一、卵巢肿瘤细胞DNA含量的定量分析及其临床意义（论文文献综述）
李艳芳[1]（2021）在《雄激素/雄激素受体影响上皮性卵巢癌发生发展的实验研究》文中研究指明卵巢癌在全球女性妇科疾病中病死率居首位,也是第五大癌症相关死亡原因。据估计,全球每年有近30万卵巢癌新增病例,死亡病例高达18万左右,严重威胁女性健康。卵巢癌有多种病理亚型,其中上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）最常见,约占据全部卵巢癌的70%。由于缺乏早期临床表现及早期的筛查手段,导致大部分EOC患者就诊时已属晚期。目前,上皮性卵巢癌一线治疗方案仍然是满意的肿瘤细胞减灭术联合以铂类为主的化疗。尽管近30年以来,外科手术操作日益精湛,化疗药物研发也日新月异,但是晚期EOC患者的5年生存率并没有显着的提高。因此为上皮性卵巢癌提供新的治疗方案或治疗靶点一直都是该领域的研究热点及难点。卵巢不仅是性激素的分泌器官,也是性激素的靶器官,卵巢的生理、病理和性激素密切相关。流行病学研究发现EOC的发病年龄多集中在围绝经及绝经后妇女。围绝经期及绝经后期女性体内性激素特点发生了巨大变化,主要表现为雌激素、孕激素水平快速而又剧烈降低,而雄激素水平随着年龄的增长降低较平缓,并维持多年;另一方面由于雌激素的显着下降,使得血清中雄激素与雌激素的比例上升显着,性激素结合球蛋白降低,使得游离雄激素增高。因此,围绝经期及绝经后妇女的雄激素水平处于相对或绝对过剩状态。这一特点是否与EOC发病风险增加相关?研究结果尚不统一,早年的研究多认为二者无相关性,但是最近美国的一项病例对照研究对1331例EOC病例和3017例对照组确诊前循环雄激素水平进行测定,结果认为睾酮水平与EOC风险呈正相关。多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）患者、肥胖患者循环中游离睾酮较正常人升高,与EOC的发病风险呈现正相关,而口服避孕药可以降低循环雄激素,因此可以降低EOC发病风险。有服用雄激素病史的女性EOC发病风险显着增加。综上,诸多证据表明雄激素在EOC的发生发展中发挥着重要的作用。但是无论是氟他胺、还是比卡鲁胺抗雄激素治疗EOC的Ⅱ期临床研究中均未取得显着的抗肿瘤作用,这一结论与流行性学、体内外的实验研究相矛盾,引发广大学者的思考。本研究拟利用河北医科大学第二医院确诊的卵巢癌患者组织标本并结合卵巢癌细胞系,探讨雄激素、雄激素受体在上皮性卵巢癌中的影响作用,并初步探索其相关作用机制。第一部分雄激素受体在上皮性卵巢癌组织及癌旁组织中的表达及其临床意义目的:本研究拟利用河北医科大学第二医院确诊的上皮性卵巢癌患者癌组织标本及其癌旁正常卵巢组织标本进行研究,探索雄激素受体在上皮性卵巢癌组织中的表达及其临床意义。方法:收集2010年10月-2013年1月在河北医科大学第二医院妇科就诊并手术病理确诊的上皮性卵巢癌患者组织标本共116例,取材后及时石蜡包埋组织,所有患者术前均未进行任何内分泌治疗,且不合并其他系统的原发性恶性肿瘤、严重全身感染以及其他甲状腺功能亢进、甲状腺功能减低等内分泌疾病。术后严密随访患者五年。临床资料及随访资料完整者标本,委托上海芯超生物有限公司制备组织芯片,再次经病理医师确诊、定位取材,排除因肿瘤坏死严重、标本取材不准确等原因导致的不合格标本,组织芯片最终共包含87点,其中上皮性卵巢癌组织共70点,癌旁组织17点,每点直径1.5 mm。标本收集及病史采集均征得相关人员知情同意,并得到河北医科大学第二医院伦理委员会批准。用免疫组化SP法对组织芯片进行雄激素受体检测,以PBS代替一抗作为阴性对照。共取组织芯片5张,厚度5μm,其中一张用于组织HE染色,一张用于阴性对照,另外三张用于雄激素受体检测。结果判读由TG公司的全景组织细胞定量分析系统（Strata FAXS-样本分析系统）分析。同时用传统的十三点评分法核对自动分析结果。结果:1.上皮性卵巢癌组织及癌旁组织中AR的表达情况组织芯片的免疫组织化学染色结果显示AR在细胞核表达,DAB染色呈棕色及棕褐色颗粒。在上皮性卵巢癌组中,AR阳性率（67.1%）明显高于癌旁组织中（41.2%）,差异有统计学意义（P=0.048）;全景组织细胞定量系统分析结果显示在卵巢癌组织中的AR表达水平为1.51（8.64）,明显高于卵巢癌旁组织0.94（1.98）,差异有统计学意义（P=0.017）。因资料呈非正态分布,使用中位数（四分位间距）进行描述,非参数秩和检验进行比较。2.AR在上皮性卵巢癌患者中表达的临床意义上皮性卵巢癌患者中,以AR是否表达分为AR阳性组和AR阴性组。AR阳性组的年龄54（24）、孕次3（2）、产次2（2）与AR阴性组的年龄54（13）、孕次3（3）、产次2（1）相比,差异无统计学意义（P>0.05）。因年龄、孕产次资料不符合正态分布,因此结果用中位数（四分位间距）描述,非参数秩和检验进行统计分析。按FIGO分期分组,I-ⅡA期的AR阳性率68.2%,ⅡB-IV的AR阳性率66.7%,两组之间无统计学差异（P=0.900）;按病理分型分组,AR阳性率在卵巢浆液性癌组为72.9%,非浆液性癌组为54.5%,两组之间比较无统计学差异（P=0.129）;按肿瘤临床分级分组,在低级别的EOC中AR阳性率（76%）明显高于高级别的EOC（50%）,差异有统计学意义（P=0.041）。3.AR与卵巢癌预后的关系利用AR表达情况将上皮性卵巢癌组分为AR阳性组和AR阴性组利用Kaplan-Meier法分析两组EOC患者的生存情况,结果显示AR阳组患者预后较差（P=0.009）。小结:1.AR在上皮性卵巢癌组织中表达水平明显高于癌旁组织。2.AR的表达与患者年龄、孕产次、血浆CA125、肿瘤FIGO分期、肿瘤病理亚型无关;然而,AR在低级别的上皮性卵巢癌中的表达水平明显高于高级别上皮性卵巢癌。3.AR阳性为卵巢上皮性癌患者的一个不良预后因素。第二部分雄激素/雄激素受体对上皮性卵巢癌细胞增殖的影响目的:拟利用两种上皮性卵巢癌细胞系SKOV3、A2780为研究对象，探索雄激素（睾酮）对卵巢癌细胞增殖的影响,并进一步揭示经典的AR在其中所发挥的作用。方法:1.免疫荧光及Western blot方法检测SKOV3、A2780细胞系中AR表达情况。2.MTS方法检测不同浓度睾酮对SKOV3、A2780细胞的增殖的影响,并确定最适浓度及最适时间,作为后续研究的实验条件。每种细胞依据睾酮浓度及作用时间分为八组,分别为对照组（DMSO组）,1 n M处理组（T=1n M）,10 n M处理组（T=10 n M）,100 n M处理组（T=100 n M）,每组设两个时间,分别为24 h,48 h。3.氟他胺预处理SKOV3细胞1 h后,MTS检测睾酮促进SKOV3细胞增殖的影响。实验分组为对照组（DMSO组）,睾酮组（T）,氟他胺组（F）,氟他胺联合睾酮组（T+F）。4.利用质粒（sh310-AR）转染技术敲低SKOV3细胞的AR,利用RT-PCR检测质粒转染后AR核酸水平,同时利用WB检测转染后AR蛋白水平以确定sh310-AR对AR的敲低效力,MTS方法检测睾酮对于敲低AR的SKOV3细胞的促增殖作用。5.利用质粒（AB6398-AR）转染技术过表达SKOV3细胞的AR,利用RT-PCR、WB分别从RNA、蛋白水平促检测转染效率,MTS方法检测睾酮对于过表达AR的SKOV3细胞的增殖作用。6.利用质粒（AB6398-AR）转染技术将AR基因转入A2780细胞,利用RT-PCR、WB分别从RNA、蛋白水平检测转染效率,MTS方法检测睾酮对于转入AR基因的A2780细胞的促增殖作用。结果:1.免疫荧光检测结果显示SKOV3细胞AR高表达（37.88±8.64）,A2780细胞无明显AR表达;WB结果与免疫荧光结果相同,SKOV3细胞（0.40±0.13）,A2780细胞（0.01±0.00）,差异有显着性（P=0.008）。2.不同浓度的睾酮作用于SKOV3细胞24 h后,结果表明睾酮可以明显促进SKOV3细胞增殖,各组OD值:DMSO（2.01±0.01）、T=1 n M（2.22±0.08）、T=10 n M（2.35±0.10）、T=100 n M（2.44±0.06）,促增殖率分别为:10.45%（T=1 n M）、16.92%（T=10 n M）和21.39%（T=100 n M）,差异有显着性（P<0.05）;组间比较睾酮组与DMSO对照组均有显着差异（P<0.05）,T=1n M与其他各组之间差异有显着性（P<0.05）,然而T=10n M组与T=100 n M组之间无差异。当睾酮作用时间延长至48 h,各组OD值DMSO（2.00±0.69）、T=1 n M（2.24±0.07）、T=10 n M（2.25±0.12）、T=100 n M（2.13±0.10）;促细胞增殖率分别为12.15%（T=1 n M）、12.45%（T=10 n M）、6.35%（T=100 n M）,差异有显着性。三个浓度组组间比较:与DMSO组相比,T=1 n M、T=10n M组细胞增殖活力明显增强,差异有统计学意义;T=1 n M组与T=10 n M组比较差异无显着性,T=100 n M组较T=1 n M、T=10 n M促增殖率明显降低,但无统计学差异。相同浓度的睾酮、不同的时间组进行比较:T=1 n M时,24 h组与48h组比较差异无统计学意义;T=10 n M时,24 h组的睾酮促增殖率显着高于48 h组,差异有统计学意义;T=100 n M时,24 h组的睾酮促增殖率显着高于48 h组,比较差异有统计学意义。不同浓度的睾酮作用于A2780细胞24 h后,各组OD值分别为:DMSO（1.98±0.61）、T=1 n M（1.94±0.05）、T=10 n M（1.95±0.04）、T=100 n M（1.92±0.06）,各组之间差异无统计学意义。作用时间延长至48 h,各组OD值DMSO（1.90±0.12）、T=1 n M（1.89±0.13）、T=10 n M（1.86±0.18）、T=100 n M（1.88±0.14）,各组之间差异无统计学意义。3.氟他胺预处理SKOV3细胞1 h后,各组OD值:DMSO组（1.73±0.27）、睾酮组（2.14±0.34）、氟他胺（1.35±0.04）、氟他胺+睾酮（1.43±0.07）,差异有统计学意义。组间比较:睾酮组较DMSO组细胞增殖能力明显升高,有统计学差异;氟他胺联合睾酮组较睾酮组细胞增殖能力明显降低,差异有统计学意义;氟他胺组与DMSO组差异无统计学意义;氟他胺组与氟他胺联合睾酮组差异无统计学意义。4.sh310-AR转染细胞SKOV3后,RT-PCR检测AR-mRNA在sh310-AR/SKOV3细胞中（0.13±0.01）较sh310-NC/SKOV3细胞（0.62±0.07）显着降低,差异有统计学意义（P=0.005）;WB检测AR蛋白在sh310-AR/SKOV3细胞中（0.03±0.02）较sh310-NC/SKOV3细胞（0.22±0.05）也显着降低,差异有统计学意义（P=0.004）;睾酮作用于转染前后的SKOV3细胞24 h,结果表明睾酮对sh310-AR/SKOV3细胞的促增殖作用（1.71±0.09）较sh310-NC/SKOV3细胞（1.87±0.09）显着降低,差异有统计学意义（P=0.043）。5.AB6398-AR转染细胞SKOV3后,RT-PCR检测AR-m RNA在AB6398-AR/SKOV3细胞中（0.77±0.02）较AB6398-NC/SKOV3细胞（0.57±0.01）显着升高,差异有统计学意义（P<0.001）;WB检测AR蛋白在AB6398-AR/SKOV3细胞中（0.60±0.16）较AB6398-NC/SKOV3细胞（0.25±0.12）也显着升高,差异有统计学意义（P=0.040）;睾酮作用于转染前后的SKOV3细胞24 h,结果表明睾酮对AB6398-AR/SKOV3细胞的促增殖作用（2.77±0.12）较AB6398-NC/SKOV3细胞（2.34±0.12）显着升高,差异有统计学意义（P=0.001）。6.AB6398-AR转染细胞A2780后,RT-PCR检测AR-m RNA在AB6398-AR/A2780细胞中（0.77±0.01）较AB6398-NC/A2780细胞（0.46±0.07）显着升高,差异有统计学意义（P=0.002）;WB检测AR蛋白在AB6398-AR/A2780细胞中（0.00±0.00）较AB6398-NC/A2780细胞（0.00±0.00）无明显变化,差异无统计学意义（P=0.317）;睾酮作用于转染前后的A2780细胞24 h,结果表明睾酮对AB6398-AR/A2780细胞的促增殖作用（2.50±0.02）与AB6398-NC/A2780细胞（2.51±0.02）无差别,差异无统计学意义（P=0.134）。小结:1.睾酮可以促进AR阳性的SKOV3细胞增殖,对于AR阴性的A2780细胞无促增殖作用。2.睾酮对SKOV3细胞的促增殖作用可以被AR拮抗剂氟他胺所阻断。3.敲低/过表达SKOV3细胞的AR可以阻断/增强睾酮对SKOV3细胞的促增殖作用。第三部分雄激素/雄激素受体影响上皮性卵巢癌发生发展的相关机制研究目的:初步探求PI3K/AKT信号通路在雄激素/雄激素受体促进上皮性卵巢癌发生发展中的作用。方法:1.免疫组织化学染色法检测上皮性卵巢癌组织及癌旁组织中AKTp-AKT的表达。2.利用Western blot检测SKOV3、A2780细胞内AKT和p-AKT蛋白水平。3.敲低SKOV3细胞中AR对AKT、p-AKT的表达水平的影响。4.过表达SKOV3细胞中AR对AKT、p-AKT的表达水平的影响。5.MTS法检测PI3K/AKT信号通路抑制剂BEZ235对睾酮的促SKOV3细胞增殖作用的影响。结果:1.上皮性卵巢癌组织及癌旁组织中均有较高水平AKT、p-AKT表达,胞核胞浆中均可见。经半定量后统计分析,因评分结果不符合正态分布,因此结果用中位数（四分位间距）描述,非参数秩和检验进行数据分析。AKT表达水平在上皮性卵巢癌组织为6（3.75）,癌旁组织为5（2）,两组相比差异无显着性（P=0.815）,而p-AKT蛋白水平在在上皮性卵巢癌组织为2（5）,癌旁组织为2（1.25）,两组之间比较差异有统计学意义（P=0.034）。两组p-AKT/AKT的比值也存在显着差异,在卵巢癌组织中0.67（0.67）,在癌旁组织中0.33（0.23）,差异有统计学意义（P=0.005）,与AR的表达规律一致。2.SKOV3细胞的AKT（1.16±0.18）和p-AKT（0.66±0.19）蛋白水平均显着高于A2780细胞的AKT（0.39±0.10）和p-AKT（0.10±0.05）蛋白水平,差异有统计学意义（AKT:P=0.003、p-AKT:P=0.009）。同时SKOV3细胞的p-AKT/AKT值（0.56±0.08）亦高于A2780细胞（0.28±0.14）,差异有统计学意义（P=0.041）。3.sh310-AR转染细胞SKOV3细胞后,AKT的表达水平在sh310-AR/SKOV3细胞（1.75±0.08）与sh310-NC/SKOV3细胞（1.74±0.25）中无明显差异（P=0.953）,但p-AKT表达水平在sh310-AR/SKOV3细胞（0.15±0.06）中较sh310-NC/SKOV3细胞（0.50±0.08）显着下降,差异有统计学意义（P=0.001）。4.AB6398-AR转染细胞SKOV3细胞后,AKT的表达水平在AB6398-AR/SKOV3细胞（0.83±0.05）较AB6398-NC/SKOV3（0.86±0.12）无明显差异（P=0.681）,但p-AKT表达水平在AB6398-AR/SKOV3细胞（0.68±0.09）较AB6398-NC/SKOV3（0.33±0.20）显着升高,差异有统计学意义（P=0.002）。5.不同浓度的BEZ235处理SKOV3细胞24 h后,spss软件probit模块计算IC50=187 n M。BEZ235与睾酮联合作用于SKOV3细胞24 h后,各组OD值DMSO组（2.09±0.10）、睾酮组（2.71±0.12）、BEZ235（1.55±0.12）、BEZ235+睾酮（1.50±0.15）,差异有显着性。其中BEZ235+睾酮组SKOV3细胞的增殖能力较单纯睾酮组显着下降（P<0.001）,BEZ235组与BEZ235+睾酮组之间细胞增殖能力无显着差异（P=0.606）。小结:1.在上皮性卵巢癌组织及癌旁组织中,AKT的表达水平无显着差异p-AKT的表达水平在癌组织中显着高于癌旁组织,且p-AKT/AKT比值在上皮性卵巢癌组织中也较高。2.在AR阳性的SKOV3细胞中,AKT、p-AKT的表达水平以及p-AKT/AKT比值均高于AR阴性的A2780细胞。3.敲低/过表达SKOV3细胞的AR,会相应降低/增加AKT的磷酸化水平,而总AKT水平无显着变化。4.PI3K/AKT信号通路抑制剂BEZ235可以阻断睾酮对SKOV3细胞的促增殖作用。
孙冶[2]（2021）在《miRNA-21调控PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制肿瘤细胞糖酵解改善NSCLC顺铂耐药及参麦注射液干预机制的研究》文中指出目的:目前,肺癌的发病率及病死率仍居恶性肿瘤首位。肺癌的治疗中,非小细胞肺癌首选铂类药物为基础的联合化疗方案,但逐渐增多的铂类药物耐药性严重影响了NSCLC的治疗。为此,本研究以人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP细胞为模式细胞,首先采用高通量测序（RNA-Seq）方法分析其与亲本A549细胞差异表达基因,并利用GO Terms和KEGG进行差异基因的功能富集分析,筛选出NSCLC顺铂耐药差异基因功能分区。其次,基于RNA-Seq筛选结果,探讨miRNA-21靶向肿瘤细胞糖酵解途径调控NSCLC顺铂耐药的分子机制。最后,利用古方参冬饮的现代中药制剂—参麦注射液为益气养阴法代表方药干预体外培养的A549/DDP细胞,探讨参麦注射液逆转NSCLC顺铂耐药的分子药理机制,为益气养阴法治疗NSCLC提供实验室数据。材料与方法:论文一:（1）细胞培养A549细胞及A549/DDP细胞于含10%FBS的DMEM培养液中,在37℃、95%湿度、5%CO2条件下进行培养。A549/DDP细胞于低浓度顺铂（7μM）环境下持续培养以保持其顺铂耐药性,并于实验前2周更换为无顺铂的培养液。（2）CCK-8法检测A549/DDP细胞耐药指数取对数生长期的A549细胞和A549/DDP细胞接种于96孔板,贴壁过夜。去掉培养液,加入含不同浓度顺铂的DMEM培养液干预细胞24 h,每孔加入10μL的CCK-8溶液,在37℃孵育4 h后,于OD460nm处检测吸光度值,根据改良寇式计算公式计算出IC值。（3）细胞葡萄糖及乳酸含量测定对数生长期的A549细胞及A549/DDP细胞,经胰酶消化后收集细胞,每1×106个细胞加入0.1 m L的裂解液裂解细胞,将工作液与样品稀释液混合,于37oC反应20 min,测定OD530nm值。（4）RNA-Seq测序分析A549细胞及A549/DDP细胞经trizol抽提得到总RNA、构建测序文库、Real Time PCR方法对文库进行定量、RNA-Seq表达量分析、基因表达水平的PCA和相关性分析、基因/转录本差异表达分析、功能基因和涉及的信号通路富集分析,分析A549/DDP细胞差异基因的表达谱。（5）Real Time PCR验证RNA-Seq结果的准确性收集A549细胞和A549/DDP细胞,提取总RNA、反转录反应及Real Time PCR反应验证差异基因的表达情况。论文二:（1）miRNA-21 sponge转染细胞实验A549/DDP细胞接种到24孔板,细胞密度在60-80%,将Golden Tran DR试剂和miRNA-21 NC/miRNA-21 sponge混合后立即加入至细胞表面,培养56 h后,进行mRNA或蛋白检测。（2）miRNA-21 sponge联合顺铂干预A549/DDP细胞检测细胞糖酵解水平收集并裂解A549/DDP细胞,将葡萄糖和乳酸检测试剂工作液与样品稀释液混合,在37oC温箱内,反应20 min,测定OD530nm值。（3）miRNA-21 sponge联合顺铂干预A549/DDP细胞检测信号通路蛋白表达水平分别收集顺铂、miRNA-21 sponge及联合干预的A549/DDP细胞,裂解细胞提取各组细胞的总蛋白,BCA方法对各组细胞的总蛋白含量进行测定,利用免疫印迹方法和Image J软件分析蛋白表达水平的差异。（4）LC3B荧光斑点的检测4%多聚甲醛固定A549/DDP细胞,加入1%Tritonx-100溶液浸润细胞,再加入LC3B抗体4℃下孵育过夜,最后加入FITC标记的兔源Ig G二抗孵育1 h,在荧光显微镜下观察并拍照。（5）透射电镜观察细胞死亡情况胰酶消化A549/DDP细胞后离心收集细胞,加入2.5%戊二醛过夜,磷酸盐缓冲液洗涤后加入饿酸固定液固定2 h,磷酸盐缓冲液洗涤后,进行梯度脱水,丙酮与包埋剂进行包埋和渗透,进行切片,且对切片进行醋酸双氧铀染色和柠檬酸铅染色,最后透射电镜观察并拍照。论文三:（1）CCK-8法测定参麦注射液干预A549/DDP细胞活力A549/DDP细胞接种于96孔板,贴壁过夜后去掉培养液,加入含不同浓度参麦注射液的DMEM培养液干预细胞24 h。每孔加入10μL的CCK-8溶液,在37℃孵育4 h后,于OD460nm处检测吸光度值,根据改良寇式计算公式计算出IC值。（2）参麦注射液联合顺铂干预A549/DDP细胞检测糖酵解水平收集并裂解A549/DDP细胞,将葡萄糖和乳酸检测试剂工作液与样品稀释液混合,在37oC温箱内,反应20 min,测定OD530nm值。（3）参麦注射液联合顺铂干预A549/DDP细胞检测信号通路蛋白表达水平分别收集顺铂、参麦注射液及联合干预的A549/DDP细胞,裂解细胞提取各组细胞的总蛋白,BCA方法测定各组细胞的总蛋白含量,利用免疫印迹方法和Image J软件分析蛋白表达水平差异。（4）Ed U方法检测参麦注射液联合顺铂干预A549/DDP细胞增殖能力4%多聚甲醛固定A549/DDP细胞,加入甘氨酸溶液中和甲醛,加入0.5%Triton X-100通透液,然后加入Ed U染色,最后加入Hoechst 33342复染,置于DAPI和CY3荧光模块下进行观察并获取图片。结果:论文一1.A549/DDP细胞与A549细胞在形态、顺铂敏感性及糖酵解水平上存在差异在高倍镜下观察,顺铂耐药A549/DDP细胞和其亲本A549细胞在形态上存在显着的差异,相比于A549细胞,A549/DDP细胞体积和细胞间隙明显增大。利用不同浓度顺铂分别干预A549细胞与A549/DDP细胞,CCK-8法获得两株细胞的IC50值分别为:37.8μM和63.3μM。A549/DDP细胞耐药指数（Resistant index,RI）为1.67,即与A549细胞相比,A549/DDP细胞具有更高的顺铂耐药性。此外,获得A549/DDP细胞的IC5、IC10及IC20值分别为6.6、12.3及23.3μM。通过对葡萄糖消耗和乳酸生成的测定,结果显示A549/DDP细胞糖酵解水平显着高于A549细胞糖酵解水平。2.RNA-Seq数据分析及差异表达基因功能富集分析利用高通量测序（RNA-Seq）比较A549/DDP细胞与其亲本A549细胞的差异基因表达。与A549细胞相比,A549/DDP细胞上调的差异表达基因约有2200个,下调的差异表达基因约有4300个。通过Real Time PCR的方法,将A549/DDP细胞中差异表达基因上调前8位和下调前8位的基因做进一步验证,结果显示与RNA-Seq测序结果基本一致。此外,研究这些差异基因所涉及的调控通路,我们通过GO Terms和KEGG进行富集分析结果显示A549/DDP细胞发生显着变化的有:细胞周期、DNA复制、代谢途径和酶活性等。3.调控糖代谢通路的ceRNA网络构建和miRNA预测将差异显着的糖代谢基因（PKM2,LDHA,ALDOA,ENO1,ENO2,HK1,PGAM1）利用Target Scan和miRNA软件对microRNA靶标进行预测,构建ceRNA网络图。此外,还通过Pubmed数据库、Embase数据库及CBM数据库挖掘miRNA-21可能与NSCLC顺铂耐药相关。论文二1.miRNA-21在A549/DDP细胞中高表达Real Time PCR结果显示,与其亲本A549细胞相比,miRNA-21在顺铂耐药A549/DDP细胞中高表达,miRNA-21在A549/DDP细胞中的表达上调了5倍。2.miRNA-21 sponge联合顺铂通过干预PI3K/Akt/m TOR/HIF-1α信号通路抑制A549/DDP细胞的糖酵解在前面的结果中已经证明,miRNA-21在A549/DDP细胞中高表达,为了进一步研究miRNA-21在A549/DDP细胞中的功能,我们构建了miRNA-21 sponge（质粒型microRNA抑制子载体）抑制miRNA-21的表达。通过葡萄糖和乳酸检测试剂盒测定,与miRNA-21 NC和顺铂单独干预A549/DDP细胞相比,miRNA-21 sponge联合顺铂共同干预A549/DDP细胞可降低细胞葡萄糖消耗、丙酮酸生成及乳酸生成。此外,通过Western blot方法检测miRNA-21 sponge联合顺铂可显着降低A549/DDP细胞糖酵解相关酶PKM2和LDHA蛋白的表达。进一步研究发现,miRNA-21 sponge联合顺铂通过干预PI3K/Akt/m-TOR/HIF-1α信号通路,降低A549/DDP细胞的糖酵解水平。3.miRNA-21 sponge联合顺铂诱导A549/DDP细胞凋亡及自噬性死亡首先,通过观察荧光标记的LC3B抗体发现,顺铂、miRNA-21sponge及miRNA-21sponge联合顺铂干预后的A549/DDP细胞,细胞内发生不同程度的自噬作用,miRNA-21sponge联合顺铂共同干预A549/DDP细胞时产生的自噬小体数量最多。其次,通过DAPI对细胞核进行染色观察发现,顺铂、miRNA-21sponge及miRNA-21sponge联合顺铂共同干预A549/DDP细胞核周围均出现了核碎片,且miRNA-21sponge联合顺铂共同干预A549/DDP细胞时产生的核碎片数量最多。最后通过透射电镜观察,顺铂和miRNA-21sponge单独干预A549/DDP细胞可明显观察到自噬小体和自噬溶酶体数量的增多,当miRNA-21sponge联合顺铂共同干预A549/DDP细胞时,A549/DDP细胞周围出现了坏死。此外,通过Western blot方法检测,miRNA-21sponge联合顺铂共同干预A549/DDP细胞凋亡相关蛋白cleave caspase-3和Bax表达显着增加,而Bcl-2表达降低;细胞内自噬相关蛋白LC3B和ATG7表达也显着增加。论文三1.A549/DDP细胞糖酵解相关酶表达升高基于高通量测序结果,已经证实A549/DDP细胞相比其亲本A549细胞,糖酵解途径中的相关酶PKM2和LDHA表达升高。为了更进一步阐明糖酵解水平升高的原因,我们对参与糖酵解所有的相关酶表达水平进行了检测,通过Real Time PCR和Western blot实验结果显示,与其亲本A549细胞相比,A549/DDP细胞中HK2、PKM1/2、PKM2、GLUT1和LDHA的mRNA和蛋白表达水平均显着升高。2.参麦注射液抑制A549/DDP细胞增殖参麦注射液对A549/DDP细胞具有毒性作用,且呈现浓度正相关性。通过CCK-8方法检测得出参麦注射液对A549/DDP细胞的IC50为40.0 mg/m L,IC5、IC10和IC20分别为10.0、15.0和20.0 mg/m L。3.参麦注射液增强顺铂对A549/DDP细胞毒性作用参麦注射液对顺铂具有增强毒性作用,当顺铂联合参麦注射液浓度分别为10.0、15.0和20.0 mg/m L时,顺铂对A549/DDP细胞的IC50值从63.6μM分别下降到21.0μM、20.3μM和13.7μM,逆转指数分别从3.1上升到3.5和4.6。当顺铂联合参麦注射液浓度为20.0 mg/m L时,与顺铂单独干预相比可显着降低A549/DDP细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成。此外,通过Western blot方法检测参麦注射液联合顺铂可抑制A549/DDP细胞中HK2、PKM1/2、GLUT1及PDH蛋白的表达。4.参麦注射液通过干预PI3K/Akt/m TOR/c-Myc信号通路增强顺铂毒性作用与顺铂单独干预相比,参麦注射液联合顺铂共同干预可显着降低A549/DDP细胞p-Akt（Ser 473）、p-Akt（Thr 308）、p-m TOR（Ser 2448）和c-Myc的蛋白表达。为了证实参麦注射液增强顺铂毒性作用是通过PI3K/Akt/m TOR/c-Myc途径实现的,分别选取了PI3K/Akt/m TOR/c-Myc通路不同位点的抑制剂加以干预,结果显示蛋白表达变化趋势与LY294002、雷帕霉素及10058-F4干预预期结果相一致,证明参麦注射液增强顺铂毒性是通过PI3K/Akt/m TOR/c-Myc途径实现的。5.参麦注射液联合顺铂抑制A549/DDP细胞增殖,诱导细胞凋亡与顺铂单独干预相比,参麦注射液联合顺铂共同干预A549/DDP细胞,细胞的增殖率下降了约60%。此外,通过Western blot方法检测细胞内凋亡相关蛋白cleave caspase-3和Bax表达水平显着的降低,Bcl2表达水平显着的升高。结论:1.转录组学数据表明,顺铂耐药A549/DDP细胞糖代谢水平升高。2.miRNA-21通过PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制A549/DDP细胞糖酵解增加NSCLC顺铂敏感性。3.参麦注射液调节PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制A549/DDP细胞糖酵解增加NSCLC顺铂敏感性。
唐平[3]（2020）在《真核翻译延伸因子1A1调控HOXB9促进肝癌细胞侵袭迁移的机制研究》文中研究指明研究背景及目的:肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma HCC,HCC）是全球十大最常见的恶性肿瘤之一,是恶性肿瘤导致癌症死亡的第二大主要原因[1-2]。近年来,尽管肝癌的外科手术切除以及肝癌综合治疗取得了一定进展,但肝癌的总体五年生存率并未得到明显提高,其主要原因是肝癌的侵袭和远处转移[3-4]。因此,阐明肝癌侵袭转移的分子生物学机制是肝癌防治研究的重点。真核翻译延伸因子1A1（Eukaryotic Translation Elongation Factor 1 Alpha 1,eEF1A1）是触发蛋白质翻译延伸启动的重要蛋白质,研究证实eEF1A1可参与调控细胞生长,细胞周期调控和细胞凋亡等各种细胞生理过程[5]。另外文献报道eEF1A1在包括肝癌等多种肿瘤细胞中表达明显升高[6],且eEF1A1高表达与肿瘤细胞的增殖,侵袭和迁移密切相关[7-11]。然而,eEF1A1在调控肝癌侵袭和转移过程中的详细机制仍不完全清楚,需要进一步研究。HOXB9是同源盒基因（homeobox genes,HOX）家族成员之一。研究报道HOXB9在乳腺癌、肺癌、结肠癌和胃癌等多种肿瘤中呈高表达[12-15]。另外研究也发现HOXB9高表达与肿瘤血管生成,侵袭,转移以及不良预后有关[13,15]。HOXB9可以通过诱导上皮向间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition EMT）促进肿瘤侵袭,并通过加速DNA损伤反应来抵抗化学治疗药物和放射线治疗[12,15]。我们前期研究表明,HOXB9在HCC中明显高表达,并参与了HCC细胞侵袭和转移的过程[16]。然而,eEF1A1和HOXB9在肝癌中的表达关系及其两者间是否存在相互作用进而影响肝癌侵袭和转移仍未见报道。本研究首先检测eEF1A1和HOXB9在肝癌组织中的表达情况,并分析其表达与肝癌患者临床病理参数之间的相关性;其次明确eEF1A1和HOXB9在肝癌细胞中的表达情况,并且通过体内外实验探索eEF1A1和HOXB9对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响;最后探究eEF1A1和HOXB9影响肝癌细胞侵袭转移能力的具体机制。方法:1、采用qRT-PCR、免疫组化及Western blot等实验方法分析156例肝癌组织及对应癌旁组织中eEF1A1和HOXB9的m RNA和蛋白表达水平,并分析肝癌中eEF1A1和HOXB9表达与肝癌患者临床病理参数及其对预后的相关性。2、运用qRT-PCR及Western Blot实验方法检测正常肝脏细胞（HL-7702）与多种肝癌细胞株（MHCC97h,HCCLM3,SMMC7721,Huh7和Hep G2）中eEF1A1和HOXB9的表达情况;构建干扰eEF1A1和HOXB9的质粒,并筛选出最佳干扰效果的eEF1A1和HOXB9质粒;在上述肝癌细胞中转染sh-eEF1A1质粒后,采用Western Blot实验方法检测HOXB9表达情况,Transwell实验检测肝癌细胞转染后侵袭转移能力的变化;在稳定下调eEF1A1表达的肝癌细胞中同时转染HOXB9过表达质粒,通过Transwell及RTCA实验检测各实验组肝癌细胞的侵袭转移能力的变化;3、采用蛋白质免疫共沉淀实验检测eEF1A1蛋白和HOXB9蛋白是否结合,利用Western Blot实验方法检测在肝癌细胞中改变eEF1A1的表达后STAT1的总蛋白和核内蛋白的表达变化;在稳定下调eEF1A1表达的肝癌HCCLM3细胞中同时转染STAT1过表达质粒,利用Western Blot实验方法检测eEF1A1、HOXB9和STAT1的蛋白表达变化,并通过Transwell实验检测各实验组肝癌细胞的侵袭转移能力的变化;在稳定过表达eEF1A1的肝癌Hep G2细胞中同时转染sh-STAT1质粒,利用Western Blot实验方法检测eEF1A1、HOXB9和STAT1的蛋白表达变化,并通过Transwell实验检测各实验组肝癌细胞的侵袭转移能力的变化;4、在肝癌细胞中改变STAT1的表达或者活性后通过Western Blot实验方法检测HOXB9的蛋白表达变化;利用生物信息学方法预测STAT1在HOXB9的启动子结合区域,并通过荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀实验验证两者兼得相互作用。结果:（1）eEF1A1和HOXB9在肝癌组织中高表达,且这两个基因的高表达与临床预后不良密切相关。（2）eEF1A1和HOXB9在肝癌细胞系中高表达,且在肝癌细胞中下调eEF1A1的表达后HOXB9的蛋白表达也随之减少,同时降低肝癌细胞的侵袭迁移能力;在肝癌细胞中下调eEF1A1表达导致肝癌细胞侵袭迁移能力的下降可被过表达HOXB9所回复。（3）Co-IP实验证实eEF1A1和HOXB9不直接结合。另外,改变eEF1A1的表达可以调控STAT1总蛋白和核内蛋白。进一步研究发现,STAT1是eEF1A1调控HOXB9表达的关键蛋白。（4）改变肝癌细胞中STAT1的表达或者活性可以调控HOXB9的蛋白表达;生信分析预测STAT1和HOXB9启动子结合区域,荧光素酶报告基因和CHIP实验进一步证明STAT1结合HOXB9的启动子区域C区并上调HOXB9转录水平。结论:在本研究中,我们发现在肝癌组织中eEF1A1和HOXB9的表达上调,并且两者间的表达呈正相关。eEF1A1和HOXB9的过度表达与肝癌患者的不良预后显着相关。此外,体内体外实验证实降低eEF1A1表达可以通过下调HOXB9的表达进而减少HCC细胞的侵袭和迁移。最后,我们证实肝癌细胞中eEF1A1可以通过增强STAT1介导的HOXB9的转录活性进而增加HOXB9的表达。这些结果证明eEF1A1可以通过STAT1信号通路调控HOXB9表达进而促进肝癌细胞侵袭迁移,为预防和治疗肝癌提供了新的治疗靶点。
马雨水[4]（2020）在《肝癌中lncRNA OIP5-AS1和miR-302调控机制及洛那法尼联合Degrasyn疗效研究》文中研究表明作为目前最常见的致死性肿瘤疾病之一,肝癌的五年生存率仅7%。肝癌发生隐袭,其早期诊断十分困难,大约90%的肝癌患者被诊断时已是中晚期而丧失外科手术切除机会,导致肝癌的预后非常差。常规化疗药物治疗不仅毒副作用大,而且不能明显缓解疾病进展或延长患者生命。因此需要对于肝癌的发病机制和其中的关键调控因子进行深入的研究,提高肝癌的早期诊断、开发新型肝癌治疗药物,提高肝癌治疗疗效,延缓肿瘤复发与转移,改善患者预后。据报道,lnc RNA OIP5-AS1在几种癌症中表达增加。然而,lnc RNA OIP5-AS1在肝癌中的作用仍有待研究。在本文第一部分中,我们通过实时定量PCR实验,证实lnc RNA OIP5-AS1在肝癌组织标本中上调,其过表达与肝癌患者的低生存率有关。细胞和裸鼠的体内外功能实验也表明,lnc RNA OIP5-AS1可以促进肝癌细胞增殖,抑制细胞凋亡。此外,荧光素酶分析证实lnc RNA OIP5-AS1与hsa-mi R-26a-3p,EPHA2之间的结合位点。回复实验进一步证实lnc RNA OIP5-AS1对肝癌细胞生物学行为的影响。基于以上实验探讨,我们的研究结果提示lnc RNA OIP5-AS1可能通过调节hsa-mi R-26a-3p/EPHA2信号轴来促进肝癌细胞的增殖和侵袭。实验证据表明,肝细胞癌的发生和发展过程中,肝癌干细胞（LCSCs）可能起重要的作用。其中,微小RNA（mi RNA）在LCSCs诱发的肝癌中起着重要的作用,但mi RNA-302家族在LCSCs中的作用和相关分子机制却鲜为人知。本文第二部分中,我们应用Mi RNAs微阵列技术,检测参与LCSCs维持和分化的mi RNAs;进而我们探讨mi R-302a/d及其靶基因E2F7在肝癌中的生物学作用及其分子机制。同时,我们采用定量PCR和Kaplan-Meier生存分析法检测mi R-302a/d和E2F7在HCC患者中的表达及相关性。我们的结果显示:mi RNA-302家族成员在HCC细胞球形形成过程中下调,mi R-302a/d表达低的肝癌患者的生存期（OS）和无进展生存期（PFS）相对较短。此外,荧光素酶分析证实mi R-302a/d直接靶向抑制E2F7。过表达mi R-302a/d抑制E2F7 m RNA和蛋白表达。而且mi R-302a/d的低表达和E2F7的高表达与肝癌患者OS和PFS较短显着相关。进一步的细胞功能分析也表明mi R-302a/d可能通过直接抑制靶基因E2F7及其下游AKT/β-catenin/CCND1信号通路,负调控肝癌干细胞的自我更新能力和细胞周期转换。因此,我们的结果提示:E2F7是mi R-302a/d的直接靶点,mi R-302a/d通过靶向E2F7/AKT/β-catenin/CCND1信号通路抑制LCSCs的干细胞和肝癌细胞的增殖。在论文第三部分中,我们通过条件性c Myc转基因小鼠与Alb-Cre工具小鼠杂交,在肝脏内形成自发肝癌,用于肝癌模型的建立与后续的机制研究,以及洛那法尼联合Degrasyn对Alb-c Myc自发成瘤肝癌小鼠治疗作用及其机制的初步探讨。我们的结果发现洛那法尼联合Degrasyn治疗组的小鼠肝表面癌结节明显减少、体重恢复,中位生存期延长,提示洛那法尼联合Degrasyn没有明显的毒副作用,并且对Alb-c Myc自发成瘤小鼠有一定的治疗效果。机制上,我们通过全转录组测序发现,与对照组相比,Alb-c Myc组样本中发现2655个dif-m RNAs、96个dif-mi RNAs以及158个dif-lnc RNAs。对与m RNA相关的差异表达基因的富集分析证实参与染色体稳定性和蛋白质降解过程的基因可能在肝癌的发病机制中起重要作用。进一步的实验验证,与对照组相比,lnc RNA OIP5-AS1和E2F7在Alb-c Myc自发成瘤小鼠的肝癌组织中显着上调,而洛那法尼联合Degrasyn治疗后显着降低;相关mi R-26a-3p,mi R-302a/d和EPHA2在Alb-c Myc自发成瘤小鼠的肝癌组织中显着下调,而洛那法尼联合Degrasyn治疗后显着升高。这些结果暗示:洛那法尼联合Degrasyn具有Alb-c Myc自发性肝癌小鼠模型治疗作用,其机制涉及对lnc RNA OIP5-AS1,mi R-26a-3p,EPHA2,mi R-302a/d和E2F7表达的调控效应。总之,本论文揭示肝癌中lnc RNA OIP5-AS1通过hsa-mi R-26a-3p/EPHA2轴和mi R-302a/d通过靶向E2F7/AKT/β-catenin/CCND1信号通路调控肝癌细胞恶性生物学行为的分子机制;洛那法尼联合Degrasyn具有Alb-c Myc自发性肝癌小鼠模型治疗作用。以上两部分机制研究加深我们对第三部分洛那法尼联合Degrasyn对肝癌治疗效果作用的理解,为肝癌的诊断和治疗提供理论和实践基础。
王素梅[5]（2008）在《组织蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究》文中认为卵巢恶性肿瘤是最常见的女性恶性肿瘤之一,5年存活率低,侵袭和转移是卵巢恶性肿瘤重要的生物学特征,是引起卵巢恶性肿瘤患者死亡的主要原因。组织蛋白酶通过降解细胞外基质（ECM）,从而在肿瘤的侵袭和转移中起关键性的作用。组织蛋白酶抑制剂可抑制组织蛋白酶的活性,组织蛋白酶及其抑制剂的平衡失调可促进肿瘤的侵袭和转移。本研究的目的是探讨组织蛋白酶及其抑制剂在卵巢恶性肿瘤中的表达及与卵巢恶性肿瘤侵袭转移的关系,探讨血清中组织蛋白酶L（CTSL）及其组织抑制剂（CC）对卵巢恶性肿瘤的诊断意义,并通过体外实验进一步探讨CTSL与卵巢恶性肿瘤侵袭转移的关系,从而寻找卵巢恶性肿瘤基因治疗的方法。组织蛋白酶及其组织抑制剂在卵巢组织中的表达及临床价值目的:探讨组织蛋白酶及其组织抑制剂在卵巢组织中的表达及临床价值。方法:应用RT-PCR方法检测47例卵巢恶性肿瘤患者,20例卵巢良性肿瘤患者,21例正常卵巢组织中CTSB、CTSL、CTSD、CC的mRNA表达,进行阳性率和半定量的比较,并分析其与卵巢恶性肿瘤临床病理的关系。结果:CTSB、CTSL、CC在卵巢恶性肿瘤组织中的半定量明显高于卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织（p＜0.05）;CTSD在三组之间的表达无统计学意义（p＞0.05）;CTSB的表达与腹水量和组织学类型有关（p＜0.05）;CTSL的表达与临床分期、病理分级、淋巴结转移有关（p＜0.05）;CC的表达与病理分级、肝转移和大网膜转移有关（p＜0.05）;CTSD的表达与肝转移和腹水量的多少有关（p＜0.05）;单因素生存分析CTSL阳性率与患者的预后相关（p＜0.05）,Cox比例风险回归模型分析CTSL阳性率是卵巢恶性肿瘤的独立预后因素。结论:卵巢恶性肿瘤中CTSB、CTSL、CC表达增高,并与卵巢恶性肿瘤转移有关,有可能成为卵巢恶性肿瘤预测转移和预后的指标。血清CTSL及CC含量测定在卵巢恶性肿瘤中的临床价值目的:探讨CTSL及CC在卵巢恶性肿瘤患者血清中的含量及其临床意义。方法:采用ELISA方法检测64例卵巢恶性肿瘤、23例卵巢良性肿瘤及20例正常对照血清中CTSL及CC的含量,并对其中17例初诊卵巢恶性肿瘤手术患者进行术前、术后血清CTSL和CC含量的动态观察,将结果与临床资料进行统计学分析,并进行单因素生存分析及Cox比例风险回归模型分析。结果:卵巢恶性肿瘤患者血清中CTSL及CC的含量显着高于良性组及正常对照组,差异有统计学意义（p＜0.05）;同一患者术前、术后血清CTSL的含量差异有统计学意义（p＜0.05）;复发患者的血清中CTSL及CC含量高于未复发患者（p＜0.05）;在卵巢恶性肿瘤患者术前血清中,CTSL的含量与肿瘤的临床分期、病理分级、淋巴结转移及残余灶的大小有关（p＜0.05）;CC的含量与淋巴结转移有关（p＜0.05）;血清CTSL、CC与卵巢恶性肿瘤的侵袭转移有关。血清CTSL对卵巢恶性肿瘤诊断的敏感性为72.7%,特异性为76.7%,阳性预测值为70.58%和阴性预测值为76.7%,准确率75.0%。单因素生存分析CTSL的含量与患者的预后相关（p＜0.05）,Cox比例风险回归模型分析显示残余灶大小是卵巢恶性肿瘤的独立预后因素。结论:血清CTSL含量在卵巢恶性肿瘤中异常升高,血清CTSL水平有可能作为诊断卵巢恶性肿瘤,判断有无复发及转移的生物学指标。CTSL基因真核表达质粒的构建与鉴定目的:构建CTSL基因的真核表达质粒并进行表达鉴定。方法:采用RT-PCR技术从人卵巢恶性肿瘤组织总RNA中逆转录CTSL基因的ORF全长,克隆到PMD18-T载体上;亚克隆至pcDNA3.1质粒,重组阳性克隆进行酶切及测序鉴定,重组质粒瞬时转染HO8910细胞,RT-PCR和Western-blot检测CTSL基因mRNA和蛋白表达。结果:RT-PCR扩增CTSL ORF全长,成功克隆入PMD18-T载体,亚克隆至pcDNA3.1质粒,重组阳性克隆经双酶切及测序鉴定证实CTSL基因已正向插入pcDNA3.1质粒。RT-PCR和Western-blot结果证实CTSL基因能够在HO8910细胞中正确表达。结论:成功构建了CTSL基因的真核表达质粒,为下一步探讨CTSL基因在卵巢癌细胞中的作用提供了实验基础。CTSL基因介导的卵巢上皮癌细胞系侵袭转移的体外实验研究目的:通过体外实验研究CTSL基因与卵巢恶性肿瘤侵袭转移的关系。方法:CTSL基因的真核表达质粒转染卵巢癌细胞HO8910,G418筛选,获得稳定转染细胞克隆,采用RT-PCR和Western-blot技术证实CTSL基因转染成功。通过测定细胞生长曲线、克隆形成实验、细胞生长周期、细胞侵袭实验、细胞迁移实验和细胞黏附实验等了解CTSL基因转染后对卵巢癌细胞生物学行为的影响。结果:通过筛选建立了稳定转染细胞系HO8910-CTSL和HO8910-pcDNA3.1。细胞生物学实验显示:CTSL基因可促进卵巢癌细胞的侵袭转移,但是对卵巢癌细胞的增殖、细胞周期和黏附性影响不大。结论:体外实验进一步证明CTSL基因与卵巢恶性肿瘤的侵袭转移有关。CTSL基因siRNA真核表达载体的构建与鉴定目的:构建CTSL基因的siRNA真核表达载体并鉴定。方法:根据GenBank数据库提供的CTSL基因核苷酸序列,设计并化学合成4对双链小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,瞬时转染卵巢癌细胞系A2780细胞,通过RT-PCR检测其对CTSL基因的沉默效果,从中筛选一对沉默效果最好的siRNA序列。并根据psilencer4.1载体插入片段设计要求,设计带有BamH1、HindⅢ粘性末端且能表达shRNA的寡核苷酸碱基对序列,退火后与psilencer4.1-CMV neo载体定向连接,测序进行鉴定,并通过RT-PCR验证其干扰效果。结果:成功构建CTSL的siRNA表达载体psilencer4.1-CMV neo-CTSL,经DNA测序证实与设计完全一致,并通过RT-PCR证明psilencer4.1-CMV neo-CTSL载体可沉默该基因。结论:成功构建了CTSL基因的siRNA真核表达载体,为下一步探讨CTSL基因对肿瘤细胞的作用奠定了基础。RNAi抑制CTSL介导的卵巢上皮癌细胞系侵袭转移的体外实验研究目的:研究RNA干扰CTSL基因对卵巢癌细胞侵袭转移的影响。方法:CTSL基因的siRNA表达载体转染卵巢癌细胞A2780,G418筛选,获得稳定转染细胞克隆,采用RT-PCR和Western-blot技术证实CTSL基因干扰成功。通过测定转染细胞的生长曲线、克隆形成实验、细胞生长周期、细胞侵袭实验、细胞迁移实验和细胞黏附实验等了解CTSL基因干扰对卵巢癌细胞生物学行为的影响。结果:通过筛选建立了稳定转染细胞系A2780-CTSL、A2780-Control、A2780-psilencer,RT-PCR和Western-blot技术证实其能够沉默CTSL基因表达。细胞生物学实验显示:沉默CTSL基因后可以抑制卵巢癌细胞的侵袭转移,但对卵巢癌细胞的增殖、细胞周期和黏附性影响不大。结论:RNA干扰CTSL基因可以抑制卵巢癌细胞的侵袭转移,有可能成为卵巢恶性肿瘤基因治疗的新方法。
冷怀明[6]（2002）在《《第三军医大学学报》2002年第24卷主题词索引》文中研究指明
尹格平,陈涌芬,黄倩,李秀云,李福民[7]（1995）在《卵巢肿瘤细胞DNA及RNA含量的定量分析及其临床意义》文中指出对９３例不同性质的卵巢肿瘤细胞ＤＮＡ及ＲＮＡ含量进行定量研究。其中５０例良性、４３例恶性。并对患者进行１～５年的随访。结果表明：卵巢良性肿瘤的异倍率（假阳性）为４４％，恶性肿瘤异倍率为８３．７％。以＂标准ＤＩ＂及＂标准ＲＩ＂为指标判断卵巢肿瘤性质的准确率较以＂异倍性＂为高，且双指标同时应用高于任一单指标。对卵巢良恶性肿瘤的诊断准确率分别为９０％和９５．３％。提出：＂标准ＤＩ＂和＂标准ＲＩ＂是判断卵巢肿瘤性质的理想指标。且ＤＮＡ及ＲＮＡ含量与卵巢癌预后有密切关系。
尹格平,李秀云,谢智农,梁诵芬,李福民[8]（1994）在《卵巢肿瘤细胞DNA及RNA含量的定量分析及其临床意义》文中研究说明对９３例卵巢肿瘤细胞ＤＮＡ及ＲＮＡ含量进行了定量研究，其中良性肿瘤５０例、恶性肿瘤４３例，并对患者进行了１～５年的随访。结果是卵巢良性肿瘤的异倍率（假阳性）为４４％，恶性肿瘤的异倍率为８６．０％。用＂标准ＤＩ＂及＂标准ＲＩ＂为指数判断卵巢肿瘤性质的准确率较以＂异倍性＂为高，且双指标同时应用高于任一单指标，对卵巢良性和恶性肿瘤的诊断准确率分别为９０％和９５．３％。认为＂标准ＤＩ＂和＂标准ＲＩ＂是判断卵巢肿瘤性质的理想指标，且ＤＮＡ及ＲＮＡ含量与卵巢癌预后有密切关系。
尹格平,李福民,谢智农,陈涌芬,李秀云[9]（1994）在《卵巢肿瘤细胞DNA及RNA含量的定量分析及其临床意义》文中研究说明本资料对９３例不同性质的卵巢肿瘤细胞ＤＮＡ及ＲＮＡ含量进行了定量研究，其中５０例良性、４３例恶性。并对患者进行１～５年的随访。结果是卵巢良性肿瘤的异倍率（假阳性）为４４％，恶性肿瘤异倍率为８６．０％。以“标准ＤＩ”及“标准ＲＩ”为指标判断卵巢肿瘤性质的准确率较以“异倍性”为高，且双指标同时应用高于任一单指标：对卵巢良恶性肿瘤的诊断准确率分别为９０％和９５．３％。提出“标准ＤＩ”和“标准ＲＩ”是判断卵巢肿瘤性质的理想指标。且ＤＮＡ及ＲＮＡ含量与卵巢癌预后有密切关系。
杨宏毅[10]（2020）在《TNKS1通过Wnt/β-catenin信号通路调控卵巢癌发生发展的作用与机制》文中认为研究背景卵巢癌作为妇科生殖系统三大恶性肿瘤之一,临床起病隐匿,缺乏有效早期诊断指标,容易复发和转移,化疗极易产生耐药性,而放疗大多不敏感,预后差。因此,深入研究卵巢癌发生发展的分子机理,对于寻找有效早期诊断指标、预后判断指标和基因靶向治疗具有重大指导意义。端锚聚合酶（tankyrase,TNKS）属于聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP）蛋白家族,可与端粒酶重复绑定序列结合。人类TNKS1基因在第8号染色体p23.1上,作为调控端粒长度的关键因子在多种疾病中发挥重要作用,与多种恶性肿瘤的发生发展关系密切,与卵巢癌的关系尚不清楚。Wnt/β-catenin信号传导通路在恶性肿瘤的发生和发展中起重要作用,同时研究证实TNKS对Wnt信号通路进行正调控。本文率先系统地研究了 TNKS1通过调控Wnt/β-catenin信号传导通路来影响卵巢癌发生发展的相关机制。研究目的本研究从临床样本、细胞水平、动物模型以及分子机制层面,系统立体研究TNKS1在卵巢癌发生发展中的作用及机制,为卵巢癌诊疗提供理论依据。研究材料和方法1.采用q-PCR、免疫组化和Western blot技术研究TNKS1在卵巢癌组织中的表达。2.采用MTS法、细胞集落形成、裸鼠皮下移植瘤实验研究TNKS1对卵巢癌细胞增殖与成瘤的影响。3.采用MTS法和凋亡实验研究TNKS1表达改变对卵巢癌细胞药物敏感性的影响。4.采用细胞划痕实验和Transwell转移小室实验研究TNKS1在卵巢癌迁移与侵袭中的作用。5.采用葡萄糖摄取、乳酸分泌、ATP生成以及线粒体氧耗率研究TNKS1在卵巢癌细胞有氧糖酵解中的作用。6.采用Western blot技术及细胞转染法研究TNKS1参与卵巢癌发生发展的分子调控机制。7.应用SPSS 21.0进行统计分析,实验结果以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.TNKS1在卵巢癌组织中的表达高于癌旁组织及正常卵巢组织,且与卵巢癌患者的病理分级和肿瘤大小密切相关。2.敲低或抑制TNKS1显着抑制卵巢癌细胞增殖、细胞集落形成、体内成瘤及细胞周期进展,并有效提高卵巢癌细胞对常用化疗药物敏感性,显着抑制其迁移和侵袭能力;同时通过降低丙酮酸羧化酶表达降低卵巢癌细胞的糖代谢,提高线粒体耗氧率。3.敲低或抑制TNKS1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,进而下调Snail、PC、CyclinD、MDR、MMP-9 等 Wnt/β-catenin 信号通路靶蛋白的表达。TNKS1、Snail和PC在临床卵巢癌组织中表达两两之间呈正相关。结论TNKS1在卵巢癌组织中高表达,具有一定的临床意义。TNKS1可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路活性进而促进卵巢癌生长与成瘤、迁移与侵袭和降低药物敏感性;并通过β-catenin/Snail/PC信号轴促进卵巢癌细胞的有氧糖酵解。TNKS1在卵巢癌发生发展中发挥重要作用,可作为卵巢癌潜在的早期诊断指标、判断预后指标或靶向基因治疗靶点。
二、卵巢肿瘤细胞DNA含量的定量分析及其临床意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、卵巢肿瘤细胞DNA含量的定量分析及其临床意义（论文提纲范文）
（1）雄激素/雄激素受体影响上皮性卵巢癌发生发展的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 雄激素受体在上皮性卵巢癌组织及癌旁组织中的表达及其临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 雄激素/雄激素受体对上皮性卵巢癌细胞增殖的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 雄激素/雄激素受体影响上皮性卵巢癌发生发展的相关机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 雄激素/雄激素受体对上皮性卵巢癌影响的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）miRNA-21调控PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制肿瘤细胞糖酵解改善NSCLC顺铂耐药及参麦注射液干预机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 论文一 RNA-Seq技术筛选A549细胞与顺铂耐药A549/DDP细胞差异表达基因谱 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 miRNA-21通过PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制A549/DDP细胞糖酵解增加NSCLC顺铂敏感性的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 参麦注射液调节PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制A549/DDP细胞糖酵解增加NSCLC顺铂敏感性的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 基于糖代谢重编程探讨中医药抗肿瘤的研究概况 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（3）真核翻译延伸因子1A1调控HOXB9促进肝癌细胞侵袭迁移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 eEF1A1和HOXB9在肝癌组织中的表达及其临床意义 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 标本的收集 |
| 2.2 试剂 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 自配试剂 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 肝癌组织及癌旁组织总RNA的提取 |
| 3.2 总RNA逆转录成cDNA |
| 3.3 荧光定量PCR实验 |
| 3.3.1 免疫组化实验 |
| 3.3.2 免疫组化结果分析 |
| 3.4 Western blot实验 |
| 3.4.1 提取肝癌组织蛋白 |
| 3.4.2 利用BCA法测定蛋白溶液浓度 |
| 3.4.3 WB凝胶配制 |
| 3.4.4 WB凝胶电泳 |
| 3.4.5 WB凝胶转膜 |
| 3.4.6 WB凝胶孵育一抗 |
| 3.4.7 ECL化学成像 |
| 3.5 统计分析 |
| 4.结果 |
| 4.1 检测肝癌组织及其癌旁组织中eEF1A1和HOXB9 的表达 |
| 4.2 肝癌组织中eEF1A1和HOXB9 表达与临床病理特征的相关性 |
| 5.讨论 |
| 第2章 eEF1A1通过调控HOXB9表达并促进肝癌细胞侵袭和转移 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 自配试剂 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.1.1 细胞复苏 |
| 3.1.2 细胞传代 |
| 3.1.3 细胞转染 |
| 3.1.4 细胞冻存 |
| 3.2 构建目的基因质粒 |
| 3.2.1 构建eEF1A1、HOXB9、STAT1 的质粒 |
| 3.2.2 扩增质粒 |
| 3.3 功能实验 |
| 3.3.1 RTCA检测细胞迁移实验 |
| 3.3.2 transwell检测细胞侵袭实验 |
| 3.3.3 裸鼠成瘤实验 |
| 3.4 HE染色 |
| 3.5 蛋白免疫印迹反应(WB)实验 |
| 3.5.1 细胞总蛋白提取 |
| 3.5.2 利用BCA法测定蛋白溶液浓度 |
| 3.5.3 WB凝胶配制 |
| 3.5.4 WB凝胶电泳 |
| 3.5.5 WB凝胶转膜 |
| 3.5.6 WB凝胶孵育一抗 |
| 3.5.7 ECL化学成像 |
| 3.6 统计分析 |
| 4.结果 |
| 4.1 观察肝癌细胞株中eEF1A1和HOXB9 的表达情况 |
| 4.2 观察肝癌细胞中下调eEF1A1 表达后HOXB9 的蛋白表达变化 |
| 4.3 HOXB9是eEF1A1 介导的肝癌细胞侵袭转移的关键蛋白 |
| 4.4 降低eEF1A1 可以抑制肝癌肺转移 |
| 5.讨论 |
| 第3章 eEF1A1 通过STAT1 调节肝癌细胞中HOXB9 表达 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 蛋白质免疫共沉淀 |
| 3.2 蛋白质免疫印记实验 |
| 3.2.1 核浆蛋白分离 |
| 3.2.2 BCA法测定蛋白溶液浓度 |
| 3.2.3 WB凝胶配制 |
| 3.2.4 WB凝胶电泳 |
| 3.2.5 WB凝胶转膜 |
| 3.2.6 WB凝胶孵育一抗、二抗 |
| 3.2.7 ECL化学成像 |
| 3.3 功能实验 |
| 4.结果 |
| 4.1 观察肝癌细胞中eEF1A1和HOXB9 结合关系 |
| 4.2 STAT1是eEF1A1 调控HOXB9 影响肝癌侵袭转移的关键蛋白 |
| 5.讨论 |
| 第4章 STAT1结合HOXB9的启动子区域并上调其转录水平 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2 荧光素酶报告基因实验 |
| 3.3 染色质免疫共沉淀(CHIP) |
| 4.结果 |
| 4.1 肝癌细胞中STAT1 调控HOXB9 的表达 |
| 4.2 肝癌细胞中STAT1影响HOXB9的转录活性 |
| 4.3 肝癌细胞中STAT1 结合HOXB9 启动子区域 |
| 5.讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 STAT1 在癌症中的研究进展 |
| 参考文献 |
（4）肝癌中lncRNA OIP5-AS1和miR-302调控机制及洛那法尼联合Degrasyn疗效研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝癌的现状 |
| 1.2 非编码RNA概述 |
| 1.2.1 lncRNA及其在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.2.2 MicroRNA及其在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.3 小分子靶向药物在肝癌中的研究进展 |
| 1.4 洛那法尼与Degrasyn在肿瘤研究中的应用 |
| 第二章 lncRNA OIP5-AS1 在肝癌中的作用与机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 lncRNA OIP5-AS1与肝癌 |
| 2.1.2 研究目标 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 肝癌中明显表达失调的lncRNAs鉴定 |
| 2.2.2 lncRNA OIP5-AS1敲低细胞系 |
| 2.2.3 lncRNA OIP5-AS1作用体外实验检测 |
| 2.2.4 探讨lncRNA OIP5-AS1对hsa-miR-26a-3p的调控 |
| 2.2.5 lncRNA OIP5-AS1参与hsa-miR-26a-3p对EPHA2调控机制 |
| 2.2.6 明确lncRNA OIP5-AS1、hsa-miR-26a-3p和EPHA2相互关系 |
| 2.2.7 lncRNA OIP5-AS1和hsa-miR-26a-3p体内成瘤实验 |
| 2.2.8 验证肝癌中三者的表达相关性及其临床意义 |
| 2.3 材料与方法 |
| 2.3.1 试剂与耗材 |
| 2.3.2 主要实验设备 |
| 2.3.3 组织样本和细胞系与动物 |
| 2.3.4 实验方法 |
| 2.3.5 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 肝癌中失调lncRNA的鉴定 |
| 2.4.2 肝癌中lncRNA明显失调的验证 |
| 2.4.3 肝癌组织和细胞系lncRNA OIP5-AS1 的表达 |
| 2.4.4 干扰lncRNA OIP5-AS1抑制细胞增殖和体外侵袭能力 |
| 2.4.5 lncRNA OIP5-AS1 是调节hsa-miR-26a-3p的分子海绵 |
| 2.4.6 hsa-miR-26a-3p在肝癌患者中的表达及其预后价值评估 |
| 2.4.7 lncRNA OIP5-AS1 负调控hsa-miR-26a-3p促进细胞增殖和侵袭 |
| 2.4.8 lncRNA OIP5-AS1 充当hsa-miR-26a-3p ce RNA调控EPHA2 |
| 2.4.9 敲低lncRNA OIP5-AS1 抑制体内肿瘤发生 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 miR-302a/d在肝癌干细胞中的作用机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 miR-302家族与肝癌 |
| 3.1.2 研究目标 |
| 3.2 研究内容 |
| 3.2.1 HCC细胞系的肿瘤球体外形成和鉴定 |
| 3.2.2 miR-302a/d,RNAi和E2F7过表达细胞系构建与鉴定 |
| 3.2.3 miR-302a/d作用体外实验检测作用体外实验检测 |
| 3.2.4 miR-302a/d和E2F7相互关系裸鼠体内成瘤实验 |
| 3.2.5 验证肝癌中miR-302a/d和E2F7表达相关性及其临床意义 |
| 3.3 材料与方法 |
| 3.3.1 试剂与耗材 |
| 3.3.2 主要实验设备 |
| 3.3.3 组织样本和细胞系与动物 |
| 3.3.4 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 HCC细胞系的肿瘤球的体外形成和鉴定 |
| 3.4.2 miRNA芯片分析表明,miR-302 家族参与LCSC干性维持 |
| 3.4.3 LCSC的分化和CSC标志物表达 |
| 3.4.4 miR-302a/d抑制HCC细胞的增殖和球体形成并促进细胞凋亡 |
| 3.4.5 miR-302a/d直接靶向HCC细胞E2F7 |
| 3.4.6 E2F7在LCSC形成和分化中的表达 |
| 3.4.7 miR-302a/d通过抑制细胞周期进入来抑制LCSC干性 |
| 3.4.8 E2F7激活AKT1细胞周期蛋白D1信号和下游细胞周期 |
| 3.4.9 miR-302a/d协同E2F7 调控β-catenin/CCND1 信号转导 |
| 3.4.10 miR-302a/d和E2F7 在肝癌中的表达及相关性 |
| 3.4.11 miR-302a/d和E2F7在LCSC中的表达及相关性 |
| 3.4.12 miR-302a/d和E2F7在肝癌中的临床意义 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 洛那法尼联合Degrasyn治疗作用初探 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 肝癌治疗 |
| 4.1.2 研究目标 |
| 4.2 研究内容 |
| 4.2.1 繁殖和鉴定自发成瘤肝癌小鼠 |
| 4.2.2 洛那法尼联合Degrasyn对HCC自发成瘤小鼠疗效的观察 |
| 4.2.3 洛那法尼联合Degrasyn作用于HCC自发成瘤小鼠机制探 |
| 4.3 材料与方法 |
| 4.3.1 试剂与耗材 |
| 4.3.2 主要实验设备 |
| 4.3.3 实验动物 |
| 4.3.4 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 Alb-c Myc小鼠基因型鉴定 |
| 4.4.2 Alb-c Myc小鼠表型及洛那法尼联合Degrasyn治疗效果探讨 |
| 4.4.3 洛那法尼联合Degrasyn对小鼠器官组织的影响 |
| 4.4.4 Alb-c Myc自发成瘤肝癌小鼠分子检测 |
| 4.4.5 洛那法尼联合Degrasyn治疗对相关分子的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肝癌非编码 RNA 调控机制及相关药物研发进展 |
| 主要参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简历及在读期间取得的科研成果 |
| 附件 |
（5）组织蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 卵巢癌浸润转移与临床研究现况(文献综述) |
| 1. 卵巢癌浸润转移的临床特点 |
| 1.1 局部蔓延 |
| 1.2 腹腔种植 |
| 1.3 淋巴转移 |
| 1.4 血行转移 |
| 2. 卵巢癌浸润转移的主要途径与预后 |
| 2.1 腹腔种植转移 |
| 2.2 腹膜后淋巴结转移 |
| 2.3 血行转移 |
| 2.4 卵巢癌转移的预后 |
| 3. 卵巢癌浸润转移的主要步骤及分子机理 |
| 3.1 卵巢癌浸润转移的主要步骤 |
| 3.2 卵巢癌浸润转移的分子机理 |
| 4. 卵巢癌浸润转移与临床病理的关系 |
| 4.1 与临床分期的关系 |
| 4.2 与组织学类型的关系 |
| 4.3 与病理分级的关系 |
| 5. 卵巢癌浸润转移的诊断现况 |
| 5.1 影像学诊断 |
| 5.2 分子生物学诊断 |
| 6. 卵巢癌浸润转移的治疗现况 |
| 6.1 卵巢癌浸润转移的手术治疗 |
| 6.2 卵巢癌浸润转移的化学治疗 |
| 6.3 卵巢癌浸润转移的生物治疗 |
| 7 组织蛋白酶及抑制物与卵巢癌浸润转移关系研究现况 |
| 7.1 组织蛋白酶及抑制物的结构 |
| 7.2 组织蛋白酶及其抑制剂的生物学特性 |
| 7.3 组织蛋白酶及其抑制剂与肿瘤浸润转移的关系 |
| 7.4 卵巢肿瘤组织中组织蛋白酶及抑制物的表达及其临床意义 |
| 7.5 卵巢肿瘤患者外周组织蛋白酶及抑制物的含量测定及其临床意义 |
| 7.6 蛋白酶及抑制物在卵巢癌浸润转移中的作用机理 |
| 7.7 针对蛋白酶及抑制物的靶向治疗研究 |
| 8. 组织蛋白酶及其抑制剂与卵巢癌研究中存在的问题及本研究的目的 |
| 第二章 组织蛋白酶及其组织抑制剂在卵巢组织中的mRNA表达及其临床意义 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 血清CTSL及CC含量测定在卵巢恶性肿瘤中的临床价值 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第四章 CTSL基因真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 前言 |
| 1. CTSL基因的克隆及原核表达质粒的构建与鉴定 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 2. CTSL基因的真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第五章 CTSL基因介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移的体外实验研究 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第六章 CTSL基因RNA干扰真核表达载体的构建 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第七章 RNAi抑制CTSL介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移的体外实验研究 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 学习期间发表论文 |
（10）TNKS1通过Wnt/β-catenin信号通路调控卵巢癌发生发展的作用与机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1. 卵巢癌临床研究概况 |
| 1.1 卵巢癌发病流行病学研究进展 |
| 1.2 卵巢癌诊断研究进展 |
| 1.3 卵巢癌治疗研究进展 |
| 2. TNKS研究背景 |
| 2.1 TNKS生物学特性 |
| 2.2 TNKS生物学功能 |
| 2.3 TNKS1介导Wnt通路与恶性肿瘤关系的研究进展 |
| 3. 研究内容和科学意义 |
| 3.1 研究内容 |
| 3.2 科学意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 临床标本 |
| 1.2 细胞系 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 试剂与配置 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 TNKS1敲低细胞模型建立 |
| 2.3 免疫组织化学染色 |
| 2.4 实时荧光定量 |
| 2.5 免疫印迹(Western blot)检测 |
| 2.6 细胞生长实验(MTS) |
| 2.7 细胞集落形成实验 |
| 2.8 细胞迁移与侵袭实验 |
| 2.9 流式细胞学 |
| 2.10 葡萄糖摄取实验 |
| 2.11 乳酸分泌实验 |
| 2.12 细胞ATP检测 |
| 2.13 双荧光素酶报告基因分析 |
| 2.14 裸鼠皮下移植瘤实验 |
| 2.15 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 1. TNKS1在卵巢癌组织的表达及其临床意义 |
| 1.1 网络数据库TNKS在卵巢癌中的表达 |
| 1.2 临床资料 |
| 1.3 TNKS1在卵巢癌组织中的表达 |
| 1.4 TNKS1在卵巢癌组织中高表达的临床意义 |
| 2. TNKS1促进卵巢癌细胞的体内外增殖 |
| 2.1 TNKS1敲低细胞模型建立 |
| 2.2 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞体外生长的影响 |
| 2.3 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞周期的影响 |
| 2.4 敲低TNKS1对卵巢癌细胞体内成瘤的影响 |
| 3. TNKS1与卵巢癌耐药性的关系 |
| 3.1 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞药物敏感性的影响 |
| 3.2 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞凋亡的影响 |
| 4. TNKS1促进卵巢癌细胞的迁移与侵袭 |
| 4.1 细胞划痕修复法检测TNKS1对卵巢癌细胞迁移的影响 |
| 4.2 转移小室法检测TNKS1对卵巢癌细胞迁移与侵袭的影响 |
| 5. TNKS1促进卵巢癌细胞的有氧糖酵解 |
| 5.1 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞葡萄糖摄取的影响 |
| 5.2 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞乳酸分泌的影响 |
| 5.3 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞ATP生成的影响 |
| 5.4 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞耗氧率的影响 |
| 6. TNKS1通过调控PC表达介导卵巢癌细胞有氧糖酵解 |
| 6.1 抑制或敲低TNKS1对卵巢癌细胞丙酮酸羧化酶表达的影响 |
| 6.2 TNKS1通过PC介导卵巢癌细胞有氧糖酵解 |
| 7. TNKS1通过激活Wnt/β-catenin/snail信号通路调控卵巢癌发生发展 |
| 7.1 敲低或抑制TNKS1显着抑制Wnt/β-catenin信号通路 |
| 7.2 TNKS1对Wnt/β-catenin信号通路多个靶基因的调控 |
| 7.3 TNKS1通过调控Snail表达而影响PC的表达 |
| 8. TNKS1与Snail、PC蛋白在临床组织表达的相关性分析 |
| 第四章 讨论 |
| 1. TNKSI在卵巢癌中高表达及其临床意义 |
| 2. TNKS1促进卵巢癌细胞快速增殖 |
| 3. TNKS1介导卵巢癌细胞耐药性产生 |
| 4. TNKS1促进卵巢癌细胞转移 |
| 5. TNKS1促进卵巢癌细胞有氧糖酵解 |
| 6. TNKS1调控卵巢癌发生发展的分子机制 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 主要缩略语表 |
| 博士期间科研成果 |
| 致谢 |
四、卵巢肿瘤细胞DNA含量的定量分析及其临床意义（论文参考文献）
- [1]雄激素/雄激素受体影响上皮性卵巢癌发生发展的实验研究[D]. 李艳芳. 河北医科大学, 2021(02)
- [2]miRNA-21调控PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制肿瘤细胞糖酵解改善NSCLC顺铂耐药及参麦注射液干预机制的研究[D]. 孙冶. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [3]真核翻译延伸因子1A1调控HOXB9促进肝癌细胞侵袭迁移的机制研究[D]. 唐平. 南昌大学, 2020(01)
- [4]肝癌中lncRNA OIP5-AS1和miR-302调控机制及洛那法尼联合Degrasyn疗效研究[D]. 马雨水. 华东师范大学, 2020(02)
- [5]组织蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究[D]. 王素梅. 广西医科大学, 2008(10)
- [6]《第三军医大学学报》2002年第24卷主题词索引[J]. 冷怀明. 第三军医大学学报, 2002(12)
- [7]卵巢肿瘤细胞DNA及RNA含量的定量分析及其临床意义[J]. 尹格平,陈涌芬,黄倩,李秀云,李福民. 中国肿瘤临床, 1995(07)
- [8]卵巢肿瘤细胞DNA及RNA含量的定量分析及其临床意义[J]. 尹格平,李秀云,谢智农,梁诵芬,李福民. 现代妇产科进展, 1994(04)
- [9]卵巢肿瘤细胞DNA及RNA含量的定量分析及其临床意义[J]. 尹格平,李福民,谢智农,陈涌芬,李秀云. 中国优生与遗传杂志, 1994(03)
- [10]TNKS1通过Wnt/β-catenin信号通路调控卵巢癌发生发展的作用与机制[D]. 杨宏毅. 南方医科大学, 2020(01)