酶益生菌的筛选及其粘附特性分析[D]. 吴振超. 吉林农业大学, 2020(03)
- [9]灞河气单胞菌（Aeromonas）抗生素耐药性和重金属抗性研究[D]. 朱泽亮. 西北农林科技大学, 2020(02)
- [10]细鳞鱼三种细菌的快速检测方法的建立[D]. 郭玉丹. 石河子大学, 2019(08)