一、EFFECTS OF SEVERAL RGSS ON ADENYLATE CYCLASE (AC) ASSOCIATED WITH MU AND DELTA OPIOD-RECEPTORS（论文文献综述）
杨文娇[1]（2021）在《鞘内注射C-末端酯化的内吗啡肽类似物的镇痛活性研究》文中指出
袁满[2]（2021）在《Dynorphin在光周期诱导花鲈生殖发育中的分子机制》文中指出花鲈（Lateolabrax maculatus）是我国重要的水产养殖品种,在我国沿海分布广泛。花鲈属短日照繁殖鱼类,其季节性繁殖涉及光信号的输入、信号处理和神经内分泌等复杂的调控过程。血管囊作为光周期感受器,在鱼类季节性繁殖中起重要作用。本研究通过组织切片、扫描电镜和透射电镜技术分析了血管囊的形态和显微结构;并确立了花鲈血管囊细胞的培养方法;同时克隆了光周期重要效应基因Dynorphin（LmDyn）,分析了其编码的氨基酸结构特点,通过在体和离体两种实验方式研究了不同光周期处理下LmDyn基因在花鲈血管囊等组织中的表达特征;并进一步结合LmDyn高亲和受体Kappa opioid receptor（LmKor）通过双荧光素酶报告实验和LmDyn多肽注射与孵育实验共同探究了LmDyn与相关生殖基因间的作用关系以及LmDyn/LmKor系统在细胞中的信号传导途径;（1）花鲈血管囊位于花鲈脑腹面,处于下丘脑中间,为椭圆形红色组织。HE染色切片显示,花鲈血管囊为囊状结构,囊内有丰富的折褶上皮,形成许多囊腔,在囊腔的边缘有很多花束样的冠状细胞。扫描电镜观察可以看到内褶外皮有许多突出的葡萄状小球,通过透射电镜可以看出该小球为冠状细胞的顶端小球结构,小球中充满大小形状各异的初级囊泡和次级囊泡。冠状细胞中间还夹杂有三角形的支持细胞（也被称为胶质细胞）,支持细胞在顶端以领状的方式包围着冠细胞的颈部,将两个冠状细胞分隔开来。此外本研究对花鲈血管囊细胞的三种培养方法（机械法,消化法和组织块培养法）进行了比较,最终确定以组织块培养法为佳。进一步比较含有不同浓度胎牛血清的培养基培养花鲈血管囊细胞的情况,发现胎牛血清含量为20%较适合血管囊细胞的生长,目前已稳定传至20代。（2）LmDyn基因ORF全长690bp,编码229个氨基酸,蛋白分子量为26.4k Da,理论等电点为8.12,含有1个信号肽和1个蛋白结构域,LmDyn编码四种阿片肽,分别是Ile-enkephalin、Neo-endorphins、Dynorphin A和Dynorphin B。通过多重序列比对,发现花鲈LmDyn与高体鰤鱼（Seriola dumerili）Dyn序列的相似度较高。同时Dyn编码的Dynorphin A、Dynorphin B在不同物种间保守性也较高。进化树分析结果显示硬骨鱼纲非鲈形目Dyn序列聚为一支,鲈形目鱼类Dyn序列聚为一支,哺乳动物Dyn序列聚为一支,花鲈LmDyn与高体鰤鱼共聚为一支。（3）组织分布结果表明,LmDyn和LmKor均在脑区的分布较多,其中LmDyn在下丘脑中表达量最高,其次是端脑、性腺和血管囊。LmKor在端脑中表达量最高其次是视叶和下丘脑。在花鲈性腺发育的不同阶段,LmDyn在花鲈血管囊、下丘脑、垂体和性腺中的表达趋势相同,即在性腺I期LmDyn的表达量最高,在V期的表达量最低,说明LmDyn作为抑制因子可能在花鲈生殖调控中发挥作用。在光周期处理实验中,发现在血管囊、下丘脑和性腺中LmDyn在长光照周期有较高的表达,而在短光照周期表达量较低,这符合花鲈的短日照繁殖方式。（4）双荧光素酶报告实验结果表明,LmDyn能够与受体LmKor结合,并与AC/PKA途径偶联,抑制CRE启动子活性,从而触发下游事件,降低荧光信号。无论是在体水平还是离体水平,光周期处理后下丘脑中促性腺激素释放激素2（Gonadotropin-releasing hormone,LmGnRH2）的表达量和垂体中促卵泡生成素β（Follicle-stimulating hormone beta,LmFSHβ）的表达量,都与LmDyn的表达量成负相关,表明LmDyn负调控LmGnRH2和LmFSHβ的表达。在多肽孵育实验和注射实验中,LmDynA多肽对LmGnRH2的抑制呈明显的剂量依赖,对LmFSHβ也有一定的抑制作用,说明LmDynA多肽在生殖负调控中作用显着。此外,在离体水平的光周期实验中,将组织单独分开进行光照后,下丘脑中LmGnRH2的表达不再受光照周期的影响,同样在垂体中LmFSHβ的表达也不受影响,说明在离体水平去除血管囊后,下丘脑和垂体都失去了对光周期的响应,只有在下丘脑、垂体和血管囊整体结构不变的情况下,相关生殖激素才受光周期的调控,进一步证明了血管囊在光周期调控中的重要作用。
王伟伟[3]（2021）在《神经肽受体GPR103信号转导机制研究》文中指出神经肽是神经元分泌的细胞间信号分子,在体内充当神经递质,神经调节剂或神经激素,并且在生物发育各个阶段对各种生理功能起重要的调控作用。谷氨酰胺RF-酰胺肽（Pyroglutamine RF-amide peptide,QRFP）是RFamide家族中最新发现的成员,并被鉴定为GPR103内源性配体,GPR103通过与异源三聚体G蛋白结合发挥作用。GPR103及其配体广泛表达于大脑和外周组织中,参与调节体内诸如摄食和能量稳态、神经内分泌和骨骼发育等多种生理功能,可以作为诊断、预防和治疗能量稳态以及内分泌等相关疾病的有效药物靶标。神经肽QRFP前体肽可以水解产生两个C末端酰胺化的成熟肽,分别为26RFa和43RFa。先前的研究报道26RFa和43RFa神经肽均能特异性结合并激活GPR103,但两个神经肽激活GPR103介导的信号通路机制仍存在很大争议。本文中,我们首先检测了两个神经肽介导的信号通路,研究发现在HEK293T细胞中,26RFa刺激GPR103与Gαq和Gαi蛋白偶联,抑制c AMP的生成,并介导胞内Ca2+的动员以及ERK1/2的磷酸化,与先前的报道一致。与26RFa不同的是,43RFa可以激活GPR103与Gαs蛋白偶联促进c AMP的积累,并同时通过Gαq和Gαs蛋白介导Ca2+动员和ERK1/2的磷酸化。我们通过分子动力学模拟预测配体-受体相互作用并结合定点突变的方法,检测受体突变体和配体类似物激活受体介导的信号通路活性差异。结果显示突变体ECL2上的Lys189、Asp191和Leu 202残基对受体与Gα蛋白结合至关重要。在43RFa作用下,Lys189突变为丙氨酸导致受体选择性地与Gαi蛋白结合,Asp191突变为丙氨酸后仅激活Gαq蛋白;而丙氨酸替代Leu 202可致受体由Gαs和Gαq双偶联变为Gαi和Gαq双偶联。研究还揭示,截断N端8个氨基残基的35RFa同样激活GPR103与Gαs和Gαq双偶联,但把Phe10突变为丙氨酸的35RFa-F10A导致受体由Gαs和Gαq双偶联变为Gαi和Gαq双偶联。进一步活体研究表明,43RFa和26RFa均能促进小鼠胰岛细胞的胰岛素分泌,但作用机制不同。43RFa主要通过Gαs-c AMP和Gαq-Ca2+偶联的信号通路促进胰岛素分泌,且作用明显强于26RFa,而26RFa仅通过Gαq依赖的Ca2+信号通路促进胰岛素分泌。糖基化作为GPCR蛋白翻译后修饰的重要过程,影响着蛋白质折叠、分泌、表面表达、蛋白定位、转运、配体结合等多种生理功能。GPR103受体具有三个潜在的N-糖基化位点,两个位于N末端结构域(Asn5和Asn19),一个位于第一个细胞外环（ECL1）(Asn106),但迄今为止,它们在GPR103表达和信号转导中的作用尚未确定。我们结合定点突变的方法（天冬酰胺替换为谷氨酰胺）与糖苷酶PNGase F和N糖基化抑制剂Tunicamycin（衣霉素）,研究N-糖基化在调控GPR103细胞表面表达和信号转导中的作用。结果显示,位于N端的N19和ECL1的N106是N-糖基化位点,位于N5的天冬酰胺并未被糖基化。共聚焦显微镜和定量ELISA分析显示,GPR103的N-糖基化作用对靶向细胞膜并不重要。然而,进一步的结合实验和功能实验表明去除N-糖基化或衣霉素处理导致受体与26RFa结合能力以及介导下游信号通路的能力显着减弱。因此,我们的研究结果表明,对于人QRFP受体GPR103,N糖基化对细胞表面表达并不重要,但却是配体结合和受体激活的先决条件。综上所述,本研究主要从GPR103与配体相互作用及蛋白翻译后修饰对受体的功能影响两部分探索GPR103受体信号转导机制。进一步加深我们对A类GPCR与它们的肽配体尤其是RF家族神经肽与它们的同源受体之间相互作用的理解,为设计以GPR103为靶点的激动剂和拮抗剂药物奠定了基础。
左君[4]（2021）在《局麻药过敏的回顾性分析及MRGPRX2参与类过敏反应肥大细胞脱颗粒的机制研究》文中研究指明目的:局麻药（Local Anesthetics,LAs）在临床上的应用范围极广,特别是在局部麻醉、区域神经阻滞和疼痛治疗中。局麻药过敏反应的发生率目前没有明确报道。在日常的临床实践中,使用局麻药引起过敏反应的风险是一个值得临床医生关注的问题。本文的主要目的是调查一家麻醉过敏门诊10年期间就诊患者局麻药过敏的发生率。方法:回顾性分析患者的医疗记录,这些患者被转诊到中国的一家麻醉过敏门诊,并在2009年至2019年的10年间接受了局麻药过敏检测。从患者的病历中收集以下信息:人口学特征、转诊原因、药物超敏反应（drug hypersensitivity reaction,DHR）的临床特征以及对潜在致敏药物的测试结果。通过皮肤点刺试验（skin prick test,SPT）、皮内试验（intradermal test,IDT）、嗜碱性粒细胞活化试验（basophil activation test,BAT）对疑似局麻药进行过敏检测。结果:本研究一共纳入了 109名患者,主要转诊原因是手术后存在可疑的局麻药DHR（n=68,62%）,第二常见转诊原因是患者有使用其他药物的DHR病史,并需要在即将进行的手术中使用局麻药（n=41,38%）。这些患者中只有6人（6%）对局麻药表现出真正的过敏,在皮肤试验或BAT中呈阳性结果。对于有其他药物DHR病史的41例患者,皮肤试验和BAT均为阴性。结论:局麻药过敏的风险可能是非常低的。然而,对怀疑有局麻药DHR病史的患者应当考虑进行过敏检测,完整的过敏检测对于正确的诊断和治疗是必要的。在临床实践中,皮肤试验和BAT有助于局麻药过敏的调查和诊断,识别罕见的局麻药过敏病例。目的:近年来,围术期麻醉药物引起类过敏反应（pseudo-allergy）的报道逐渐增多。最近的一项研究表明,肥大细胞表面受体MRGPRX2参与了多种药物引起的类过敏反应。因此,可利用MRGPRX2作为药物类过敏反应的作用靶点,建立一种有效的临床前药物安全评价方法,对麻醉药物潜在的类过敏作用进行评价。方法:将慢病毒载体系统转染到HEK293T细胞,构建稳定过表达MRGPRX2受体的细胞模型MRGPRX2-HEK293T;用RT-PCR方法检测MRGPRX2的表达;通过钙流检测证明表达的MRGPRX2是否具有完整的受体功能活性;利用构建成功的MRGPRX2-HEK293T细胞系评估麻醉药物（吗啡,芬太尼,利多卡因,顺阿曲库铵）潜在的类过敏作用。结果:本实验成功构建了基于过表达细胞系HEK293T-MRGPRX2的体外评价药物靶点激活的细胞模型。该重组细胞转染了包含MrgprX2全长基因的慢病毒载体,其细胞膜上能够稳定表达MRGPRX2受体分子,且具有完整的受体功能活性。吗啡、顺阿曲库铵可以激活MRGPRX2-HEK293T细胞产生钙流信号,利多卡因、芬太尼作用于MRGPRX2-HEK293T细胞上没有产生钙流信号。结论:本实验构建的稳定过表达MRGPRX2的细胞模型MRGPRX2-HEK293T,可以用于麻醉药物潜在的类过敏作用评价。钙流检测初步证实吗啡和顺阿曲库铵是MRGPRX2靶点的激动剂,可能是潜在的引发类过敏反应的麻醉药物。利多卡因和芬太尼对MRGPRX2靶点无激活作用,可能无潜在的类过敏作用。该细胞模型同时为进一步研究类过敏反应的机制提供了一种重要的途径。目的:吗啡不仅可以通过IgE依赖途径诱导肥大细胞脱颗粒,还可以通过非IgE依赖途径活化肥大细胞,引起类过敏反应（pseudo-allergy）。最新的研究已经证实,肥大细胞表面受体MRGPRX2是参与多种药物的类过敏反应极其重要的靶点。但吗啡诱导的肥大细胞脱颗粒作用是否有MRGPRX2受体的参与目前尚不明确,另外其与阿片受体（opioidreceptors,OR）之间的相互作用关系尚无研究。本部分的研究主要探讨吗啡对肥大细胞的非IgE依赖活化途径,并通过细胞实验阐明细胞活化后脱颗粒作用的相关信号通路。方法:本研究选取人LAD2肥大细胞,通过测定β-氨基己糖苷酶释放率,明确吗啡是否可以引起肥大细胞脱颗粒;通过RT-PCR检测,比较LAD2肥大细胞上MRGPRX2受体和阿片受体的表达量是否存在明显差异;同时基于稳定过表达MRGPRX2的转染细胞系MRGPRX2-RBL-2H3肥大细胞,加入阿片受体抑制剂（纳洛酮）、MRGPRX2抑制剂（QWF）、Gαi抑制剂（PTx）、Gαq抑制剂（YM）干预、钙通道抑制剂（La3+）,通过β-氨基己糖苷酶释放率的测定和钙流检测两项指标来研究肥大细胞的激活机制。结果:吗啡可以诱导明显的LAD2肥大细胞脱颗粒,释放β-氨基己糖苷酶,且吗啡诱导肥大细胞脱颗粒的百分率随吗啡终浓度的增大而增大,呈明显的剂量依赖性;LAD2肥大细胞上MRGPRX2表达明显高于阿片受体的表达量;吗啡可以诱导MRGPRX2-RBL-2H3转染细胞系脱颗粒,释放β-氨基己糖苷酶,同时可以引起细胞内钙流释放;QWF可以明显抑制吗啡诱导的肥大细胞脱颗粒水平,纳洛酮不能抑制肥大细胞的脱颗粒作用;La3+、YM、PTx均可明显抑制吗啡诱导的肥大细胞脱颗粒水平,同时,La3+、YM可以明显抑制细胞内钙流信号。但是,PTx不能抑制吗啡引起的肥大细胞内钙流信号。结论:吗啡诱导的肥大细胞脱颗粒是通过MRGPRX2受体的激活介导,与阿片受体的活化无直接相关性。吗啡诱导的肥大细胞活化后下游信号通路可能涉及Gαq,Ca2+信号通路,此外还可能涉及Gαi通路的活化。
张晗[5]（2021）在《中医药多维干预吗啡成瘾的作用及机制研究》文中研究说明背景与目的吗啡是慢性、中重度疼痛的首选药物。长期使用吗啡治疗后,其镇痛作用逐渐减弱,通常需要增加剂量才能达到原来的作用,但这样使患者更容易成瘾。复方511是导师吕志刚教授借鉴前人宝贵经验,结合中药防治药物成瘾的最新药理学研究成果,专门开发的用于防治阿片类药物成瘾的中药复方制剂。目前,复方51 1对阿片类药物成瘾的影响尚不完全明确,其潜在治疗机制也有待进一步研究。电针也是对抗阿片类药物成瘾的一个有效手段,但机制尚不完全明确。本文观察了复方511、电针及二者联合对小鼠吗啡成瘾相关行为学的影响,然后利用高通量测序技术筛选可能的作用机制并进行进一步探索,旨在明确复方511、电针干预吗啡成瘾的作用机制。方法一、复方51 1干预吗啡成瘾的作用及机制研究实验一:研究不同剂量复方511对小鼠吗啡成瘾相关行为学的影响。将雄性C57BL/6小鼠分为生理盐水+溶剂（Con）组、吗啡+溶剂（Mod）组、吗啡+复方511低、中、高剂量（511-L、M、H）组、吗啡+济泰片（Jitai）组。（1）条件性位置偏爱（CPP）实验:训练前测定小鼠的天然位置偏好,以非天然偏爱箱为吗啡配对箱、天然偏爱箱为生理盐水配对箱训练小鼠,训练过程中灌胃给予双蒸水或3g/kg、6g/kg、12g/kg复方511或4.3g/kg济泰片进行干预,每天1次,训练结束后检测小鼠的位置偏爱情况。（2）自发运动实验:单次灌胃给予双蒸水或3g/kg、6g/kg、12g/kg复方511后,测定小鼠60min内的运动距离;每天1次灌胃给予双蒸水或3g/kg、6g/kg、12g/kg复方511或4.3g/kg济泰片,30min后腹腔注射吗啡或生理盐水,第7天测定小鼠60min内的运动距离。（3）吗啡急性戒断实验:通过反复皮下注射吗啡构建小鼠吗啡依赖模型,每天2次,间隔4h,连续5天,同时灌胃给予双蒸水或3g/kg、6g/kg、12g/kg复方511或4.3g/kg济泰片进行干预,末次吗啡给药3h后,皮下给予1mg/kg纳洛酮,观察小鼠的戒断症状（跳跃行为、湿狗样抖动、体重减轻）。（4）自身给药（SA）实验:实验前训练小鼠按压主动杆获取食物,训练5天,实验开始后训练小鼠按压主动杆获取吗啡,训练15天,期间给双蒸水或3g/kg、6g/kg、12g/kg复方51 1进行干预,记录训练最后1天的自身给药次数和无效压杆数。实验二:研究复方51 1对吗啡成瘾小鼠腹侧被盖区（VTA）基因表达谱的影响。以吗啡CPP实验中的Con组、Mod组和511-M（511）组小鼠VTA组织作为测序样本,利用高通量测序技术,结合用SeqPrep、Sickle软件进行原始数据质控,用HISAT2和RSEM软件进行序列比对和基因表达定量,用DESeq2软件筛选组间差异表达基因（DEG）,并对部分DEG进行GO和KEGG富集分析。实验三:研究复方511对吗啡成瘾小鼠VTA BDNF信号通路及其介导的多巴胺能神经元结构可塑性的影响。采用实时荧光定量RNA检测CPP实验中Con组、Mod组和511-M（511）组小鼠VTA BDNF及其特异性受体TrkB mRNA的水平;采用蛋白质印迹法和免疫组化法检测各组中BDNF和TrkB的蛋白水平;采用蛋白免疫印迹实验检测细胞内BDNF信号级联（ERK通路、PI-3-K/Akt通路、PLCγ通路）中的蛋白表达;采用免疫荧光成像技术检测各组多巴胺能神经元胞体大小的变化。二、电针干预吗啡成瘾的作用及机制研究实验一:研究电针对小鼠吗啡成瘾相关行为学的影响。将雄性C57BL/6小鼠分为生理盐水（Sal）组、吗啡+假电针（Sham）组、吗啡+电针（EA）组。（1）CPP实验:训练前测定小鼠的天然位置偏好,以非天然偏爱箱为吗啡配对箱、天然偏爱箱为生理盐水配对箱训练小鼠,训练期间给予电针足三里和三阴交进行干预,每天1次,训练结束后检测小鼠的位置偏爱情况。（2）吗啡急性戒断实验:通过反复皮下注射吗啡构建小鼠吗啡依赖模型,每天2次,间隔4h,连续5天,同时给予电针足三里和三阴交进行干预,每天1次,末次吗啡给药3h后,皮下给予1mg/kg纳洛酮,观察小鼠的戒断症状（跳跃行为、湿狗样抖动、体重减轻）。实验二:研究电针对吗啡成瘾小鼠伏隔核（NAc）circRNA表达谱的影响。以吗啡CPP实验中的Sham组和EA组小鼠NAc组织作为测序样本,利用高通量测序技术,结合用Cutadapt、FastQC软件进行原始数据质控,用Tophat2、Bowtie2软件进行序列比对,用findcirc软件鉴定circRNA,用DESeq软件筛选组间差异表达的circRNA,并对差异circRNA的来源基因进行功能富集,并用miRanda软件预测差异circRNA的miRNA靶点,最后用荧光定量PCR对测序数据进行验证。三、复方511联合电针干预吗啡成瘾的作用研究研究复方511联合电针对小鼠吗啡成瘾相关行为学的影响。将雄性C57BL/6小鼠分为对照组（Con）、模型组（Mod）、复方511组（511）、电针组（EA）、复方511联合电针组（511+EA）。（1）CPP实验:训练前测定小鼠的天然位置偏好,以非天然偏爱箱为吗啡配对箱、天然偏爱箱为生理盐水配对箱训练小鼠,训练过程中给予双蒸水或6g/kg复方511或电针足三里和三阴交或6g/kg复方511联合电针足三里和三阴交进行干预,每天1次,训练结束后检测小鼠的位置偏爱情况。（2）吗啡急性戒断实验:通过反复皮下注射吗啡构建小鼠吗啡依赖模型,每天2次,间隔4h,连续5天,同时给予双蒸水或6g/kg复方511或电针足三里和三阴交或6g/kg复方511联合电针足三里和三阴交进行干预,每天1次,末次吗啡给药3h后,皮下给予1mg/kg纳洛酮,观察小鼠的戒断症状（跳跃行为、湿狗样抖动、体重减轻）。结果一、复方511干预吗啡成瘾的作用及机制研究实验一:（1）在CPP实验中,3g/kg、6g/kg、12g/kg复方511均能有效抑制小鼠吗啡诱导的CPP形成,其中6g/kg复方511的抑制作用更显着。（2）在自发运动实验中,3g/kg、6g/kg、12g/kg复方511均可有效抑制小鼠吗啡行为敏化的形成,且不影响小鼠的基础活动性,6g/kg复方511的抑制作用更明显。（3）在吗啡急性戒断实验中,3g/kg、6g/kg、12g/kg复方51 1均能明显减轻吗啡急性戒断症状,包括跳跃行为、体重减轻、湿狗样抖动,其中6g/kg复方511对纳洛酮催促的跳跃行为的影响更明显。（4）在SA实验中,3g/kg、6g/kg、12g/kg复方511均能明显抑制小鼠吗啡自身给药行为,其中6g/kg复方511的作用更明显。实验二:采用RNA-seq及生物信息学分析,共筛选出712个DEG,其中,Con组和Mod组之间的DEG458个（上调357个,下调101个）,Mod组和511组之间的DEG469个（上调 84 个,下调 385 个）。BDNF、Nts、Penk、Slc18a3、Sfrp2、Tph2、Htr1a、Plin4、Cartpt、Grin3b、Grip2、I131ra、Cdkn1a、Pdk4、Shox2、Trh、Tat 等 DEG 与吗啡作用或成瘾形成的机制有关。接着,对部分DEG进行功能富集。在GO富集中,DEG主要富集于细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）、结合（binding）、生物学调控（biological regulation）、生物过程调控（regulation of biological process）、细胞过程调控（regulation of cellular process）、蛋白质结合（protein binding）、膜（membrane）等与吗啡成瘾密切相关的条目。在KEGG富集中,DEG主要富集于吗啡成瘾（Morphine addiction）、多巴胺能突触（Dopaminergic synapse）、神经活性配体受体相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）、MAPK 信号通路（MAPK signaling pathway）、cAMP 信号通路（cAMP signaling pathway）、Ras信号通路（Ras signaling pathway）等在吗啡成瘾中有着重要作用的通路。实验三:结合测序的分析结果和前人的研究报道,发现复方511可能通过调控小鼠VTABDNF发挥抗吗啡成瘾的作用。首先,从基因和蛋白水平验证了 BDNF的变化。与Con组相比,Mod组BDNF mRNA及蛋白水平均明显降低,同时给予复方511干预,能明显减轻BDNF mRNA及蛋白水平的降低。接着,实验观察了 BDNF高亲和力受体TrkB的变化。与Con组相比,Mod组TrkB mRNA及蛋白水平均明显降低,同时给予复方511干预,可有效减少TrkB mRNA及蛋白水平的降低。在下游ERK通路中,与Con组相比,Mod组ERK1/2磷酸化水平明显升高,同时给予复方511干预,可明显抑制ERK1/2蛋白的磷酸化。在下游PI-3-K/Akt通路中,与Con组相比,Mod组p-PI-3-K/PI-3-K、p-Akt/Akt明显下调,p-S6/S6明显上调,同时给予复方511,可有效减少p-PI-3-K/PI-3-K、p-Akt/Akt的下调,抑制p-S6/S6的上调。在下游PLCγ通路中,与Con组相比,Mod组PLCy1蛋白表达水平明显升高,同时给予复方511干预,可明显抑制PLCγ1蛋白水平的升高。此外,小鼠吗啡诱导的CPP形成后,其VTA多巴胺能神经元胞体明显缩小,同时给予复方511,可明显逆转多巴胺能神经元胞体大小的变化。二、电针干预吗啡成瘾的作用及机制研究实验一:在CPP实验中,电针能有效抑制小鼠吗啡诱导的CPP形成,而在吗啡急性戒断实验中,电针能明显减轻急性吗啡戒断症状,包括跳跃行为、体重减轻、湿狗样抖动。实验二:采用RNA-seq及生物信息学分析,共鉴定出112个差异表达的circRNA,上调51个,下调61个。接着对这些差异circRNA的来源基因进行GO和KEGG富集。在GO富集中,这些差异circRNA来源基因的富集条目中有23条显着富集。其中,细胞定位（cellular localization）、胞浆（cytoplasm）、胞内（intracellular）、酶结合（enzyme binding）、GTP 酶结合（GTPase binding）、蛋白结合（protein binding）、高尔基体（Golgi apparatus）等与吗啡作用相关,而蛋白结合（protein binding）、胞外（intracellular part）、胞内（intracellular）、细胞内细胞器（intracellular organelle）、细胞定位（cellular localization）等与电针作用有关。在KEGG富集中,这些差异circRNA来源基因的富集通路中有21条显着富集。其中,谷氨酸能突触（Glutamatergic synapse）、长时程增强（Long-term potentiation）、Wnt信号通路（wnt signaling pathway）、多巴胺能突触（Dopaminergic synapse）、cGMP-PKG 信号通路（cGMP-PKG signaling pathway）、轴突导向（Axon guidance）、催产素信号通路（Oxytocin signaling pathway）等与吗啡成瘾有关,而肾素分泌（renin secretion）、血管内皮生长因子信号通路（VEGF signaling pathway）、胰岛素分泌（insulin secretion）、谷氨酸能突触（glutamatergic synapse）、Wnt信号通路（Wnt signaling pathway）、多巴胺能突触（dopaminergic synapse）等通路与针刺作用有关。此外,实验还预测了差异circRNA的前五个miRNA靶点,并选择了 44个circRNA和162个相互作用的miRNA构建circRNA-miRNA 网络,发现 mmu-miR-207、mmu-miR-669c-3p、mmu-miR-6946-3p 和 mmu-miR-6984-3p与更多的circRNA相关。三、复方511联合电针干预吗啡成瘾的作用研究在CPP实验中,复方511、电针、复方511联合电针均能有效抑制小鼠吗啡诱导的CPP形成,其中复方511联合电针的抑制作用更显着。在吗啡急性戒断实验中,复方511、电针、复方511联合电针均能明显减轻急性吗啡戒断症状,包括跳跃行为、体重减轻、湿狗样抖动,其中复方511联合电针对纳洛酮催促吗啡急性戒断症状的减轻作用更明显。结论1.复方511干预能有效抑制小鼠吗啡诱导的CPP、行为敏化、SA的形成,这提示复方511能有效抑制吗啡诱导的精神依赖;复方511干预能有效减轻小鼠吗啡依赖模型中纳洛酮催促的急性戒断症状,这提示复方511能有效减轻吗啡诱导的躯体依赖。由此说明复方511对抗吗啡成瘾作用明确。2.复方511干预能有效防止吗啡诱导的BDNF、TrkB mRNA和蛋白水平的下调,抑制吗啡诱导的ERK1/2、S6蛋白磷酸化的增加,减少PI-3-K、Akt蛋白磷酸化的降低,抑制PLCγ1蛋白的增加,同时,逆转吗啡诱导的多巴胺能神经元胞体萎缩,这提示复方511可能通过调控BDNF信号级联及其介导的多巴胺能神经元结构可塑性发挥抗吗啡成瘾的作用。3.电针干预能有效抑制小鼠吗啡诱导的CPP形成,这提示复方511能有效抑制吗啡诱导的精神依赖;电针干预能有效减轻小鼠吗啡依赖模型中纳洛酮催促的急性戒断症状,这提示电针能有效减轻吗啡诱导的躯体依赖。由此说明电针对抗吗啡成瘾作用明确。4.本研究筛选了电针干预吗啡成瘾后小鼠NAc中差异表达的circRNA,并预测了这些circRNA的潜在作用以及与这些circRNA相互作用的miRNA,这为电针干预吗啡成瘾的分子机制提供了新的靶点。5.复方511联合电针干预能更有效地抑制小鼠吗啡诱导的CPP形成,这提示复方511联合电针对吗啡诱导的精神依赖的抑制作用更明显;复方511联合电针干预能更有效地减轻小鼠吗啡依赖模型中纳洛酮催促的急性戒断症状,这提示复方511联合电针对吗啡诱导的躯体依赖的减轻作用更明显。由此说明复方511联合电针对抗吗啡成瘾的作用更佳。
蒋爽[6]（2021）在《4’-氨基取代苯蒂巴因类似物生物活性研究》文中认为阿片类镇痛药是目前最常用的镇痛处方药,阿片类药物通过与阿片受体结合发挥其镇痛效果。阿片受体主要分布在中枢神经系统、外周神经系统以及胃肠道。阿片受体为G蛋白偶联受体（GPCR）家族成员之一,主要有μ、δ和κ阿片受体三个亚型,各亚型间具有大约60%的同源性,分别介导不同的生理作用。传统的阿片类镇痛药,如芬太尼、吗啡、可待因、海洛因等,它们大都是μ阿片受体的完全激动剂或者μ/δ阿片受体混合激动剂。传统的μ阿片类镇痛药物具有诸多副作用,如依赖性、成瘾、耐受性、呼吸抑制、便秘等,这些日益严重的公共卫生危害使目前的镇痛药物在临床上面临了很大的挑战。而在阿片类受体中,κ阿片受体与μ阿片受体具有高度同源性,但与μ阿片受体的区别是,κ阿片受体不但具有很好的镇痛效应,并且不产生典型的μ阿片受体的副作用。因此,设计并合成μ受体及δ受体亲和力低、κ阿片受体亲和力高、镇痛效果好、副作用小的κ阿片受体激动剂,是一个开发高效、安全的潜在镇痛类新药的方向。基于此研究目的,本课题以药物化学家设计并合成的17个4’-氨基取代苯蒂巴因类化合物为主要研究对象,以κ阿片受体特异性结合为切入点,使用[3H]放射性配体-受体竞争结合实验,对该系列化合物进行筛选。筛选出的μ受体及δ受体亲和力低,κ阿片受体亲和力高的化合物,通过[35S]GTPγS功能试验评价该系列化合物对不同阿片受体亚型G蛋白的激动能力。通过动物疼痛模型进行体内镇痛效果研究,以期得到高效、安全的新型κ阿片受体激动剂镇痛类潜在新药。本研究从体外筛选和整体动物水平评价4’-氨基取代苯蒂巴因类化合物的药学活性。我们在放射性受体配体结合实验中发现化合物4j与κ阿片受体的亲和力较高,而对μ受体和δ受体的亲和力很低,说明化合物4j是对于κ阿片受体具有选择性高亲和力的配体化合物。我们选取代表性化合物4a、4b、4g、4i、4j、4m、μ阿片受体完全激动剂DAMGO、δ阿片受体完全激动剂DPDPE以及κ阿片受体完全激动剂U50,488进行[35S]GTPγS结合实验,验证化合物与μ,δ和k三种阿片受体结合对受体G蛋白的激动能力。体外功能活性[35S]GTPγS实验结果表明,潜力化合物4j对κ阿片受体具有完全激动的作用,但激动能力较弱。为了进一步研究化合物4j的药理学特性,我们选用了热板模型和醋酸扭体模型这两个镇痛动物模型来评价化合物4j的镇痛效果。化合物4j在热板实验和醋酸扭体试验中显示出相对较弱的镇痛作用,最大镇痛效果为50%,这些结果与化合物4j的功能活性评价结果一致。从药效学实验结果来看,化合物4j距离可应用于临床上的、高效的、安全的镇痛新药还有一定差距。其副作用评价尚未进行,化合物4j是否具有传统阿片类镇痛药不良反应以及中枢副作用还有待进一步验证。我们利用计算机分子对接技术,发现化合物4j芳基乙酰胺酰胺N上的氢原子可以与κ阿片受体中第二胞外区的C210形成氢键,且连接链更具柔性。我们推测这有可能是化合物4j具有较高的κ阿片受体亲和力和选择性的原因,这也为进一步优化化合物的结构提供了有益的参考。我们建立了一套药物筛选体系,在体内体外水平评价了潜在的阿片类镇痛药。为新型镇痛类κ阿片受体激动剂的开发提供了新思路。
杨菊[7]（2020）在《原位GPR17二聚结构模型解析和功能分析》文中指出800多个G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors）构成了重要的膜蛋白受体家族。GPCRs几乎参与所有生理过程的调节。30%以上的药物是以GPCR作为靶点。GPCRs的典型特征是具有七个跨膜螺旋（TM1-TM7）,并具有高度保守的三级结构。实验证据表明,GPCRs可以形成二聚体和高阶寡聚体。目前,人们普遍接受C类GPCRs可以形成二聚体并且以二聚或寡聚的形式发挥其功能,但A类GPCRs形成二聚结构的分子机制和功能相关性还有待进步一确定。C类GPCRs通常具有较大的胞外N末端结构域,能够通过N末端形成二聚。与C类GPCRs不同的是,A类GPCRs的N末端相对较短且通常无结构。研究表明,很多A类GPCRs在细胞膜中存在二聚和寡聚。一些重组表达的A类GPCR已获得了二聚的晶体结构。但这些结构并不一定代表它们在生理条件下的四级排列。多种实验方法已用于研究GPCRs的二聚体结构以及如何在细胞膜中二聚化。生物化学的方只能对GPCRs二聚和寡聚进行简单的定性研究。相比之下,使用荧光的方法,不仅可以获得结构的信息,而且能够用于原位细胞环境的研究。荧光的方法方主要是基于能量转移技术（RET）。在众多能量转移技术中,FLIM-FRET通过测量荧光寿命来计算FRET效率,不受蛋白表达量的影响,且对供体发射渗漏、光漂白、受体直接激发等因素不敏感。因此,提供了荧光团之间更精确的距离信息。GPR17属于A类GPCRs,与肾脏、心脏和脑缺血性损伤疾病密切相关。尿嘧啶核苷酸（例如UDP-glucose）可以激活GPR17,从而抑制腺苷酸环化酶并激活磷脂酶C（PLC）。而且,UDP-glucose的长时间刺激可能下调GPR17的信号,与ERK1/2激活和GPR17受体的内化有关。为了评估GPR17是否形成二聚以及如何形成二聚。本论文首先通过His tag pull-down和Western发现天然组织和转染的细胞中GPR17都能形成二聚。然后,基于FLIM-FRET获得了细胞水平的GPR17分子间的距离信息,结果表明两个GPR17分子采取特定的排列方式形成同源二聚体。进一步结合理论计算和分子动力学模拟表征了 GPR17二聚体的结构。结构计算和实验分析确定了二聚界面主要涉及到TM5。TM5上的F229是GPR17二聚界面的关键氨基酸。两个分子之间的F229的相互作用与二聚形成密切相关。将F229位氨基酸突变成Ala或Cys时,能强制GPR17形成单体或二聚,但受体的表达量基本不变。功能分析显示,单体和二聚形式的GPR17具有不同的生物学功能。当229位Phe突变成Ala,GPR17形成单体后,激动剂刺激不能激活ERK1/2,受体也不能内化。相反,229位Phe突变成Cys,两个GPR17分子之间的Cys形成二硫键,使GPR17能形成同源二聚。同源二聚状态的GPR17,与野生型GPR17生物学功能一样,激动剂刺激能导致细胞内钙升高、ERK1/2激活和受体内化。在GPCRs的胞外loop引入标记,通过FLIM-FRET获得多对分子间的距离。以获得的分子间距离作为约束,通过建模获得GPCRs在原位细胞膜中的同源二聚结构。可以预想,这种方法可以用于表征细胞中其他重要膜蛋白的相互作用。很多GPCRs,通过生化或荧光的方法检测可能存在同源二聚或异源二聚,但是还没有原子分辨率的结构,可以使用该方法研究他们的同源/异源二聚体结构以及如何在细胞膜中二聚化。
何焱[8]（2020）在《地佐辛阻断大鼠吗啡诱导的CPP复燃以及机制研究》文中研究指明吸毒和物质滥用问题是全人类健康共同面临的严重挑战。毒品泛滥不但引发严重的公共健康问题,而且与各种暴力犯罪和恐怖主义关联,轻则毁掉个人家庭,重则影响国家民族生存发展。根据联合国2015年世界毒品报告,仅截止2013年数据,全球吸毒和物质滥用人数达2.46亿,其中2700多万发展为问题吸毒者,即需要加以干预的药物成瘾、滥用以及精神依赖。随着医学临床和基础研究深入,成瘾相关机制深入到分子水平,生理依赖方面的临床治疗也取得了巨大成就。药物成瘾和精神依赖已被定义为一种慢性稽延性脑病,需要及时给予医疗措施和社会行为纠正的干预。在成瘾发展周期的三个不同阶段即滥用沉溺阶段,撤药和负面情绪阶段,渴求复吸阶段均导致和伴随不同神经适应性和可塑性的改变,并由此产生多样化的躯体依赖和精神依赖症状,并且这些改变互为因果互相促进。然而以心理依赖为基础的,综合多种社会、环境、心理因素诱导的再次物质滥用-复吸（Relapse,reinstatement）的有效且便利治疗手段,仍需要更多探索。主流替代疗法的药物,也常因本身的成瘾性,在临床使用中有较大顾虑。探索一种对精神依赖和复吸有效的,高安全性和低成瘾性已被临床实践验证,并且获取和使用都很便利的药物,作为一种新的处置鸦片成瘾的药物治疗解决方案,有着很必要的实际应用意义。地佐辛（Dezocine）86年首次由美国FDA核准上市,是瑞典Astra公司研发的一种化学结构与镇痛新相似,作用于鸦片受体的化合物,用于各种疼痛治疗,后由于对其药理学特征方面的争议,使用受到限制。近年Liu R等学者研究,明确了地佐辛对鸦片受体亚型的作用特点:部分激动μ、δ鸦片受体,拮抗κ鸦片受体;同时还新发现了其两个分子靶点,即去甲肾上腺素（NE）和5-羟色胺（5-HT）转运体蛋白。在体外实验中其通过浓度依赖的方式影响两种转运体蛋白功能,抑制5-HT和NE再摄取。在本研究中,我们使用改良Maldonado戒断症状评分以及研究物质成瘾生理和精神依赖觅药行为的经典动物模型-条件性位置偏爱（CPP）模型,来验证和量化评价地佐辛对吗啡成瘾的治疗效果。多巴胺和环磷酸腺苷调节的磷蛋白（DARPP32）是腺苷酸环化酶的主要作用靶点,DA激动其受体促进该蛋白磷酸化。相关脑区p-DARPP32蛋白水平改变,反映了多巴胺受体介导的细胞应答强度,产生奖赏效应,直接影响了机体成瘾和觅药行为的表现。我们观测大脑奖赏系统几个主要多巴胺能神经元投射脑区,即腹侧被盖区、伏隔核、海马、前额皮质内p-DARPP32蛋白水平改变,探讨大脑奖赏系统兴奋性和行为学改变的对应关系,由此推断地佐辛对吗啡成瘾和复吸的治疗作用的可能神经机制。地佐辛能缓解大鼠急性吗啡戒断症状并阻断吗啡诱导的CPP复燃。在急性戒断期的前4天,地佐辛治疗组大鼠的撤药症状（Maldonado评分）就明显较自然戒断的对照组轻;急性戒断期的后3天,治疗组大鼠的撤药症状评分与丁丙诺啡治疗组和对照组相仿。在整个急性戒断期间,地佐辛治疗组Maldonado评分也未有剧烈的改变。7天急性戒断期后,该组使用纳洛酮诱发的撤药综合征也较其它组别大鼠轻。CPP行为已经成功消退的大鼠,以小剂量（2mg/kg）吗啡点燃条件,不能使地佐辛治疗组大鼠重新点燃CPP,其治疗效果与已在临床使用的丁丙诺啡相仿。接下来的实验中,我们设计了一组特异性κ受体激动剂U50488剂量梯度,观察地佐辛原有的κ受体拮抗效应被削弱,但是保留其μ受体弱的部分激动效应时,地佐辛阻断大鼠CPP复燃的,是否因伍用的U50488剂量变化而受到的影响。结果显示,伍用U50488的剂量为0.33mg/kg、1mg/kg、3mg/kg时,特异性κ受体激动剂U50488对地佐辛的治疗作用没有影响;而U50488的使用剂量达到5mg/kg时,地佐辛的治疗作用大部分消失。这个现象揭示,激动κ受体可翻转地佐辛阻断大鼠小剂量吗啡（2mg/kg）诱导的CPP复燃效应,而其弱的μ受体部分激动效应未能在本实验中显示明显的CPP复燃阻断作用。随后通过配伍使用μ受体拮抗剂纳洛酮,以拮抗其μ受体的部分激动效应,再观察地佐辛阻断CPP复燃治疗作用的变化,发现此时治疗作用未受影响。由此我们推断,地佐辛治疗中发挥主要作用的是其κ受体拮抗的药理特性。而其弱的μ受体部分激动效应,在治疗作用中处于相对次要的地位。最后一部分实验研究中,我们通过观察脑内多巴胺奖赏系统回路中几个主要多巴胺能神经元投射脑区内p-DARPP32蛋白相对表达量和其阳性细胞数量的改变,发现呈现CPP复燃被阻断的处理组大鼠,脑内奖赏系统主要脑区的p-DARPP32蛋白相对表达均增加,该蛋白表达的阳性细胞数量也明显增多,而CPP复燃未被阻断的大鼠,这两项指标并没有发生改变,两项指标在实验大鼠脑内奖赏系统主要核团中显示相同一致的变化规律。同时实验结果还显示,发生两项指标增高的实验组大鼠,大脑奖赏系统内被观察的四个主要脑区之间的数据没有显着差别,表明CPP复燃被阻断的大鼠脑,奖赏系统回路主干同步发生多巴胺递质介导的细胞应答增强,普便存在多巴胺递质的“过流效应”,系统奖赏阈值提升,此为地佐辛治疗吗啡成瘾的主要神经机制。在本部分研究中,我们未观察到多巴胺合成限速酶-多巴脱羧酶发生相应的增加,提示增加的多巴胺递质并非通过生物合成增强的渠道提供。由此推测可能由相关脑区神经元细胞κ受体拮抗介导的胞膜Ca2+通道功能改变,使细胞外液较高浓度Ca2+内流入胞,进一步介导胞浆中的多巴胺囊泡胞吐作用增强所致,此推论尚需更深入的研究证实。对大鼠脑脊液中去NE和5-HT浓度的检测,我们首次证实了地佐辛在活体动物体内也可影响NE和5-HT两种神经递质在中枢神经系统中的水平,使之在脑脊液中的浓度升高,推测其在活体动物体内亦可与体外一样,浓度依赖地抑制NE和5-HT转运体蛋白的功能,抑制递质再摄取。综上所述,本研究的结果表明:地佐辛不仅可以有效缓解吗啡成瘾大鼠的急性撤药综合征,而且也可以有效阻断小剂量吗啡对已经自然熄灭的条件性位置偏爱行为的复燃。这种现象显示了该药物在治疗鸦片类物质成瘾戒断综合征以及防治精神依赖和复吸方面的应用前景。其治疗作用机制主要由其κ受体拮抗效应诱导大脑奖赏系统神经回路主干中多巴胺递质释放增多的“过流效应”致奖赏阈值升高所致;其弱的μ受体部分激动效应也参与发挥了相对较次要的作用。证实了地佐辛在活体动物体内可对脑脊液中去甲肾上腺素和5-羟色胺浓度水平产生上调作用。目前地佐辛作为一种围术期镇痛药物,在临床上使用广泛,其无成瘾性以及无呼吸抑制作用的安全性已得到实践的验证,是一种非管制类药物。相比其它管制类治疗鸦片成瘾的替代药物有更好的使用便利性和安全性。
邵帅[9]（2020）在《A20增强吗啡镇痛机制研究》文中认为阿片类镇痛药物是目前临床常用的镇痛药,具有强效镇痛作用。然而阿片类镇痛药在其发挥强大的镇痛作用同时,也会产生药物成瘾、耐受、呼吸抑制、便秘等副作用,这大大限制了其在临床上的使用。因此,如何使阿片类镇痛药在发挥镇痛作用的同时,尽可能减少其伴随的不良反应就成为人们重点研究的问题。阿片受体主要分为μ、δ、κ三种受体亚型,其中μ阿片受体（mu opioid receptor,MOR）是镇痛药物的主要作用靶点。其激活的主要过程是当阿片类药物激活MOR后,下游的G蛋白发生解离,使得环磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate,c AMP）被抑制,偶联的离子通道开放。激活后的受体会被激酶磷酸化,进而引起β-arrestin2的招募,受体内吞和下游信号通路的激活。目前已经发现许多蛋白参与MOR的调控,他们通过调节MOR的修饰或影响MOR的激活过程,或者影响MOR本身受体数量,来调控MOR的功能。实验室前期发现A20 binding inhibitor of NF-κB activation 1（ABIN-1）蛋白可以调控MOR的功能。在进一步的文献调研中,我们发现TNF alpha induced protein 3（A20）蛋白通常和ABIN-1蛋白共同在多个信号通路中发挥作用。目前研究表明A20主要在炎症相关信号通路中起到抑制炎症发生的作用,同时也与多种免疫疾病的发生密切相关。但是关于A20在中枢神经系统中发挥作用的研究目前还很少。最近有文献报道以A20为靶标的micro RNA可以影响MOR激动剂吗啡的镇痛和耐受,但其机制尚不明确。因此我们推测A20和ABIN-1蛋白一样也可以影响MOR的功能。综上,本课题旨在研究A20蛋白是否能影响MOR的功能,并对其可能的影响机制进行进一步的探索,从而为设计合成高效低毒的阿片类镇痛药提供理论基础和设计思路。研究目的:研究A20对于MOR功能的影响及其机制探究,为研究新型镇痛药奠定基础。研究方法:1.利用小鼠热板法甩尾法研究A20对吗啡镇痛、耐受的影响1.1小鼠热板法镇痛模型在小鼠脊髓过表达或敲减A20,通过热板法镇痛模型比较小鼠痛反应时间反映吗啡镇痛程度的变化,评价A20对吗啡镇痛的影响。1.2小鼠热板法慢性耐受模型在小鼠脊髓过表达或敲减A20,通过热板法慢性耐受模型比较小鼠吗啡镇痛作用的下降程度,评价A20对吗啡耐受的影响。1.3小鼠热甩尾法镇痛模型在小鼠脊髓过表达或敲减A20,通过热甩尾法镇痛模型比较小鼠甩尾反应时间反映吗啡镇痛程度的变化,评价A20对吗啡镇痛的影响。1.4小鼠热甩尾法慢性耐受模型在小鼠脊髓过表达或敲减A20,通过热甩尾法慢性耐受模型比较小鼠吗啡镇痛作用的下降程度,评价A20对吗啡耐受的影响。1.5小鼠热板法急性耐受模型在小鼠脊髓过表达A20,通过热板法急性耐受模型比较小鼠吗啡镇痛作用的下降程度,评价A20对吗啡急性耐受的影响。2.A20对于MOR下游AC-c AMP-PKA通路和MOR S375磷酸化的影响2.1 A20对于MOR下游c AMP的影响在MOR-293T细胞中分别过表达、敲减、回转A20蛋白,通过LANCE c AMP Assay和Glo Sensor c AMP Assay检测MOR下游c AMP含量的变化,观察A20对MOR下游c AMP的影响。2.2 A20对于MOR下游Protein kinase A（PKA）重分布的影响在MOR-PKA-GFP-CHO细胞中过表达A20和A20 C103A突变体通过高内涵分析仪器分析荧光PKA在细胞中的重分布现象,观察A20对MOR下游PKA的影响。2.3 A20对MOR S375磷酸化的影响在MOR-CHO细胞中过表达或敲减A20,通过Western blot分析A20对于MOR激动剂引起的S375磷酸化程度的影响。3.A20通过抑制β-arrestin2招募上膜进而影响MOR的内吞机制增强MOR的功能3.1 A20与β-arrestin2相互作用3.1.1免疫共沉淀在293T细胞中过表达β-arrestin2和A20,通过免疫共沉淀检测A20和β-arrestin2的相互作用。3.1.2 His-Pull down在293T细胞中过表达A20蛋白,免疫共沉淀检测A20和His纯化的β-arrestin2相互作用。3.1.3 Nano Bit Assay在293T细胞中过表达带有荧光素酶片段的A20和β-arrestin2蛋白,通过检测体系化学发光的变化研究A20和β-arrestin2相互作用。3.1.4免疫荧光在293T细胞中转染连接不同颜色荧光蛋白的A20和β-arrestin2,通过观察荧光在细胞中的分布,研究A20和β-arrestin2相互作用。3.2 A20对β-arrestin2招募上膜的影响3.2.1高内涵分析在MOR-β-arrestin2-e GFP-CHO细胞中过表达A20,通过高内涵分析带有荧光的β-arrestin2上膜程度观察A20对β-arrestin2招募上膜的影响。3.2.2 Nano Bit Assay在293T细胞中过表达A20和带荧光素酶片段的MOR和β-arrestin2蛋白。通过检测体系化学发光的变化观察A20对β-arrestin2招募上膜的影响。3.3 A20对MOR受体内吞的影响3.3.1荧光抗体标记膜上MOR在SNAP-MOR-CHO细胞中过表达A20,用荧光抗体标记细胞膜上MOR,通过检测细胞荧光值的变化研究A20对MOR内吞的影响。3.3.2分离细胞膜蛋白在小鼠脊髓和SNAP-MOR-CHO细胞中分别过表达A20,分离细胞膜蛋白,通过检测膜上MOR含量的变化,观察A20对MOR内吞的影响。3.4敲减β-arrestin2对于A20功能的影响3.4.1β-arrestin2敲除小鼠在β-arrestin2敲除小鼠脊髓过表达A20蛋白,通过热板法测量吗啡镇痛效果,观察敲除β-arrestin2对A20功能的影响。3.4.2 Glo Sensor c AMP Assay在MOR-293T细胞中敲减β-arrestin2后再过表达A20,或过表达A20后再敲减β-arrestin2,通过Glo Sensor c AMP Assay观察敲减β-arrestin2对A20功能的影响。研究结果:1.A20增强吗啡镇痛,抑制急性耐受但不影响慢性耐受。1.1 A20增强吗啡镇痛作用热板法吗啡镇痛结果显示,过表达A20组小鼠镇痛率均显着高于对照组,A20可以增强吗啡的镇痛作用;敲减A20组小鼠镇痛百分率较对照组出现了一定程度的下降,表明敲减A20可以减弱吗啡的镇痛作用。1.2 A20不影响吗啡慢性耐受的形成热板法和热甩尾法结果显示,过表达或敲减A20后小鼠均形成了吗啡慢性耐受,表明A20对慢性耐受的形成没有影响。1.3 A20抑制吗啡急性耐受的形成热板法实验结果显示,给予大剂量吗啡后,小鼠形成了吗啡急性耐受,过表达A20组小鼠急性耐受程度小于对照组,表明A20可以抑制吗啡急性耐受的形成。2.A20增强MOR下游AC-c AMP-PKA信号通路,抑制S375磷酸化2.1 A20增强MOR对下游c AMP-PKA通路的抑制作用LANCE c AMP Assay和Glo Sensor c AMP Assay实验结果表明,过表达A20可增强MOR对下游c AMP的抑制,敲减A20减弱该抑制作用。PKA重分布实验结果表明,过表达A20可以增强MOR对下游PKA重分布的抑制作用,过表达A20 C103A突变体则无此作用。2.2 A20抑制MOR S375磷酸化实验结果显示,过表达A20后MOR S375磷酸化水平降低,敲减A20后MOR S375磷酸化水平上升。表明A20可以抑制MOR S375磷酸化。3.A20通过抑制β-arrestin2招募上膜进而影响MOR内吞的机制增强MOR的功能。3.1 A20与β-arrestin2存在相互作用免疫共沉淀和Nano Bit Assay实验结果表明,A20和β-arrestin2存在相互作用,并且在激动剂刺激的条件下相互作用进一步增强,免疫荧光实验结果表明在A20和β-arrestin2细胞中具有明显的共定位现象。3.2 A20抑制β-arrestin2招募上膜高内涵分析和Nano Bit Assay实验结果显示,过表达A20组β-arrestin2招募上膜程度明显小于对照组,说明A20可以抑制β-arrestin2招募上膜。3.3 A20抑制MOR内吞荧光抗体标记膜蛋白实验结果显示,过表达A20后,细胞膜表面的MOR数量相比对照组明显增加,说明A20抑制了MOR的内吞作用。3.4敲减β-arrestin2后A20不能影响MOR功能实验结果显示,在动物和细胞中敲减β-arrestin2后,A20都不能再增强MOR的功能。表明A20增强MOR功能需要β-arrestin2参与。研究结论:1.A20增强吗啡的镇痛作用,抑制吗啡急性耐受的形成,但不影响吗啡慢性耐受的形成。2.A20增强MOR由激动剂引起的对下游AC-c AMP-PKA信号通路的抑制作用。3.A20通过与β-arrestin2相互作用,抑制β-arrestin2招募上膜,进而抑制MOR的内吞,提高MOR膜上数量。4.A20需要通过β-arrestin2蛋白影响MOR的功能。
康新乐[10]（2020）在《蜕皮激素通过G蛋白偶联受体调控昆虫变态发育和易化扩散进入细胞的研究》文中指出研究背景、存在的科学问题及研究意义昆虫的生长发育由多种激素共同调控,包括20-羟基蜕皮酮（20E）、保幼激素（JH）和胰岛素,20E与JH和胰岛素相互作用调控昆虫生长发育和蜕皮变态。昆虫变态期间体内发生着剧烈的变化,如幼虫中肠的凋亡、成虫中肠的形成、脂肪体的解体和重构、成虫盘的生长和脑结构的重塑等,20E在其中起着非常重要的作用。通常,蜕皮激素通过结合蜕皮激素的核受体（EcR）来发挥作用,起始20E早晚期基因的表达,启动变态程序,即20E基因组信号途径。近年来,越来越多的研究证明在经典的20E基因组信号途径之外,存在20E非基因组途径,即20E通过激活细胞膜上的受体引发胞内钙离子和cAMP水平的快速变化,进而引起一系列蛋白质的翻译后修饰,调控基因转录和变态发育。G蛋白偶联受体（GPCR）是一类七次跨膜的蛋白家族,在传递各种信号中起到重要的作用,是各种药物的作用靶标。研究发现GPCR作为固醇类激素的受体,在20E调控昆虫的变态发育中发挥作用。果蝇多巴胺蜕皮激素受体DmDopEcR可以结合20E类似物,被认为是20E的膜受体,但DopEcR在20E信号途径中的功能并不清楚,并且棉铃虫中还报道了另外两个传递20E信号的GPCR,但没有检测到它们结合20E。前期研究还发现20E进入细胞的量是受到控制的,但机制和生物学效应并不清楚。这些研究打破了 20E是通过自由扩散进入细胞与核受体结合启动相关基因转录的经典理论,其尚待阐明的科学问题对于确立类固醇激素的细胞膜受体及其信号途径的新理论具有重要的支撑意义。本论文用重大农业害虫棉铃虫（Helicoverpa armigera）为模型,研究DopEcR在20E信号途径中的功能并证明GPCR可以结合20E,GPCR控制20E进入细胞的机制和生物学效应,丰富和完善20E非基因组信号途径及调控昆虫变态发育的分子机制。研究结果完全变态昆虫在末龄幼虫的最后阶段停止取食,然后发生变态。但是,幼虫停止取食的机制尚不清楚。使用农业害虫棉铃虫作为模型,揭示了 20E与多巴胺受体（DopEcR）（一种G蛋白偶联受体）结合,以停止幼虫取食并促进化蛹。DopEcR在各种组织中均有表达,并在20E调节下的蜕皮变态过程中表达水平升高。幼虫取食阶段的20E滴度较低,而游走阶段的20E滴度较高。相比之下,多巴胺（DA）滴度在幼虫取食阶段较高,而在游走阶段较低。使用多巴胺受体抑制剂flupentixol阻断多巴胺受体或20E注射均可以减少幼虫的食物消耗和体重。敲降DopEcR可以抑制幼虫的取食、生长和化蛹。20E通过DopEcR促进细胞凋亡,DA通过DopEcR诱导细胞增殖。20E通过抑制DA诱导的细胞增殖和AKT的磷酸化来对抗DA功能。20E通过DopEcR诱导基因表达,并使细胞内钙离子和cAMP水平快速增加。20E诱导DopEcR与Gαs和Gαq相互作用。20E通过DopEcR诱导20E信号途径关键蛋白磷酸化和EcRB1-USP1转录复合物与蜕皮激素响应元件EcRE的结合。DopEcR可以在细胞膜或从细胞膜分离后结合20E。DopEcR结合20E位点的突变降低了 20E结合水平和相关的细胞快速反应。研究结果表明20E通过与DA竞争结合DopEcR,抑制幼虫进食并促进化蛹。在棉铃虫中阐明了一种GPCR（命名为GPCR-3）通过触发G蛋白介导的信号级联并形成四聚体促进20E进入细胞传递类固醇激素20E信号。通过虫体RNA干扰从棉铃虫转录组数据库中筛选出GPCR-3参与20E信号途径。虫体干扰GPCR-3导致延迟化蛹或形成嵌合蛹,抑制幼虫中肠和脂肪体的降解,并抑制20E诱导的基因表达。20E诱导GPCR-3与Gαq和Gαs相互作用,并使细胞内钙离子、cAMP和蛋白磷酸化迅速增加。GPCR-3定位于细胞质膜中,20E诱导下被GPCR激酶2（GRK2）磷酸化后内化降解脱敏20E信号,β-arrestin-1和网格蛋白介导GPCR-3的内化。GPCR-3可在细胞膜中和分离后在体外结合20E。20E与GPCR-3的结合诱导GPCR-3的同源二聚体形成同源四聚体,GPCR-3的同源四聚体促进20E进入细胞并传递20E信号。GPCR-3同源四聚体作为20E细胞膜受体并促进20E扩散进入细胞,控制不同组织中20E的滴度,进而调节变态发育中不同组织的发育命运—调亡或增殖生长。结论及科学意义1.本论文研究了 DopEcR在昆虫取食和化蛹中的双重功能,DA通过DopEcR促进幼虫的进食和生长,20E与DA竞争结合DopEcR,并通过DopEcR作为细胞膜受体之一来传递20E信号,从而促进昆虫变态,揭示了类固醇激素与多巴胺系统的互作,阐明了 20E抑制鳞翅目昆虫取食并促进变态发育的分子机制,为类固醇激素信号途径及其与神经系统互作提供了新的理论,为害虫控制提供了新的生长调节剂的研制靶点。2.证明了 ErGPCR-2可以结合20E,支持了前面的研究结论—ErGPCR-2是20E的细胞膜受体。3.证明了 GPCR-3是20E的细胞膜受体,20E结合并诱导GPCR-3形成同源四聚体传导20E信号,并作为转运蛋白易化20E扩散进入细胞。首次发现GPCR可以通过形成同源四聚体促进20E的细胞导入。
二、EFFECTS OF SEVERAL RGSS ON ADENYLATE CYCLASE (AC) ASSOCIATED WITH MU AND DELTA OPIOD-RECEPTORS（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、EFFECTS OF SEVERAL RGSS ON ADENYLATE CYCLASE (AC) ASSOCIATED WITH MU AND DELTA OPIOD-RECEPTORS（论文提纲范文）
（2）Dynorphin在光周期诱导花鲈生殖发育中的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 花鲈简介 |
| 1.2 动物季节性繁殖 |
| 1.3 Dyn研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 花鲈血管囊定位与细胞培养 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验器材 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 获取花鲈脑组织 |
| 2.2.2 石蜡组织切片的制作和染色 |
| 2.2.3 花鲈血管囊细胞培养 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 脑组织整体结构 |
| 2.3.2 血管囊的结构 |
| 2.3.3 花鲈血管囊细胞培养 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 LmDyn基因的克隆与序列分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验用鱼 |
| 3.1.2 实验器材 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 获取花鲈组织 |
| 3.2.2 抽提花鲈总RNA并测其纯度 |
| 3.2.3 cDNA第一条链的合成 |
| 3.2.4 LmDyn基因ORF克隆 |
| 3.2.5 LmDyn基因序列的生信分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 LmDyn序列特征 |
| 3.3.2 LmDyn多重序列比对分析 |
| 3.3.3 LmDyn进化树关系分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 LmDyn/LmKor表达模式 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验用鱼 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 LmDyn和LmKor在各组织中的定量分析 |
| 4.2.2 LmDyn在各性腺发育期的定量分析 |
| 4.2.3 不同光周期处理下LmDyn的表达模式分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 LmDyn和LmKor在各组织中的表达分布 |
| 4.3.2 LmDyn在各性腺发育时期的表达模式 |
| 4.3.3 光周期处理对花鲈LmDyn在体水平的影响 |
| 4.3.4 光周期处理对花鲈LmDyn离体水平的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 LmDyn信号传导途径与调控模式 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验用鱼 |
| 5.1.2 实验细胞株与质粒 |
| 5.1.3 实验器材 |
| 5.1.4 实验试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 双荧光素酶报告 |
| 5.2.2 光周期处理下相关生殖调控基因的定量分析 |
| 5.2.3 LmDyn多肽孵育细胞后相关生殖调控基因的定量分析 |
| 5.2.4 注射LmDyn多肽后相关生殖调控基因的定量分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 双荧光素酶报告 |
| 5.3.2 光周期处理下相关生殖调控基因的表达变化 |
| 5.3.3 LmDyn多肽孵育细胞后相关生殖调控基因的表达变化 |
| 5.3.4 注射LmDyn多肽后相关生殖调控基因的表达变化 |
| 5.4 讨论 |
| 第二部分 花鲈垂体下丘脑生物钟基因在三种光周期下的表达节律分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 实验器材 |
| 6.1.3 实验试剂 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 光周期处理 |
| 6.2.2 荧光定量PCR |
| 6.2.3 数据分析 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 生物钟基因在花鲈垂体内的昼夜节律 |
| 6.3.2 生物钟基因在花鲈下丘脑内的昼夜节律 |
| 6.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）神经肽受体GPR103信号转导机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 人神经肽QRFP及其受体的研究现状 |
| 1.1.1 RFa神经肽 |
| 1.1.2 QRFP及其受体GPR103 的发现 |
| 1.1.3 QRFP及其受体介导的生理功能 |
| 1.2 G蛋白偶联受体信号转导研究 |
| 1.2.1 G蛋白偶联受体活化的结构基础 |
| 1.2.2 G蛋白偶联受体变构调节 |
| 1.2.3 G蛋白偶联受体偏向性信号转导 |
| 1.3 G蛋白偶联受体蛋白翻译后修饰 |
| 1.3.1 蛋白翻译后修饰 |
| 1.3.2 GPCR中的蛋白翻译后修饰 |
| 1.3.3 糖基化修饰在GPCR中的作用 |
| 1.4 参与胰岛素分泌调控的GPCRs |
| 1.4.1 胰岛β细胞中GPCR的表达 |
| 1.4.2 GPCR调控胰岛素分泌机制 |
| 1.5 前景展望 |
| 1.6 研究意义 |
| 第二章 人神经肽QRFP与其受体相互作用的结构基础 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 GPR103 配体 43RFa活性明显高于配体 26RFa |
| 2.3.2 26RFa和43RFa通过GPR103 激活不同的信号通路 |
| 2.3.3 GPR103/43RFa复合物结构的同源建模 |
| 2.3.4 突变体K189A、D191A和 K196A对 43RFa介导下游信号通路的影响 |
| 2.3.5 L202A和 Y214A突变为丙氨酸对43RFa介导下游信号通路的影响 |
| 2.3.6 配体截断体 35RFa及突变体 35RFa-F10A对受体激活的影响 |
| 2.3.7 43RFa和26RFa及35RFa-F10A对胰岛素分泌的调节作用 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 GPR103 N-糖基化对配体结合和受体激活影响及其机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 GPR103 N-糖基化发生在N端结构域和第一个胞外环上 |
| 3.3.2 GPR103 糖基化不影响细胞表面表达 |
| 3.3.3 N-连接糖基化的缺失削弱了激动剂介导的信号转导 |
| 3.3.4 N-连接的糖基化是配体与受体结合所必需的 |
| 3.3.5 N-糖基化在GPR103 功能选择性中的作用 |
| 3.3.6 内源性GPR103 的N-糖基化对于受体激活至关重要 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 全文总结 |
| 4.1 主要研究成果 |
| 4.2 本文创新点 |
| 4.3 本文的不足与后续研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）局麻药过敏的回顾性分析及MRGPRX2参与类过敏反应肥大细胞脱颗粒的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 临床研究 局麻药过敏的回顾性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 基础研究 |
| 第一部分 稳定过表达MRGPRX2细胞模型用于评价麻醉药物潜在的类过敏作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MRGPRX2参与吗啡诱导肥大细胞脱颗粒的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 MRGPRX2在类过敏反应中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）中医药多维干预吗啡成瘾的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词中英文对照 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 一、现代医学对阿片类药物成瘾的认识及治疗 |
| 1.现代医学对阿片类药物成瘾的认识 |
| 1.1 阿片类药物 |
| 1.2 吗啡作用的分子机制 |
| 1.3 吗啡成瘾 |
| 2.现代医学对阿片类药物成瘾的治疗 |
| 二、中医对阿片类药物成瘾的认识及治疗 |
| 1.中医对阿片类药物成瘾的认识 |
| 2.中医药对阿片类药物成瘾的治疗 |
| 2.1 中药及其单体对阿片类药物成瘾的治疗 |
| 2.2 中药复方对阿片类药物成瘾的治疗 |
| 2.3 针刺对阿片类药物成瘾的治疗 |
| 三、BDNF信号通路及多巴胺能神经元结构可塑性与阿片类药物成瘾的关系 |
| 1.中脑多巴胺能神经元的结构可塑性 |
| 2.神经营养因子及其信号通路 |
| 3.BDNF通路在阿片类药物成瘾的多巴胺能神经元结构可塑性中的关键作用 |
| 第二部分 复方511干预吗啡成瘾的作用及机制研究 |
| 实验一 复方511对小鼠吗啡成瘾相关行为学的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 复方511的制备 |
| 2.2 条件性位置偏爱实验 |
| 2.3 自发运动实验 |
| 2.4 吗啡急性戒断实验 |
| 2.5 自身给药实验 |
| 2.6 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 复方511对吗啡诱导的条件性位置偏爱的影响 |
| 3.2 复方511对吗啡诱导的行为敏化的影响 |
| 3.3 复方511对吗啡急性戒断症状的影响 |
| 3.4 复方511对吗啡自身给药行为的影响 |
| 4.小结 |
| 实验二 复方511对吗啡成瘾小鼠VTA基因表达谱的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物组织 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 总RNA提取与质控 |
| 2.2 测序 |
| 3.结果 |
| 3.1 测序数据的质控情况 |
| 3.2 序列比对分析 |
| 3.3 表达量分析 |
| 3.4 表达差异分析 |
| 3.5 功能富集分析 |
| 4.小结 |
| 实验三 复方511对吗啡成瘾小鼠VTA BDNF信号通路和多巴胺能神经元结构可塑性的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物组织 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实时荧光定量PCR |
| 2.2 蛋白免疫印迹 |
| 2.3 免疫组织化学染色 |
| 2.4 免疫荧光染色 |
| 2.5 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 复方511对吗啡成瘾小鼠VTA BDNF mRNA和蛋白的影响 |
| 3.2 复方511对吗啡成瘾小鼠VTA BDNF特异性受体TrkB mRNA和蛋白的影响 |
| 3.3 复方511对吗啡成瘾小鼠VTA BDNF下游ERK通路的影响 |
| 3.4 复方511对吗啡成瘾小鼠VTA BDNF下游PI3K-Akt通路的影响 |
| 3.5 复方511对吗啡成瘾小鼠VTA BDNF下游PLCγ1通路的影响 |
| 3.6 复方511对吗啡成瘾小鼠VTA多巴胺能神经元结构可塑性的影响 |
| 4.小结 |
| 第三部分 电针干预吗啡成瘾的作用及机制研究 |
| 实验一 电针对小鼠吗啡成瘾相关行为学的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 条件性位置偏爱实验 |
| 2.2 吗啡急性戒断实验 |
| 3.结果 |
| 3.1 电针对吗啡诱导的条件性位置偏爱的影响 |
| 3.2 电针对吗啡急性戒断症状的影响 |
| 4.小结 |
| 实验二 电针对吗啡成瘾小鼠NAc circRNA表达谱的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物组织 |
| 1.2 主要仪器设 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 测序数据的质控情况 |
| 3.2 序列比对分析 |
| 3.3 CircRNA获取 |
| 3.4 CircRNA注释 |
| 3.5 CircRNA表达量分析 |
| 3.6 CircRNA差异分析 |
| 3.7 CircRNA来源基因富集分析 |
| 3.8 CircRNA和miRNA互作分析 |
| 3.9验证数据 |
| 4.小结 |
| 第四部分 复方511联合电针干预吗啡成瘾的作用研究 |
| 实验一 复方511联合电针对小鼠吗啡成瘾相关行为学的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 条件性位置偏爱实验 |
| 2.2 吗啡急性戒断实验 |
| 3.结果 |
| 3.1 复方511联合电针对吗啡诱导的条件性位置偏爱的影响 |
| 3.2 复方511联合电针对吗啡急性戒断症状的影响 |
| 4.小结 |
| 第五部分 讨论 |
| 一、动物模型及行为学评价方法的选择 |
| 1.条件性位置偏爱 |
| 2.行为敏化 |
| 3.戒断反应 |
| 4.自身给药行为 |
| 二、复方511干预吗啡成瘾的机制探讨 |
| 1.复方511干预阿片类药物成瘾的机理探讨 |
| 2.关于复方511对吗啡成瘾小鼠VTA基因表达谱影响的探讨 |
| 3.关于复方511对吗啡成瘾小鼠VTA BDNF信号通路影响的探讨 |
| 三、电针干预吗啡成瘾的机制探讨 |
| 1.电针干预阿片类药物成瘾的机理探讨 |
| 2.关于电针对吗啡成瘾小鼠NAc circRNA表达谱影响的探讨 |
| 四、复方511联合电针干预吗啡成瘾作用机制的探讨 |
| 第六部分 总结 |
| 一、本论文结论 |
| 二、本论文的创新性 |
| 三、不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1、软件信息 |
| 2、差异表达基因 |
| 3、差异表达基因的GO富集 |
| 4、差异表达基因的KEGG富集 |
| 5、差异CircRNA信息 |
| 6、差异CircRNA来源基因的GO富集 |
| 7、差异CircRNA来源基因的KEGG富集 |
| 8、差异CircRNA的miRNA靶点 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）4’-氨基取代苯蒂巴因类似物生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 疼痛 |
| 1.2 阿片类镇痛药 |
| 1.2.1 阿片类镇痛药概述 |
| 1.2.2 阿片类镇痛药分类 |
| 1.2.3 阿片类镇痛药副作用 |
| 1.3 阿片受体的分类 |
| 1.3.1 阿片受体概述 |
| 1.3.2 μ阿片受体 |
| 1.3.3 δ阿片受体 |
| 1.3.4 κ阿片受体 |
| 1.4 α,14α-内亚乙基氨苯基蒂巴因κ配基设计、合成 |
| 1.4.1 “信使”与“位码” |
| 1.4.2 6α,14α-内亚乙基氨苯基蒂巴因系列化合物设计、合成 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 阿片受体细胞株的构建 |
| 2.2.2 细胞传代培养 |
| 2.2.3 细胞计数 |
| 2.2.4 细胞复苏 |
| 2.2.5 细胞冻存 |
| 2.2.6 细胞膜蛋白的制备 |
| 2.2.7 BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度 |
| 2.2.8 放射性配体-受体竞争结合实验 |
| 2.2.9 [35S]GTPγS结合实验 |
| 2.2.10 热板实验 |
| 2.2.11 醋酸扭体实验 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 稳定表达μ、κ、δ阿片受体的CHO细胞大规模培养 |
| 3.2 化合物对阿片受体的亲和力和选择性 |
| 3.2.1 选择性配基与阿片受体的亲和力 |
| 3.2.2 4'-氨基取代苯蒂巴因类似物对μ、δ、κ阿片受体的亲和力 |
| 3.3 [~(35)S]GTPγS实验测定候选化合物对偶联G蛋白的激活作用 |
| 3.3.1 选择性配基对μ、δ、κ阿片受体G蛋白的激动能力 |
| 3.3.2 4'-氨基取代苯蒂巴因类似物对μ、δ、κ阿片受体偶联G蛋白的激动能力 |
| 3.4 候选化合物在不同镇痛模型中的镇痛作用 |
| 3.4.1 候选化合物4j在热板实验中是否有镇痛作用 |
| 3.4.2 候选化合物4j在醋酸扭体实验中是否有镇痛作用 |
| 3.5 计算机分子对接模拟 |
| 3.5.1 候选化合物与μ阿片受体的分子对接 |
| 3.5.2 候选化合物与κ阿片受体的分子对接 |
| 3.5.3 选择性配体U50,488与κ阿片受体的分子对接 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 候选化合物4j对κ阿片受体的亲和力和选择性 |
| 4.2 候选化合物4j在镇痛模型上的的镇痛效果 |
| 4.3 新型κ阿片受体激动剂的开发前景 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 选择性κ阿片受体激动剂 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（7）原位GPR17二聚结构模型解析和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 G蛋白偶联受体简介 |
| 1.1.1 G蛋白偶联受体的分类 |
| 1.1.2 G蛋白偶联受体的结构 |
| 1.1.3 G蛋白偶联受体的激活和功能 |
| 1.1.4 G蛋白偶联受体的配体 |
| 1.1.5 G蛋白偶联受体的寡聚 |
| 1.1.6 G蛋白偶联受体17 |
| 1.2 膜蛋白相互作用研究方法 |
| 1.2.1 生物化学方法 |
| 1.2.2 荧光光谱方法 |
| 1.2.3 生物物理方法 |
| 1.2.4 计算方法 |
| 1.3 FLIM-FRET |
| 1.3.1 荧光基本知识 |
| 1.3.2 荧光寿命 |
| 1.3.3 荧光寿命成像技术 |
| 1.3.4 荧光共振能量转移 |
| 1.3.5 荧光寿命成像-荧光共振能量转移 |
| 1.4 本论文研究的目标与任务 |
| 第2章 细胞水平GPR17同源二聚结构的解析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试剂、耗材和仪器 |
| 2.2.2 基本生化和细胞实验方法 |
| 2.2.3 生化实验方法检测膜蛋白二聚 |
| 2.2.4 多位点荧光标记GPCR |
| 2.2.5 FLIM-FRET的测量 |
| 2.2.6 二聚结构建模 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 生化实验方法检测GPP17二聚结果 |
| 2.3.2 多位点荧光标记GPCRs结果 |
| 2.3.3 FLIM-FRET测量结果 |
| 2.3.4 二聚结构建模结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 GPR17能形成同源二聚和高阶寡聚 |
| 2.4.2 Split-GFP能有效对GPR17进行多位点荧光标记 |
| 2.4.3 两个GPR17分子采取特定的排列方式形成同源二聚体 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 GPR17同源二聚功能的分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试剂、耗材和仪器 |
| 3.2.2 突变结构验证 |
| 3.2.3 突变体FLIM-FRET测量 |
| 3.2.4 细胞水平cAMP水平的检测 |
| 3.2.5 细胞内钙变化的检测 |
| 3.2.6 ERK1/2激活的检测 |
| 3.2.7 GPR17内化的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 GPR17突变结构表达检测结果 |
| 3.3.2 细胞水平cAMP水平的检测结果 |
| 3.3.3 细胞内钙变化的检测结果 |
| 3.3.4 ERK1/2激活的检测结果 |
| 3.3.5 GPR17内化的检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 TM5上的F229是GPR17形成同源二聚体的关键氨基酸 |
| 3.4.2 氨基酸的突变可以强制GPCR形成单体或二聚 |
| 3.4.3 GPR17单体和二聚均能抑制cAMP形成 |
| 3.4.4 GPR17二聚介导了UDP-glucose刺激引起的Gαq信号通路的改变 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 总结与展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A: 激光共聚焦显微成像 |
| 附录B: 本课题使用的质粒和引物 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（8）地佐辛阻断大鼠吗啡诱导的CPP复燃以及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 地佐辛缓解大鼠急性吗啡戒断症状以及阻断吗啡诱导的CPP复燃 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 激动κ受体与拮抗μ受体对地佐辛阻断大鼠 CPP 行为复燃的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 地佐辛阻断CPP复燃时大脑奖赏系统主要脑区相关蛋白质和神经递质的变化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 鸦片类成瘾和强啡肽/KAPPA鸦片受体系统 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（9）A20增强吗啡镇痛机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 A20对于吗啡镇痛、耐受的影响 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 1.过表达A20腺相关病毒构建(西贝宏程公司完成) |
| 2.敲减A20腺相关病毒构建 |
| 3.腺相关病毒鞘内注射 |
| 4.小鼠镇痛、耐受模型 |
| 5.脊髓组织全蛋白提取 |
| 6.BCA蛋白定量 |
| 7.小鼠灌流固定取材 |
| 8.免疫荧光 |
| 9.脊髓组织炎性因子RT-PCR检测 |
| 10.数据分析 |
| 四、实验结果 |
| 1.过表达A20腺相关病毒的构建 |
| 2.敲减A20腺相关病毒的构建 |
| 3.过表达A20腺相关病毒在小鼠脊髓表达结果 |
| 4.敲减A20 蛋白结果Western blot验证 |
| 5.小鼠热板法镇痛模型上过表达A20增强吗啡镇痛 |
| 6.小鼠热板法镇痛模型上过表达A20不影响吗啡慢性耐受 |
| 7.小鼠热甩尾法镇痛模型上过表达A20增强吗啡镇痛 |
| 8.小鼠热甩尾法耐受模型上过表达A20不影响吗啡慢性耐受 |
| 9.小鼠热板法镇痛模型上敲减A20减弱吗啡镇痛 |
| 10.小鼠热板法耐受模型上敲减A20不影响吗啡慢性耐受 |
| 11.小鼠热甩尾法镇痛模型上敲减A20减弱吗啡镇痛 |
| 12.小鼠热甩尾法耐受模型上敲减A20不影响吗啡慢性耐受 |
| 13.小鼠热板法急性耐受模型过表达A20减弱吗啡急性耐受 |
| 14.过表达A20不影响小鼠脊髓炎性蛋白的表达 |
| 五、本章小结 |
| 第二章 A20对MOR磷酸化以及下游信号通路的影响 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 1.siRNA序列筛选 |
| 2.LANCE cAMP Assay |
| 3.Glo Sensor cAMP Assay |
| 4.PKA重分布实验 |
| 5.A20 对于MOR的 S375 位点和ERK1/2 磷酸化的影响 |
| 6.数据分析 |
| 四、实验结果 |
| 1.过表达A20 增强MOR的功能(LANCE,Glo Sensor) |
| 2.过表达A20对DOR,KOR功能无影响(LANCE) |
| 3.siRNA序列筛选 |
| 4.敲减A20 减弱MOR的功能(Glo Sensor) |
| 5.检测敲减A20 后再回转A20对MOR功能的影响(Glo Sensor) |
| 6.过表达A20 C103A突变体不影响MOR的功能(Glo Sensor) |
| 7.过表达A20 增强MOR的功能(PKA) |
| 8.过表达A20 C103A突变体不影响MOR的功能(PKA) |
| 9.过表达A20降低MORS375磷酸化水平 |
| 10.敲减A20增强MORS375磷酸化水平 |
| 五、本章小结 |
| 第三章 A20 通过β-arrestin2 影响MOR受体内吞 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 1.质粒构建 |
| 2.免疫共沉淀 |
| 3.His-Pull down |
| 4.Nano Bit assay |
| 5.免疫荧光检测A20和β-arrestin2 相互作用 |
| 6.高内涵检测β-arrestin2 招募 |
| 7.Nano Bit assay检测β-arrestin2 招募 |
| 8.荧光抗体标记膜上MOR检测内吞 |
| 9.膜分离检测MOR内吞 |
| 10.膜分离检测吗啡耐受小鼠脊髓MOR变化 |
| 11.A20 对于β-arrestin2 基因敲除小鼠MOR功能的影响 |
| 12.敲减β-arrestin2后A20对MOR功能的影响(Glo Sensor) |
| 13.数据分析 |
| 四、实验结果 |
| 1.pcDNA-3.0-Flag-β-arrestin2 质粒构建 |
| 2.A20和β-arrestin2 存在相互作用(免疫共沉淀) |
| 3.His-β-arrestin2 蛋白表达纯化 |
| 4.A20和β-arrestin2 相互作用(His-Pull down) |
| 5.Nano BiT Assay相关质粒构建 |
| 6.A20和β-arrestin2 相互作用(Nano BiT) |
| 7.A20和β-arrestin2 共定位(免疫荧光实验) |
| 8.A20 抑制β-arrestin2 招募(高内涵分析) |
| 9.A20 抑制β-arrestin2 招募(Nano Bit) |
| 10.A20抑制MOR内吞(荧光抗体标记膜蛋白) |
| 11.A20抑制MOR内吞(细胞膜分离) |
| 12.A20提高小鼠耐受后脊髓细胞膜MOR含量 |
| 13.A20 不影响β-arrestin2 敲除小鼠的吗啡镇痛 |
| 14.在β-arrestin2 敲减后A20 不能影响MOR的功能 |
| 五、本章小结 |
| 讨论与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（10）蜕皮激素通过G蛋白偶联受体调控昆虫变态发育和易化扩散进入细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 激素调控昆虫变态发育 |
| 2 20E作用的分子机制 |
| 2.1 蜕皮激素及其对蜕皮变态的调控 |
| 2.2 20E基因组信号途径 |
| 2.3 20E非基因组信号途径 |
| 2.4 20E的运输方式 |
| 3 存在的科学问题,研究方案和意义 |
| 第二章 蜕皮激素竞争结合多巴胺/蜕皮激素受体抑制鳞翅目昆虫取食并促进化蛹的研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 在20E调节下,DopEcR在大脑中高表达 |
| 3.2 20E抑制幼虫取食,DA参与幼虫取食 |
| 3.3 干扰DopEcR可以减少幼虫进食并延迟化蛹 |
| 3.4 20E拮抗多巴胺功能 |
| 3.5 DopEcR参与20E信号途径 |
| 3.6 DopEcR与Gαq和Gαs相互作用以调节蛋白质的磷酸化 |
| 3.7 DopEcR结合20E的结构模拟 |
| 3.8 DopEcR结合20E |
| 4 讨论 |
| 4.1 20E与DopEcR结合导致幼虫停止进食并传导化蛹信号 |
| 4.2 GPCR结合20E |
| 4.3 20E上调DopEcR表达 |
| 4.4 多个GPCR传输20E信号 |
| 5 结论 |
| 第三章 蜕皮激素诱导G蛋白偶联受体3形成同源四聚体传递信号并通过该受体易化扩散进入细胞 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 GPCR-3参与20E信号途径 |
| 3.2 GPCR-3变态过程中表达上调 |
| 3.3 GPCR-3干扰抑制20E诱导的化蛹、组织重塑和基因表达 |
| 3.4 GPCR-3参与了20E诱导的快速细胞反应和蛋白质磷酸化 |
| 3.5 20E诱导GPCR-3的磷酸化和内化 |
| 3.6 GPCR-3结合20E |
| 3.7 GPCR-3以同源二聚体存在,并通过20E诱导为同源四聚体 |
| 3.8 GPCR-3促进20E进入细胞 |
| 4 讨论 |
| 4.1 20E通过GPCR-3传输信号和终止信号 |
| 4.2 多个GPCR结合20E的细胞膜受体 |
| 4.3 20E促进GPCR-3形成同源四聚体易化20E进入细胞 |
| 4.4 GPCR-3四聚体增加组织中20E滴度进而促进细胞凋亡 |
| 5 结论 |
| 第四章 论文创新点总结及意义 |
| 4.1 论文创新点总结及意义 |
| 4.2 后期工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、EFFECTS OF SEVERAL RGSS ON ADENYLATE CYCLASE (AC) ASSOCIATED WITH MU AND DELTA OPIOD-RECEPTORS（论文参考文献）
- [1]鞘内注射C-末端酯化的内吗啡肽类似物的镇痛活性研究[D]. 杨文娇. 哈尔滨工业大学, 2021
- [2]Dynorphin在光周期诱导花鲈生殖发育中的分子机制[D]. 袁满. 上海海洋大学, 2021(01)
- [3]神经肽受体GPR103信号转导机制研究[D]. 王伟伟. 浙江大学, 2021(01)
- [4]局麻药过敏的回顾性分析及MRGPRX2参与类过敏反应肥大细胞脱颗粒的机制研究[D]. 左君. 北京协和医学院, 2021
- [5]中医药多维干预吗啡成瘾的作用及机制研究[D]. 张晗. 南京中医药大学, 2021(01)
- [6]4’-氨基取代苯蒂巴因类似物生物活性研究[D]. 蒋爽. 南京中医药大学, 2021
- [7]原位GPR17二聚结构模型解析和功能分析[D]. 杨菊. 中国科学院大学(中国科学院精密测量科学与技术创新研究院), 2020(01)
- [8]地佐辛阻断大鼠吗啡诱导的CPP复燃以及机制研究[D]. 何焱. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [9]A20增强吗啡镇痛机制研究[D]. 邵帅. 军事科学院, 2020(02)
- [10]蜕皮激素通过G蛋白偶联受体调控昆虫变态发育和易化扩散进入细胞的研究[D]. 康新乐. 山东大学, 2020(08)