一、犬冠状病毒部分纤突蛋白基因的分子克隆（论文文献综述）
吕海峰[1]（2021）在《犬冠状病毒M蛋白单克隆抗体的制备及其在胶体金检测试纸条上的应用》文中认为犬冠状病毒（Canine CoronavirusCCoV）是一种有囊膜的、单链正股RNA病毒。CCoV感染可导致幼犬胃肠炎的典型临床症状,如食欲不振、腹泻和呕吐等,发病率和死亡率较高。CCoV基因组全长约30 kb,3’端编码4种结构蛋白,分别为刺突蛋白（S）,包膜蛋白（E）,膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。M蛋白是一种膜结构糖蛋白,在包膜蛋白中含量最高,是病毒组装和形成的关键成分,含有B细胞识别表位。编码M蛋白的基因高度保守,与其他冠状病毒的M基因同源性较低,因此,M蛋白成为犬冠状病毒检测和诊断的主要靶标之一。犬胃肠炎可由多种病原体引起,包括病毒、细菌或寄生虫。最常见的病毒性肠炎病原体除了冠状病毒（CCoV）,还有犬细小病毒（CPV）,犬腺病毒2型（CAV-2）、犬瘟热病毒（CDV）等。因此,快速的病毒学检测对控制犬病毒性肠炎疾病至关重要。为了研制出适用于犬冠状病毒快速诊断的胶体金免疫层析试纸条,本研究制备筛选了 2株犬冠状病毒M蛋白特异单抗杂交瘤细胞,对不同单抗IgG亚类的纯化方法进行了比较,建立了犬冠状病毒胶体金免疫层析试纸条的制备工艺,该试纸条具有良好的特异性和较高的敏感性。本文内容包括以下三个部分:1、犬冠状病毒M蛋白单抗隆抗体的制备及其生物学特性鉴定为制备抗犬冠状病毒（CCoV）特异单克隆抗体,用纯化的CCoV为抗原4次免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞用聚乙二醇（PEG1500）进行细胞融合,通过间接免疫荧光试验（IFA）筛选抗体阳性杂交瘤细胞。经三次克隆化,获得2株能稳定分泌抗CCoV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2H11、2G3,其抗体效价在体外连续传代40代稳定。单抗Ig亚类鉴定结果表明,2H11单抗为IgG3,2G3单抗为IgG1亚类。IFA和Western blot分析均表明,2H11、2G3单抗特异识别CCoV M蛋白（28-32 kDa）。2H11、2G3杂交瘤培养上清的IFA效价均为1:1000,ELISA效价均≥1:105。单抗特异性试验结果表明,这些单克隆抗体与犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）、犬腺病毒（CAV）、犬副流感病毒（CPIV）等均无交叉反应。CCoV M蛋白特异单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立,为CCoV鉴定和相关诊断方法的建立奠定了坚实的基础。2、小鼠腹水单克隆抗体纯化方法的比较研究为了纯化小鼠腹水中的单抗隆抗体,分三个批次,制备了 2G3、2H11两株杂交瘤的小鼠腹水。分别采用饱和硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵法、亲和层析、超离透析法对两株单抗进行纯化处理,分析对比蛋白浓度、纯度、效价以及回收率。结果表明不同Ig亚类的单抗,适用的纯化方法不同。2G3单抗（IgG1亚类）最适纯化方法为亲和层析,虽然亲和层析法回收率较低,但纯度高。2H11单抗属于IgG3亚类,辛酸处理导致IgG3破坏,亲和层析时蛋白G亲和柱与IgG3结合不紧密,结果洗脱下来的单抗蛋白浓度和抗体效价低,因此,辛酸-硫酸铵法、亲和层析法不适合2H11单抗的纯化。2H11单抗最适纯化方法选择为超离透析法。3、犬冠状病毒胶体金免疫层析检测试纸条的制备为了制备胶体金免疫层析试纸条,采用柠檬酸三钠还原法制备出20 nm胶体金颗粒,选择单抗2G3作为金标抗体标记胶体金,经过优化,金标最佳pH为9.0,最佳蛋白浓度为100 μg/mL。单抗2H11作为检测抗体,以1mg/mL的浓度包被于NC膜上作为检测线（T线）,兔抗鼠IgG作为质控抗体,以1 mg/mL浓度包被于NC膜上作为质控线（C线）。特异性试验证明,试纸条与CDV、CAV、CPIV和CPV等无交叉反应;敏感性试验表明,试纸条可以检测到CCoV含量至少达到102.8TCID50/mL。对临床粪便样本的检测,实验室制备的试纸条与进口试纸条的检测符合率为1 00%。本研究成功制备了检测CCoV的胶体金免疫层析试纸条,对早期诊断、预防和控制CCoV具有重要的应用价值。
李少晗,张广智,崔尚金,秦彤[2]（2020）在《犬猫冠状病毒研究进展》文中指出犬冠状病毒（canine coronavirus,CCoV）与猫冠状病毒（feline coronavirus,FCoV）同属于冠状病毒科冠状病毒属α属,与其同属的病毒还有猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）等。遗传进化分析表明,该种属不同基因型病毒通过基因重组能产生新型变异毒株,为疾病的诊断与防控造成了很大的阻碍。β属冠状病毒包括牛冠状病毒（bovine coronavirus,BCoV）、犬呼吸道冠状病毒（canine respiratory coronavirus,CRCoV）、严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）等,其中CRCoV与BCoV同源性较高,该类病毒与α属冠状病毒在基因组结构、致病机制、感染症状等方面差异较大。CCoV与FCoV在全球范围内广泛传播,具有发病率高、死亡率低的特点。由于RNA病毒本身的特点和环境选择压力的影响,这两种病毒不断变异进化,新的强致病力毒株相继出现。经FCoV基因突变演化而来的猫传染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus,FIPV）毒力大大增强,病毒基因组中某些特异性的点突变使得针对宿主的细胞嗜性发生改变,该病毒的致病机制主要依赖于病毒感染后诱导机体产生的抗体依赖性增强作用（ADE）。针对犬猫冠状病毒的流行病学调查及防控不能仅依赖于疫苗免疫单一因素,还应综合考虑病毒毒力、环境条件、宠物自身免疫抵抗力状态等。针对犬猫冠状病毒的诊断应根据临床症状,结合常规血液学检查、血清生化检查和实验室诊断技术来进行全面的鉴定,防止出现假阳性及假阴性结果。
周亚花[3]（2020）在《嵌合犬冠状病毒N、S基因的重组狂犬病病毒的拯救与鉴定》文中研究指明狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一种动物源性人兽共患病,一旦感染出现临床症状病死率为100%。犬冠状病毒病是由犬冠状病毒感染引起犬的一种接触性传染病,临床上以呕吐、腹泻、脱水和血便为主要特征,致死率较低,但与其他传染病如犬细小病毒、轮状病毒等混合感染时死亡率明显提高。本研究利用原核表达系统表达了犬冠状病毒N蛋白,免疫兔子后制备多克隆抗体,经过ELISA、Western blotting等试验鉴定,表明所表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,所制备的多克隆抗体具有良好的反应特异性。本论文主要基于狂犬病病毒反向遗传操作系统研制狂犬病和犬冠状病毒病二联基因工程疫苗。以狂犬病病毒弱毒SAD毒株为骨架,分别在狂犬病毒的N、P基因之间插入犬冠状病毒N和S基因,构建狂犬病毒全长cDNA,然后与辅助质粒按一定的比例共转染BHK-21细胞拯救重组病毒,通过免疫荧光和qPCR试验筛选出含有目的基因的重组狂犬病病毒BNSP-CCV-N和BNSP-CCV-S,然后对重组病毒的生物学特性进行了鉴定,Western blotting试验和免疫荧光试验表明重组病毒BNSP-CCV-N可同时表达RV-G蛋白和CCV-N蛋白,重组病毒BNSP-CCV-S可同时表达RV-G蛋白和CCV-S蛋白。病毒生长曲线表明BNSP-CCV-N在72 h,BNSP-CCV-S在96 h后病毒滴度不再提高,由此可以确定重组病毒的最佳收毒时间。电镜观察表明插入外源基因的重组病毒可组装成有一定形态的完整病毒粒子。同时将重组病毒在BHK-21细胞中连续传10代,通过RT-PCR检测表明重组病毒携带外源基因具有遗传稳定性。进一步选用BALB/c小鼠模型对该重组病毒的致病性和疫苗的免疫效果进行评价,小鼠脑内注射两种重组病毒后观察14天,均未出现肉眼可见的临床症状,表明重组病毒对小鼠无致病性。将重组病毒进行浓缩、纯化,灭活后与GEL佐剂按一定的比例制备灭活疫苗和弱毒疫苗,分组免疫小鼠。试验结果表明制备的灭活疫苗和弱毒疫苗安全性良好,通过不同组别免疫小鼠抗体水平的比对,制备的重组病毒的弱毒疫苗产生较高的抗狂犬病毒的中和抗体,制备的灭活疫苗BNSP-CCV-N+S有较高的抗犬冠状病毒N蛋白和S蛋白的特异性抗体,结果表明重组病毒具有制备二联基因工程疫苗的潜力,在本动物的免疫保护试验有待于进一步研究。本研究利用反向遗传操作系统成功拯救出含有犬冠状病毒N和S基因的重组狂犬病毒,用其分别制备的灭活苗和弱毒苗免疫小鼠后诱导产生较高的抗狂犬病毒中和抗体和犬冠状病毒的特异性抗体,该研究为狂犬病和犬冠状病毒二联疫苗的研究提供了一定的参考价值。
孟嘉欣[4]（2020）在《中国地区CCoV流行性Meta分析及2018～2019年黑龙江省CCoV分子流行病学调查》文中研究指明犬冠状病毒病（Canine coronavirus,CCoV）是一种具有分布广、发病率高且临床症状复杂等特点的传染性疾病。已有报道表明,冠状病毒变异会使其宿主由动物变为人,而犬作为人类日常生活伴侣与人类接触密切,所以密切关注犬冠状病毒流行与遗传变异情况对人类公共卫生具有重要意义。为全面了解中国CCoV流行情况,本试验采用Meta分析方法进行研究。首先收集并根据研究目的筛选中国19972019年发表关于国内CCoV流行情况的中英文文献,对符合要求的文献统计文章发表年份、作者、总样品数、阳性样品数、检测方法及样品来源背景等信息,并根据信息的全面性和试验详细程度进行评分估量。进一步提取文献中所有样品的背景信息数据并分为来源地区、季节、性别、免疫情况等共9个不同亚组,采用统计学方法分析不同亚组分类下CCoV流行率之间的差异及其与样品背景信息的关联性。最终通过统计学检验方法对亚组分析统计结果的异质性、文章发表偏倚性进行分析与验证。结合Meta分析结果,本研究进一步设计试验对20182019年中国黑龙江地区CCoV的流行及流行毒株遗传演化情况进行探究,收集黑龙江大庆、哈尔滨、鸡西、牡丹江、佳木斯和齐齐哈尔6个地区共378份腹泻犬粪便样品进行RT-PCR检测,统计学方法分析CCoV感染率与样品背景信息的相关性,并采用生物信息学方法对鉴定阳性毒株的M、S基因进行序列比对、同源性、遗传进化分析。Meta分析结果显示:本研究最终共筛选出24篇符合要求的文献,其中包含7个地区5 826份样品的相关信息,CCoV阳性数为2 115,总阳性率为36.3%。单组率分析结果显示:西南地区CCoV阳性率最高,为63%;华南地区CCoV阳性率最低,为6%;而东北地区CCoV阳性率为55%。2016年以前发表文献中CCoV阳性率比2016年及以后高17%,纯种犬比杂种犬CCoV感染率高39%,小于12月龄犬比大于等于12月龄犬CCoV感染率高40%,犬中CCoV-Ⅱ型的感染率比CCoV-Ⅰ型高55%,其他亚组分类中CCoV阳性率差异较小。相关性结果显示:有限的数据条件下,CCoV感染率与犬的性别、年龄、免疫情况、发病季节、品种、腹泻情况不具有相关性。RT-PCR检测结果显示:CCoV阳性样品总数为74份,总阳性率为19.58%。统计学分析结果显示大于12月龄犬低于06月龄犬CCoV感染率,秋、冬季节CCoV感染率低于春季,以上差异有统计学意义。M与S基因构建系统进化树结果显示:本试验鉴定CCoV主要流行毒株以CCoV-Ⅱ型为主,CCoV-Ⅰ型与CCoV-Ⅱ型鉴定毒株均与黑龙江本地流行毒株亲缘关系最近,而与不同基因型早期经典毒株的亲缘关系较远。37株CCoV鉴定毒株自身相比,M基因核苷酸与氨基酸同源性分别为83.2%100%和88.1%100%。与参考毒株相比,CCoV-Ⅰ型鉴定毒株与Ⅰ型原型毒株23/03的核苷酸与氨基酸同源性最高,CCoV-Ⅱ型鉴定毒株与国内早期毒株NJ17的核苷酸与氨基酸同源性最高,与341/05、CB/05的核苷酸与氨基酸同源性最低。3株CCoV-Ⅰ型鉴定毒株自身相比,S基因核苷酸与氨基酸同源性分别为97.2%98.4%和92.8%96.4%;4株CCoV-Ⅱ型鉴定毒株自身相比,S基因核苷酸与氨基酸同源性分别为85.9%100%和89.8%100%。M基因推导氨基酸序列比对结果显示:CCoV-Ⅰ型毒株整体与CCoV-Ⅱ型毒株相比,共存在4处氨基酸保守位点,分别为A129、T175、M195、E/DH202-203。S基因推导氨基酸序列比对结果显示:与CCoV-Ⅰ型经典毒株23/03、Elmo/02相比,本试验3株鉴定毒株共存在7处氨基酸一致性突变;CCoV-Ⅱ型鉴定毒株HLJ/L4、HLJ/L15及HLJ/t56与黑龙江鉴定毒株HRB-D6相比,共存在8处氨基酸一致性突变。S蛋白N-糖基化位点分析结果显示:以23/03为参考,分析发现鉴定毒株S蛋白第11941 284位氨基酸潜在N-糖基化位点,鉴定毒株HLJ/X24仅包含第1 273位N-糖基化位点,不包含第1 234位N-糖基化位点;而鉴定毒株HLJ/X4不包含这2个潜在N-糖基化位点;与参考毒株相比,CCoV-Ⅱ型鉴定毒株HLJ/L4、HLJ/L15在第1 246位多出1个N-糖基化位点,而鉴定毒株HLJ/t56在第1 246、1 340位共多出2个N-糖基化位点。M蛋白抗原性分析结果显示:CCoV-Ⅱ型第5组群鉴定毒株HLJ/X14的高抗原性氨基酸位点分布与CCoV-Ⅰ型参考毒株高度相似,主要分布在第151156、172177位氨基酸;鉴定毒株HLJ/28与参考毒株相比,在第173177位氨基酸额外多出1个高抗原性区域;CCoV-Ⅱ型鉴定毒株HLJ/J69与参考毒株相比,其在第1 2781 286位氨基酸多出1个高抗原性区域。以上研究结果表明,中国7个地区犬群中均存在CCoV感染,且CCoV-Ⅱ型毒株的流行率高于CCoV-Ⅰ型。此外,不同地区、年龄、品种犬的CCoV感染率差异较大。20182019年黑龙江地区CCoV流行毒株仍以CCoV-Ⅱ型为主,与国内外不同基因型经典毒株相比,黑龙江地区CCoV流行毒株的M、S基因均表现出较大程度变异,提示应该持续监测国内CCoV流行及遗传变异情况。
李浩[5]（2021）在《毛皮动物腹泻病病原检测及病毒病三重PCR方法的建立》文中研究指明近年来,腹泻疾病造成的毛皮动物病死率逐渐上升,给毛皮动物养殖业带来巨大的经济损失。目前唐秦地区存在毛皮动物腹泻疾病病原种类不明、相关检测技术准确率低且费用高等问题。本研究主要对唐秦地区毛皮动物腹泻致病菌和病毒进行流行病学调查,建立了一种能够同时检测三种常见病毒病的多重PCR快速检测方法,以期为毛皮动物腹泻病的快速诊断和防治提供依据。本研究取得的研究成果如下:1、对送检的采自于唐秦地区的198份毛皮动物的腹泻样本进行检测,其中犬细小病毒的检出率为40.40%,犬冠状病毒的检出率为0.51%,犬瘟热病毒的检出率为4.04%。大肠杆菌的检出率为10.61%,沙门菌的检出率为5.05%。结果表明,在采集的样本中存在着两种病毒引起的混合感染。犬细小病毒和犬冠状病毒的混合的检出率为0.51%,犬细小病毒与犬冠状病毒的混合感染检出率为6.06%。2、对检出的80份犬细小病毒进行BLSAT比对,并进行同源性分析,其中45份为CPV-2型和35份为CPV-2a型。3、利用设计好的引物分别扩增出犬细小病毒（700 bp）、犬瘟热病毒（410 bp）和犬冠状病毒（197 bp）的特异性片段,进行胶回收并构建好阳性重组质粒。建立的三重PCR方法对貉源大肠杆菌、沙门菌、肺炎克雷伯、绿脓杆菌和链球菌等无关病原的检测均无扩增,具有良好的特异性。此方法的阳性符合率跟单一PCR结果所一致且重复性稳定,犬细小病毒的质粒能扩增的最低检测拷贝数为1.56×105copies/u L、犬瘟热病毒最低检测拷贝数1.82×105copies/u L、犬冠状病毒最低检测拷贝数1.30×105copies/u L,为三种毛皮动物腹泻病毒的鉴别诊断引起的混合感染提供了检测技术手段。
沈洲[6]（2020）在《α冠状病毒nsp1蛋白抑制宿主基因表达的分子机制研究》文中指出α冠状病毒（Alphacoronavirus,α-CoV）成员众多,主要包括人冠状病毒229E（Human Coronavirus 229E,HCoV-229E）、人冠状病毒NL63（Human Coronavirus NL63,HCoV-NL63）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猫传染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitis virus,FIPV）、猪呼吸道冠状病毒（Porcine despiratory coronavirus,PRCV）和猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV）。它们能够引起人和动物的呼吸道、消化道、肝脏以及神经系统疾病,对人类生命财产安全造成严重危害。非结构蛋白1（Nonstructure protein 1,nsp1）是冠状病毒编码的多聚蛋白（Polyprotein,pp）pp1a最N端的组分,仅在α-CoV和β冠状病毒（Betacoronavirus,β-CoV）编码,目前对β-CoV nsp1的研究比较深入。β-CoV nsp1能够通过抑制宿主蛋白合成,减少细胞因子和抗原递呈分子的表达,进而降低机体对病毒感染细胞的杀伤作用,是一个重要毒力因子。目前α-CoV nsp1对病毒毒力的影响及抑制宿主蛋白合成的详细机制都不清楚。本课题以α-CoV nsp1蛋白为研究对象,探索了nsp1蛋白抑制宿主基因表达的结构基础和分子机制,具体内容如下:1.经过分子克隆,蛋白的表达及纯化,晶体的初筛及优化,数据的收集及处理等过程,首次成功解析了四种α-CoVs（PEDV、TGEV、FIPV和SADS-CoV）nsp1蛋白的全长高分辨率晶体结构,显示α-CoV nsp1具有保守的二级结构,主要由两个α-螺旋和六个β-折叠组成。基于α-CoV nsp1的氨基酸（Amino acide,aa）序列和晶体结构,把α-CoV分为两类:一类包括SADS-CoV、PEDV、HCoV-NL63和HCoV-229E,另一类包括FIPV、TGEV和PRCV。2.虽然α-CoV nsp1和β-CoV nsp1的氨基酸序列同源性低,但它们的三级结构同源性高,进而推测α-CoV nsp1跟β-CoV nsp1有相似的生物功能。通过核糖嘌呤霉素化（Ribopuromycylation,RP）及海参荧光素酶（Renilla luciferase,Rluc）实验,证实了α-CoV nsp1蛋白不仅能够显着抑制海参荧光素酶基因的表达,更能广谱的抑制宿主基因的合成,且呈现时间和浓度依赖性。基于PEDV nsp1的晶体结构,构建一系列截短和突变的质粒,Rluc实验结果表明PEDV nsp1的三段loops（67-71 aa,78-85 aa,103-110 aa）形成抑制宿主基因表达的关键功能域,但这在其它的α-CoV nsp1中并不保守。于是以TGEV nsp1为研究模型,并结合晶体结构和生化实验,最终证实了Motif（91-95 aa）是TGEV nsp1发挥功能的关键区域,更有意义的是这段区域在其它α-CoV nsp1中也有重要作用。3.为验证这段重要区域对病毒的影响,利用CRISPR-Cas9技术成功构建了相应的TGEV突变体。通过对重组毒在细胞和动物水平上的研究,发现了nsp1这段重要区域的突变虽然不会影响病毒在易感细胞上的复制能力,但会显着的降低病毒在易感动物上的致病力,从而首次证实了nsp1是α-CoV的一个关键毒力因子。结合对两类α-CoV nsp1作用于哺乳动物细胞的RNA测序及生化实验的结果证实α-CoV nsp1能影响宿主的免疫逃避和细胞周期,从而达到增强病毒毒力的可能。本课题首次成功解析了四种α-CoVs nsp1蛋白的全长晶体结构,确定nsp1蛋白调控宿主蛋白合成的重要功能区域,阐明nsp1蛋白在病毒毒力方面的关键作用,从而深入诠释α-CoV nsp1蛋白与宿主相互博弈的分子机制,为α-CoV新型疫苗的研制奠定科学基础。
王欣宇[7]（2017）在《2014-2015年黑龙江三个地区犬冠状病毒分子流行病学调查及病毒的初步分离》文中认为犬冠状病毒病是由犬冠状病毒（Canine coronavirus,CCoV）引起的一种急性、高度接触性胃肠道传染病。在德国1971年首次报道后,该病毒在亚洲、欧洲、南美洲、北美洲等多个国家和地区相继被报道并呈现全球流行趋势,给养犬业带来极大的危害。近年来,随着CCoV高致病性变异毒株的发现及病毒致病性增强在欧洲国家陆续报道,该病再一次引起了广泛的关注。在过去五年,我国关于CCoV的流行情况及遗传进化性等报道较少。鉴于此,本试验通过对2014年5月2015年4月,在黑龙江三个地区采集的腹泻犬粪便样品,进行CCoV的检测、遗传进化性分析、病毒的初步分离。明确黑龙江三个地区CCoV的基本流行情况,为CCoV的防控以及后续相关研究提供理论基础。为了明确黑龙江三个地区CCoV的流行现状及遗传进化性,本试验采集201份腹泻犬粪便拭子样品,采用RT-PCR方法针对CCoVM和S基因片段进行扩增,对扩增序列进行测序及分子进化性分析。M基因RT-PCR结果显示,201份样品中57份样品为CCoV阳性（28.36%,57/201）,其中CCoV-Ⅰ型和CCoV-Ⅱ型分别占15.79%（9/57）和84.21%（48/57）。序列分析显示,57个CCoV毒株的M基因序列核苷酸同源性为88.4%100%,推导氨基酸序列同源性为93%100%;57个CCoV毒株与中国参考株HF3比较,核苷酸同源性为88.7%96.2%,推导氨基酸序列同源性为92.2%97.4%;CCoV-Ⅰ型和CCoV-Ⅱ型毒株与中国参考毒株和其他国家参考毒株相比较呈现遗传多样性。57个CCoV阳性样品与CPV-2、CaKV和CBo V混合感染率分别为31.58%（18/57）、33.33%（19/57）、5.26%（3/57）。犬感染CCoV的年龄、免疫情况、地区与季节性都有较大的差异。57个CCoV阳性样品中S基因扩增出28份,其中26个CCoV-Ⅱa亚型毒株,1个CCoV-Ⅱb亚型毒株和1个CCoV-Ⅰ型毒株。S基因序列分析显示,26个CCoV-Ⅱa亚型毒株之间的核苷酸同源性为86.3%100%,推导氨基酸序列同源性为87.6%100%;26个CCoV-Ⅱa亚型毒株与中国参考株V1之间核苷酸同源性为89.6%92.2%,推导氨基酸序列同源性为91.1%97.5%。26个CCoV-Ⅱa亚型毒株与中国参考株和欧洲、北美、南美洲、亚洲参考株相比较呈现出不同的进化史。本试验选取单纯感染的23株CCoV阳性样品,利用MDCK进行病毒分离,其中9株样品盲传至第4代出现明显CPE,通过RT-PCR鉴定为阳性,继续盲传第7代眼观CPE消失,RT-PCR鉴定为阴性;将9株样品重新接种到MDCK细胞,盲传至第5代眼观4株出现明显CPE,通过巢式RT-PCR鉴定为阳性,继续盲传,第6代无眼观CPE存在,巢式RT-PCR鉴定为阴性。本研究揭示,黑龙江三个地区腹泻犬中同时存在CCoV-Ⅰ型、CCoV-Ⅱa亚型和CCoV-Ⅱb亚型,且CCoV-Ⅱ型毒株具有较高的感染率及遗传多样性。在黑龙江三个地区CCoV与CPV-2、CaKV有着很高的混合感染率。CCoV在MDCK细胞上能出现CPE,但是病毒增殖极其不稳定。
张晋[8]（2009）在《北京地区犬瘟热、犬细小病毒感染及犬冠状病毒病的分子流行病学调查》文中指出2007年12月～2008年5月对北京地区的犬病流行情况进行了调查,共调查犬404只,其中患犬瘟热41只,细小病毒性肠炎115只,犬冠状病毒病86只,主要以细小病毒性肠炎多发。本次调查疾病的样品阳性检出率与病犬的免疫预防有一定的关系,定期免疫的犬发病少,未免疫的犬样品阳性检出率高,说明未免疫的犬易感染犬瘟热等病,定期免疫可提高机体免疫力。本试验分析了犬病流行病学的特点,并提出了今后的防治措施和意见。根据发表的犬瘟热病毒（CDV）参考毒株Onderstepoort的序列设计了一对引物,以感染犬瘟热病毒的犬的粪便总RNA为模板,RT-PCR扩增出17株CDV的H全基因1877 bp的片段,将这个片段连接到pGEM-T easy载体上,经酶切鉴定得到阳性克隆,将阳性质粒进行序列测定,并与国内外毒株进行同源性比较和系统发育分析,结果显示17株均为Asia-1型。北京地区2008年流行的毒株主要是Asia-1型。本试验研究了CPV VP2297位点（Ser变为A1a）的变异情况。根据VP2位点297的改变引起限制性内切酶AluI酶切位点的变化,建立PCR依赖性限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）方法,检测VP2297位点的变异。通过基因进化树的分析表明,国内外的CPV起源于共同的祖先。同时根据GenBank中CPV-d株（M23255）VP2的基因序列和CPV-2、CPV-2a与CPV-2b的氨基酸位点差异,建立区分CPV-2、CPV-2a与CPV-2b的等位基因特异PCR,应用型特异性PCR将CPV-2与CPV-2a及CPV-2b区分开来,应用检测点突变的等位基因特异PCR,将CPV-2a与CPV-2b区分开来。在随机抽取的40个CPV阳性样品中,CPV-2、CPV-2a、CPV-2b分别占抽取样品总数的5%、77.5%和17.5%。目前CPV-2a与CPV-2b共同存在于犬群中。本试验采用Pratelli等建立的套式PCR方法,对采集自北京地区的犬粪便样品进行CCV检测和基因型分析,以调查CCV的流行情况及病毒的基因型。自2007年12月至2008年5月的6个月内收集的86份犬冠状病毒（CCV）阳性粪便样品中,随机抽取28份采自不同地点不同时期的样品,用可鉴定基因型的套式PCR方法检测,结果显示,28份随机样品中有25份检出Ⅱ型CCV,3份样品检出Ⅰ型CCV。说明北京地区犬冠状病毒流行的基因型以CCVⅡ型为主。
殷华平[9]（2007）在《传染性胃肠炎病毒基因组大片段克隆及其主要抗原片段在伪狂犬病病毒中的表达》文中研究说明传染性胃肠炎病毒属于冠状病毒科，主要引起猪的肠炎和严重的腹泻，新生仔猪的感染将导致严重的的死亡，给养猪业造成了巨大的危害和经济损失。TGEV基因组为单股正链RNA，具有感染性，全长约28.5 kb，5’端20kb序列编码病毒的复制酶多聚蛋白，3’端约8.3 kb编码4种结构蛋白（S、sM、M、N）和4种非结构蛋白，这些蛋白在病毒的生活周期中都具有重要的作用。其中S蛋白具有重要的生物学功能：携带有主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是唯一能诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白；含有宿主细胞氨肽酶的受体识别位点，决定其宿主组织细胞亲嗜性；是决定TGEV的毒力的基因之一；具有细胞膜融合作用，协助病毒从细胞核蛋白进入细胞浆；具有血凝活性区。目前，TGEV部分基因的功能还不完全清楚，因此本文拟通过RT-PCR的方法扩增获得TGEV的全长cDNA片段，并分段克隆大片段cDNA，为后期进行感染性克隆、基因功能研究、致病机制和疫苗的开发打下坚实的基础，也为冠状病毒特别SARS等的研究提供参考。参考GenBank登陆的TGEV序列，设计了6对引物，以抽提的TGEV细胞毒总RNA为模板，分段扩增获得了TGEV-31、TGEV-32、TGEV-33、TGEV-34、TGEV-35、TGEV-36共6段PCR产物，其大小分别为1.5kb、2.0kb、1.1kb、1.4kb、1.4kb、1.3kb，扩增片段与pGM-T载体连接获得了pGMT-31、pGMT-32、pGMT-33、pGMT-34、pGMT-35、pGMT-36共6个克隆，分别克隆了1456bp、1957bp、1079bp、1362bp、142bp、1327bp的TGEV cDNA片段，经生物信息学软件拼接共获得了TGEV 3’8495bp的序列。基于TGEV S、M、sM、N、Nsp3a、Nsp3b、Nsp7的进化树分析表明，TGEV与TS、HN2002、T014、TS、PURDUE等毒株具有非常近的亲缘关系。为了获得TGEV的全长cDNA，参考NCBI登陆的TGEV病毒的序列，设计了7对引物，以抽提的TGEV细胞毒的总RNA为模板，分段扩增获得了TGEV-A、TGEV-B、TGEV-Cl（mu）、TGEV-C2（mu）、TGEV-DE、TGEV-F6片段PCR产物，其大小分别为6.2kb、5.3kb、2.3kb、3.0kb、6.9kb、5.1kb。通过点突变的方法运用，以TGEV-Cl（mu）、TGEV-C2（mu）为模版，重叠PCR法扩增出了TGEV-C片段，其大小为5.3kb。TGEV-A、TGEV-B、TGEV-C、TGEV-DE、TGEV-F五个cDNA大片段，分别与pGM-T载体连接，结果仅成功克隆了其中的TGEV-A、TGEV-B、TGEV-F三个片段，分别命名为pTA-A、pTA-B、pGM-T。为了在原核细胞和真核细胞中进行S基因主要抗原片段的表达，设计一对引物从TGEV细胞毒RNA中扩增出了包含S基因主要抗原的片段，分别连接pET32a（+）、pET28a（+）和pEGFP-Cl表达载体，获得重组质粒pET32a-S、pET28a-S、pEGFPCI-S，并在大场杆菌和Vero细胞中分别进行了原核和真核的表达，结果pET32a-S、pET28a-S在Ecoli BL21细胞中未能获得良好表达，而pEGFPCl-S在Vero细胞中成功地获得了表达。为了构建表达TGEV S基因主要抗原片段的PRV重组病毒，PCR扩增了S基因主要抗原片段，并克隆到已经构建成功的绿色荧光蛋白转移载体pPPI2．EGFP中，命名为pPPI2．EGFP．S，采用磷酸钙法将pPPI2．EGFP．S与SA215病毒基因组DNA共转染Vero细胞，结果在12小时以后可以观察到绿色荧光，24～48小时荧光到达最大量，48小时后荧光开始衰退，细胞在转染48小时后开始出现病变，96小时后细胞75％出现病变；在96小时后可以看见出现发生重组的绿色荧光病变细胞，挑取病灶反复纯化几次，获得了表达S基因主要抗原片断重组病毒PRV SA215-S，抽提病毒基因组DNA，PCR扩增能够从中扩增出大小为1.7kb的S基因主要抗原片段。应用生物信息学软件分析了PRV和TGEV全基因序列的密码子偏爱性，分别计算了其RSCU、Nc、GC、GC3s、双核苷酸组成，根据计算的结果运用GC3s-Nc分布图、GC12-GC3s散点图、对应分析解析了TGEV和PRV密码子用法发生偏爱的主要影响因素，结果表明，PRV主要偏爱于使用以G和C结尾的密码子，而TGEV则主要使用以A和U结尾的密码子，影响PRV密码子偏爱G、C的主要因素是碱基组成限制、碱基突变、翻译选择和基因功能，TGEV的影响因素则只有碱基组成限制、碱基突变，翻译选择对其密码子的用法无影响。
鲁娜[10]（2007）在《TGEV纤突糖蛋白保护性抗原基因克隆、测序及表达》文中提出猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis of pigs，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的猪的一种急性、高度接触性肠道传染病。不同年龄和不同品种的猪对本病都易感，2周龄以内的仔猪具有高度感染性，以仔猪呕吐、严重腹泻和脱水为主要临床特征，致死率可达100％。本病常常由于混合感染和细菌继发感染，难以确诊，缺乏有效疫苗，给各国养猪业带来极大危害。对TGEV的研究表明，S基因编码的S蛋白，是诱导机体产生中和抗体和提供黏膜免疫保护作用主要的结构蛋白。其上的重要保护性抗原位点A、D，在诱导机体产生中和抗体中起关键作用。A位点缺失可导致S蛋白不能产生中和抗体，丧失黏膜免疫保护功能。D位点在中和抗体产生中也起着重要的作用。由此可见，对于S基因重要保护性抗原位点A、D基因的克隆及表达的研究就显得尤为重要。本研究根据Genbank上发表的TGEV-TH-98株S基因cDNA序列，设计并合成了一对扩增A、D位点的引物P1，P2。将自行分离的TGEV-JL毒株接种于单层PK-15细胞增殖病毒。提取TGEV-JL株基因组RNA，通过RT-PCR扩增出含A、D两抗原位点的目的片段S1基因，片段大小为1218bp。将S1基因克隆到pMD18-T克隆载体，构建成重组质粒pMD18-S1。对pMD18-S1进行鉴定后，再将S1基因亚克隆到pET-32a原核表达载体的EcoRⅠ和SalⅠ之间的多克隆位点上，进而构建了重组原核表达质粒pET-S1。将重组表达质粒pET-S1转化到表达宿主菌BL21中，用终浓度为1mmol／L的IPTG对宿主表达菌诱导表达。经SDS-PAGE分析表达产物，结果表明：S1基因在原核表达系统pET-32a中获得表达，表达的重组蛋白大小约为44KD。Western-blot检测表明，表达的重组蛋白能够被TGEV阳性血清所识别。由此说明，表达的重组蛋白具有良好的反应原性。上述结果提示，克隆的S1基因读码框架正确，可在乳酸杆菌中得到表达，为下一步构建乳酸杆菌穿梭表达载体，研制乳酸杆菌基因工程疫苗奠定基础。同时，该原核表达载体的构建及表达成功，为TGE诊断研究奠定基础。
二、犬冠状病毒部分纤突蛋白基因的分子克隆（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、犬冠状病毒部分纤突蛋白基因的分子克隆（论文提纲范文）
（1）犬冠状病毒M蛋白单克隆抗体的制备及其在胶体金检测试纸条上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 犬冠状病毒研究进展 |
| 前言 |
| 1.1 犬冠状病毒分类地位 |
| 1.2 病毒形态与结构 |
| 1.3 基因组结构 |
| 1.4 病毒感染的临床表现及病理变化 |
| 1.5 治疗与预防 |
| 1.6 犬冠状病毒诊断技术 |
| 1.7 免疫胶体金检测技术及其在兽医领域的应用 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 第2章 犬冠状病毒M蛋白单抗隆抗体的制备及其生物学特性鉴定 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 毒株 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 试剂和仪器 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第3章 小鼠腹水单克隆抗体纯化方法的比较研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第4章 犬冠状病毒胶体金免疫层析检测试纸条的制备 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）犬猫冠状病毒研究进展（论文提纲范文）
| 1 病原学 |
| 1.1 CCoV和FCoV 基因型分类 |
| 1.2 病毒基因组编码蛋白 |
| 2 致病机制 |
| 2.1 CCoV和CRCoV致病机制 |
| 2.2 FECV及FIPV致病机制 |
| 3 流行病学 |
| 3.1 CCoV流行病学特点 |
| 3.2 FCoV流行病学特点 |
| 4 临床症状 |
| 5 诊 断 |
| 5.1 CCoV感染诊断 |
| 5.2 FCoV感染诊断 |
| 6 防 控 |
| 7 展 望 |
（3）嵌合犬冠状病毒N、S基因的重组狂犬病病毒的拯救与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 狂犬病概述 |
| 1.1.1 狂犬病 |
| 1.1.2 狂犬病流行病学 |
| 1.1.3 狂犬病临床症状与致病机理 |
| 1.1.4 狂犬病毒基因组结构和编码蛋白 |
| 1.1.5 狂犬疫苗研究进展 |
| 1.2 犬冠状病毒病概述 |
| 1.2.1 冠状病毒概述 |
| 1.2.2 犬冠状病毒的临床症状与致病机理 |
| 1.2.3 犬冠状病毒基因组结构和编码蛋白 |
| 1.2.4 冠状病毒疫苗研究进展 |
| 1.3 RNA病毒的反向遗传操作和应用 |
| 1.3.1 正链RNA病毒的反向遗传操作技术 |
| 1.3.2 负链RNA病毒的反向遗传操作技术 |
| 第二章 犬冠状病毒N基因的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 N基因密码子优化及其重组表达质粒p ET-B2M-N的构建 |
| 2.1.3 CCVN蛋白的诱导表达 |
| 2.1.4 免疫动物 |
| 2.1.5 血清抗体效价的ELISA测定 |
| 2.1.6 抗体纯化 |
| 2.1.7 Western blotting检测 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 重组质粒的成功构建 |
| 2.2.2 重组N蛋白的诱导表达 |
| 2.2.3 多克隆抗体ELISA效价 |
| 2.2.4 抗体纯化结果 |
| 2.2.5 Western blotting检测结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 重组狂犬病病毒BNSP-CCV-N的拯救及生物学特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 质粒、细胞、病毒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 引物设计与合成 |
| 3.1.4 PCR扩增犬冠状病毒N基因 |
| 3.1.5 含犬冠状病毒N基因的重组狂犬病病毒基因组全长cDNA克隆的构建 |
| 3.1.6 重组病毒的拯救 |
| 3.1.7 免疫荧光鉴定重组病毒 |
| 3.1.8 实时荧光定量qPCR试验 |
| 3.1.9 重组病毒的传代和外源基因稳定性检测 |
| 3.1.10 重组病毒毒价测定以及生长曲线的测定 |
| 3.1.11 重组病毒浓缩、纯化 |
| 3.1.12 Western blotting鉴定外源蛋白表达 |
| 3.1.13 激光共聚焦观察和电镜观察 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 犬冠状病毒N基因的扩增结果 |
| 3.2.2 全长cDNA构建结果 |
| 3.2.3 qPCR鉴定重组病毒结果 |
| 3.2.4 免疫荧光鉴定重组病毒结果 |
| 3.2.5 重组病毒生长曲线的测定结果 |
| 3.2.6 重组病毒的电镜观察结果 |
| 3.2.7 Western Blotting鉴定外源蛋白的表达结果 |
| 3.2.8 外源基因稳定性检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 重组狂犬病病毒BNSP-CCV-S的拯救及生物学特性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒、细胞、病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 引物设计与合成 |
| 4.1.4 PCR扩增犬冠状病毒S1、S2、S3 基因 |
| 4.1.5 含犬冠状病毒S1、S2、S3 基因的重组狂犬病病毒基因组全长c DNA克隆的构建 |
| 4.1.6 重组病毒的拯救 |
| 4.1.7 免疫荧光鉴定重组病毒 |
| 4.1.8 实时荧光定量qPCR试验 |
| 4.1.9 重组病毒的传代和外源基因稳定性检测 |
| 4.1.10 重组病毒毒价测定以及生长曲线的测定 |
| 4.1.11 Western blotting鉴定外源蛋白表达 |
| 4.1.12 重组病毒浓缩、纯化 |
| 4.1.13 激光共聚焦观察和电镜观察 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 犬冠状病毒S1、S2、S3基因的扩增结果 |
| 4.2.2 全长cDNA构建结果 |
| 4.2.3 qPCR鉴定重组病毒结果 |
| 4.2.4 免疫荧光鉴定重组病毒结果 |
| 4.2.5 重组病毒生长曲线的测定结果 |
| 4.2.6 BNSP-CCV-S重组病毒的电镜观察结果 |
| 4.2.7 Western Blotting鉴定外源蛋白的表达结果 |
| 4.2.8 外源基因稳定性检测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 重组病毒对小鼠的致病性及免疫效果评价 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物、病毒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 重组病毒对小鼠的致病性研究 |
| 5.1.4 疫苗的制备与免疫试验 |
| 5.1.5 RFFIT检测狂犬病毒的中和抗体 |
| 5.1.6 间接ELISA方法检测N、S抗体 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 重组病毒对小鼠致病性结果 |
| 5.2.2 RFFIT检测狂犬病毒的中和抗体结果 |
| 5.2.3 间接ELISA检测犬冠状病毒特异性抗体结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）中国地区CCoV流行性Meta分析及2018～2019年黑龙江省CCoV分子流行病学调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 犬冠状病毒病概述 |
| 1.1.1 国内外流行情况 |
| 1.1.2 临床症状 |
| 1.1.3 致病机制 |
| 1.1.4 诊断方法 |
| 1.1.5 预防与治疗 |
| 1.2 CCoV生物学特征 |
| 1.2.1 CCoV形态及结构 |
| 1.2.2 CCoV基因组结构 |
| 1.2.3 CCoV结构蛋白 |
| 1.3 本研究目的与意义 |
| 2 中国地区CCoV流行性Meta分析 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 文库检索范围 |
| 2.2.2 检索策略 |
| 2.2.3 选择标准 |
| 2.2.4 数据提取 |
| 2.2.5 数据分析 |
| 2.2.6 森林图 |
| 2.2.7 偏倚分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 文献搜索结果 |
| 2.3.2 纳入文献基本情况 |
| 2.3.3 单组率Meta分析 |
| 2.3.4 中国各地区CCoV感染率相关性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 黑龙江地区CCoV分子流行病学调查 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验样品 |
| 3.1.2 主要生化试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 样品处理 |
| 3.2.2 目的基因测序与遗传进化性分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 目的基因PCR扩增 |
| 3.3.2 目的基因PCR产物纯化鉴定 |
| 3.3.3 CCoV样品阳性率及基因分型 |
| 3.3.4 相关性分析 |
| 3.3.5 系统进化树分析 |
| 3.3.6 核苷酸与氨基酸同源性分析 |
| 3.3.7 序列比对分析 |
| 3.3.8 基因重组分析 |
| 3.3.9 N-糖基化位点分析 |
| 3.3.10 抗原位点分析 |
| 3.4 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）毛皮动物腹泻病病原检测及病毒病三重PCR方法的建立（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 致腹泻病原的分子生物学概述 |
| 1.2 所致疾病的临床症状与病理变化 |
| 1.3 流行概况 |
| 1.3.1 致腹泻病原国外的流行概况 |
| 1.3.2 致腹泻病原国内的流行概况 |
| 1.4 细菌的临床诊断 |
| 1.5 毛皮动物腹泻病毒的PCR方法概述 |
| 1.6 关于毛皮动物腹泻病毒的多重PCR方法概述 |
| 1.7 问题与展望 |
| 第二章 唐秦地区2019-2020 年毛皮动物腹泻样本的病原检测 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 腹泻样本的采集 |
| 2.1.2 试验设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细菌分离培养 |
| 2.2.2 16Sr RNA鉴定 |
| 2.2.3 人工感染 |
| 2.2.4 病毒核酸的提取、c DNA合成 |
| 2.2.5 CDV的 RT-PCR的检测 |
| 2.2.6 CCV的 RT-PCR的检测 |
| 2.2.7 CPV的 PCR的检测 |
| 2.2.8 CPV VP2 基因的PCR扩增 |
| 2.2.9 重组载体的构建 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 细菌分离培养 |
| 2.3.2 16Sr RNA鉴定结果 |
| 2.3.3 致病性试验结果 |
| 2.3.4 犬瘟热病毒感染的临床症状 |
| 2.3.5 犬冠状病毒感染的临床症状 |
| 2.3.6 犬细小病毒感染的临床诊断 |
| 2.3.7 大肠杆菌感染的临床诊断 |
| 2.3.8 沙门菌感染的临床诊断 |
| 2.3.9 CDV的检测结果 |
| 2.3.10 CCV的检测结果 |
| 2.3.11 CPV的检测结果 |
| 2.3.12 CPV VP2 基因的克隆测序及序列分析结果 |
| 2.4 送检腹泻样本的检测结果 |
| 2.5 病原的混合感染情况 |
| 2.6 讨论 |
| 2.6.1 唐秦地区毛皮动物的腹泻病原的流行情况分析 |
| 第三章 毛皮动物腹泻病毒的三重PCR方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒(菌)株 |
| 3.1.2 腹泻样本 |
| 3.1.3 样本的处理 |
| 3.1.4 引物设计及核酸提取 |
| 3.2 主要仪器设备 |
| 3.3 主要试剂 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 核酸的提取 |
| 3.4.2 c DNA模板的制备 |
| 3.4.3 单一PCR的扩增 |
| 3.4.4 标准模板质粒的构建 |
| 3.4.5 单一PCR退火温度的扩增 |
| 3.4.6 单一PCR敏感度试验 |
| 3.4.7 多重PCR退火温度的优化 |
| 3.4.8 多重PCR引物浓度的优化 |
| 3.4.9 多重PCR特异性试验 |
| 3.4.10 多重PCR敏感度的确定 |
| 3.4.11 多重PCR重复性试验 |
| 3.4.12 多重PCR检测临床样品 |
| 3.5 结果 |
| 3.5.1 单重PCR检测结果 |
| 3.5.2 单重PCR退火温度优化 |
| 3.5.3 单重病毒PCR敏感性检测结果 |
| 3.5.4 多重PCR退火温度的优化 |
| 3.5.5 多重PCR引物浓度优化 |
| 3.5.6 多重PCR敏感性的确定 |
| 3.5.7 引物特异性分析 |
| 3.5.8 多重PCR重复性实验 |
| 3.5.9 临床样品的检测 |
| 3.6 讨论 |
| 3.6.1 关于靶基因的选择和方法的建立 |
| 3.6.2 多重PCR的优化及优缺点 |
| 3.7 建立多重PCR技术的可行性分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 论文受资助情况 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（6）α冠状病毒nsp1蛋白抑制宿主基因表达的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 冠状病毒 |
| 1.1.1 冠状病毒的概况 |
| 1.1.2 冠状病毒的分类 |
| 1.1.3 冠状病毒的基因组 |
| 1.2 α冠状病毒 |
| 1.2.1 人冠状病毒的概述 |
| 1.2.2 猪冠状病毒的概述 |
| 1.2.3 猫冠状病毒的概述 |
| 1.3 冠状病毒nsp1蛋白 |
| 1.3.1 nsp1蛋白的功能机制 |
| 1.3.2 nsp1蛋白的结构 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞、菌株、毒株和动物 |
| 2.1.2 载体与质粒 |
| 2.1.3 主要试剂耗材 |
| 2.1.4 抗体 |
| 2.1.5 重要仪器设备 |
| 2.1.6 主要试剂配制 |
| 2.1.7 软件及数据库 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 nsp1基因原核表达载体的构建 |
| 2.2.2 nsp1蛋白表达和纯化 |
| 2.2.3 nsp1蛋白晶体结构解析 |
| 2.2.4 nsp1基因真核表达载体的构建 |
| 2.2.5 去内毒素小提质粒 |
| 2.2.6 nsp1蛋白生化实验 |
| 2.2.7 构建重组病毒质粒 |
| 2.2.8 BAC质粒的提取 |
| 2.2.9 重组病毒的拯救及扩增 |
| 2.2.10 病毒生长曲线的测定 |
| 2.2.11 重组病毒对仔猪的致病力 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 nsp1蛋白纯化及晶体结构解析 |
| 3.1.1 nsp1基因原核表达质粒的构建 |
| 3.1.2 nsp1蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.1.3 nsp1蛋白结晶条件初筛和优化 |
| 3.1.4 nsp1 蛋白晶体的冻存和数据收集 |
| 3.1.5 nsp1 蛋白晶体结构的解析 |
| 3.2 nsp1氨基酸序列和晶体结构的同源性 |
| 3.2.1 冠状病毒nsp1氨基酸序列的同源性 |
| 3.2.2 冠状病毒nsp1晶体结构的同源性 |
| 3.3 α冠状病毒nsp1对宿主基因的影响 |
| 3.3.1 α冠状病毒nsp1对海参荧光素酶基因的作用 |
| 3.3.2 α冠状病毒nsp1对整体宿主蛋白合成的影响 |
| 3.4 α冠状病毒nsp1抑制宿主蛋白合成的关键区域 |
| 3.4.1 PEDV nsp1 抑制宿主合成的关键区域 |
| 3.4.2 TGEV nsp1 抑制宿主合成的关键区域 |
| 3.4.3 TGEV nsp1 的关键区域对其结构稳定的影响 |
| 3.4.4 91-95这段区域在其它α冠状病毒nsp1中的作用 |
| 3.5 突变nsp1 重要区域对α冠状病毒TGEV的影响 |
| 3.5.1 重组质粒的构建 |
| 3.5.2 重组病毒的拯救 |
| 3.5.3 重组病毒在易感细胞上的复制 |
| 3.5.4 重组病毒对初生仔猪的致病力 |
| 3.6 研究α冠状病毒nsp1发挥生物功能的机制 |
| 3.6.1 从结构角度阐述α和β冠状病毒nsp1的分子机制 |
| 3.6.2 α冠状病毒nsp1作用于哺乳动物细胞中的转录组学 |
| 3.6.3 α冠状病毒nsp1对干扰素方面的影响 |
| 3.6.4 α冠状病毒nsp1对细胞周期的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 α冠状病毒nsp1全长的晶体结构 |
| 4.2 Motif(91-95 aa)是α冠状病毒nsp1 抑制宿主基因表达的重要区域 |
| 4.3 突变nsp1关键区域不影响α冠状病毒的复制,但会显着减弱其致病力 |
| 4.4 α冠状病毒nsp1能够调节干扰素及细胞周期 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 合成的nsp1基因核苷酸序列 |
| 附录2 实验所用引物信息 |
| 附录3 在读期间研究成果 |
| 附录4 个人资料 |
| 致谢 |
（7）2014-2015年黑龙江三个地区犬冠状病毒分子流行病学调查及病毒的初步分离（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 犬冠状病毒病的流行病学 |
| 1.2 CCoV生物学特性 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 2 CCoV RT-PCR检测及遗传变异分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要生化试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品采集及处理 |
| 2.2.2 M基因扩增与测序 |
| 2.2.3 其他犬肠道病原体的检测 |
| 2.2.4 S基因扩增与测序 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 CCoV M基因PCR扩增 |
| 2.3.2 CCoV M基因PCR产物纯化 |
| 2.3.3 CCoV S基因PCR扩增 |
| 2.3.4 S基因PCR产物纯化 |
| 2.3.5 S基因菌落PCR |
| 2.3.6 CCoV阳性率及基因分型 |
| 2.3.7 CCoV阳性样品的免疫情况、年龄及采集时间的统计 |
| 2.3.8 CCoV阳性样品与其他犬肠道病原体混合感染的检测 |
| 2.3.9 CCoV M基因和S基因序列分析 |
| 2.3.10 CCoV M基因和S基因系统进化树分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 CCoV病毒的初步分离 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样品 |
| 3.1.2 细胞 |
| 3.1.3 主要生化试剂 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 病料处理 |
| 3.2.2 培养液配制 |
| 3.2.3 MDCK细胞培养及病毒增殖 |
| 3.2.4 CCoV初步分离及鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 CCoV的初步分离结果 |
| 3.3.2 M基因RT-PCR鉴定 |
| 3.3.3 M基因巢式RT-PCR鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（8）北京地区犬瘟热、犬细小病毒感染及犬冠状病毒病的分子流行病学调查（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 犬瘟热的研究进展 |
| 1 CD的发生与分布 |
| 2 CD病原 |
| 2.1 CDV的生物学性状 |
| 2.2 CDV分子生物学特性 |
| 3 CD流行病学 |
| 4 CDV分子生物学研究进展 |
| 4.1 CDV主要蛋白 |
| 4.2 CDV主要蛋白基因 |
| 5 CDV免疫学研究进展 |
| 5.1 免疫抑制的研究 |
| 5.2 免疫调节机制的研究 |
| 6 CDV的分离和鉴定 |
| 6.1 CDV的分离 |
| 6.2 影响CDV分离的因素 |
| 6.3 CDV的细胞受体 |
| 6.4 CDV的鉴定 |
| 第二章 犬细小病毒感染的研究进展 |
| 1 犬细小病毒感染的发生与分布 |
| 2 CPV感染病原 |
| 2.1 CPV的生物学性状 |
| 2.2 CPV分子生物学特性 |
| 3 CPV流行病学 |
| 4 CPV分子生物学研究进展 |
| 4.1 CPV-2的基因组结构 |
| 4.2 CPV-2编码的蛋白及功能 |
| 4.3 CPV-2的衣壳结构功能区 |
| 4.4 CPV-2的进化与变异 |
| 第三章 犬冠状病毒病的研究进展 |
| 1 CCV的形态学及其结构 |
| 2 CCV的基因组及其套式转录复制方式 |
| 2.1 CCV的基因组 |
| 2.2 CCV的套式转录方式 |
| 3 CCV的结构蛋白及功能 |
| 3.1 S蛋白 |
| 3.2 M和E蛋白 |
| 3.3 N蛋白 |
| 3.4 其他蛋白 |
| 4 CCV与宿主的相互作用 |
| 4.1 CCV的受体研究 |
| 4.2 宿主对CCV的免疫应答 |
| 5 CCV的国内外研究概况 |
| 5.1 致病性 |
| 5.2 流行病学调查 |
| 5.3 CCV病毒的演化 |
| 5.4 检测方法研究 |
| 5.5 预防和控制 |
| 参考文献 |
| 下篇 调查与试验 |
| 第四章 北京地区犬瘟热、犬细小病毒感染和犬冠状病毒病流行的初步调查 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 调查结果与分析 |
| 2.1 流行概况 |
| 2.2 不同月份的发病情况 |
| 2.3 不同年龄的发病情况 |
| 2.4 不同性别的发病情况 |
| 2.5 不同免疫注射情况的发病情况 |
| 2.6 不同动物来源的发病情况 |
| 2.7 CDV、CPV及CCV混合感染情况 |
| 2.8 临床症状描述 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第五章 北京地区犬瘟热病毒分离株H基因的分型 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CDV H基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2 重组质粒酶切鉴定 |
| 2.3 CDV H基因序列测定 |
| 2.4 CDV H基因的系统进化树构建和分析 |
| 2.5 CDV H基因cDNA序列及氨基酸序列分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第六章 犬细小病毒感染的分子流行病学调查 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 序列测定及分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CPV 297位点基因片段PCR扩增 |
| 2.2 CPV 297位点基因片段PCR产物酶切反应 |
| 2.3 CPV 297位点基因片段PCR产物测序结果 |
| 2.4 CPV 297位点基因片段的系统进化树构建和分析 |
| 2.5 CPV 297位点基因片段序列及氨基酸序列分析 |
| 2.6 CPV等位基因特异PCR扩增 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第七章 北京地区犬冠状病毒病基因型分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 第一轮CCV PCR扩增结果 |
| 2.2 第二轮CCV PCR扩增结果 |
| 2.3 CCV分型PCR扩增结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 全文总结 |
| 论文创新之处 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 附录:犬流行病学调查表 |
（9）传染性胃肠炎病毒基因组大片段克隆及其主要抗原片段在伪狂犬病病毒中的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.TGEV的分子生物学研究概况 |
| 1.1 传染性胃肠炎病毒基因组学 |
| 1.2 TGEV蛋白结构和功能 |
| 1.3 TGEV变异性及致病性研究概况 |
| 1.4 TGEV反向遗传研究概况 |
| 1.5 对传染性胃肠炎进一步研究的展望 |
| 2.伪狂犬病病毒基因缺失病毒及其表达载体研究进展 |
| 3.本研究的目的和意义 |
| 第二章 传染性胃肠炎病毒3′端8.5kb片段的克隆及序列分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 病毒RNA的提取 |
| 1.4 TGEV 3′端8.5 kb片断分段扩增 |
| 1.5 TGEV 3′端8.5kb片断分段克隆 |
| 1.6 TGEV 3′端8.5 kb片断序列特征分析 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 TGEV 3′端片断的分段RT-PCR扩增 |
| 2.2 TGEV 3′端片断的分段克隆 |
| 2.3 TGEV 3′端片断序列的生物信息学分析 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第三章 传染性胃肠炎病毒大片段的扩增与克隆 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物的设计与合成 |
| 1.3 病毒RNA的提取 |
| 1.4 TGEV-A、TGEV-B、TGEV-C、TGEV-DE和TGEV-F 5个片段RT-PCR扩增 |
| 1.5 TGEV-A、TGEV-B和TGEV-F 3个片段的克隆 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 TGEV-A片段的RT-PCR扩增 |
| 2.2 TGEV-B片段的RT-PCR扩增 |
| 2.3 TGEV-C片段的RT-PCR扩增 |
| 2.4 TGEV-DE片段的RT-PCR扩增 |
| 2.5 TGEV-F片段的RT-PCR扩增 |
| 2.6 TGEV-A片段的克隆 |
| 2.7 TGEV-B片段的克隆 |
| 2.8 TGEV-F片段的克隆 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四章 传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原片断的原核表达和真核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 S基因主要抗原片段在原核表达载体pET32a(+)、pET28a(+)中的表达 |
| 1.3 S基因主要抗原片段在Vero细胞中的表达 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 S基因主要抗原片段在pET32a(+)载体中的原核表达 |
| 2.2 S基因主要抗原片段在pET28a(+)载体中的原核表达 |
| 2.3 S基因主要抗原片段在Vero细胞中的真核表达 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第五章 传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原片段在伪狂犬病病毒中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 含传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原片段的伪狂犬病病毒转移载体的构建 |
| 1.3 TGEV S基因主要抗原片段与伪狂犬病病毒基因缺失疫苗株SA215的同源重组及表达 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 含传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原片段的伪狂犬病病毒转移载体的构建 |
| 2.2 pPPI2.EGFP.S11#与SA215的同源重组 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第六章 传染性胃肠炎病毒与伪狂犬病病毒全基因组密码子用法特点分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料和软件 |
| 1.2 实验方法步骤 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 TGEV和PRV分析的编码序列 |
| 2.2 PRV SA215株病毒gD基因序列的测定 |
| 2.3 PRV和TGEV RSCU值、Nc值、GC、GC_(3S)等各项参数的计算 |
| 2.4 影响PRV和TGEV密码子偏向性因素初步分析 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（10）TGEV纤突糖蛋白保护性抗原基因克隆、测序及表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 一、猪传染性胃肠炎研究展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 病毒的分类地位 |
| 1.2 TGEV的形态和理化特性 |
| 1.2.1 TGEV的形态特征 |
| 1.2.2 TGEV的理化特性 |
| 1.3 TGEV的培养特性 |
| 1.4 TGEV的病原性 |
| 1.4.1 组织嗜性 |
| 1.4.2 病毒受体 |
| 1.5 TGEV的抗原性、变异性 |
| 1.6 TGEV的免疫特性 |
| 2 发病机理 |
| 3 临床症状和病理变化 |
| 4 诊断 |
| 二、TGEV的分子生物学特性 |
| 2.1 TGEV基因组结构 |
| 2.2 TGEV基因的复制与转录 |
| 2.3 TGEV的蛋白结构与功能 |
| 2.3.1 非结构蛋白 |
| 2.3.2 TGEV结构蛋白 |
| 三、TGEV疫苗研究现状 |
| 3.1 基因工程苗 |
| 3.1.1 重组亚单位疫苗 |
| 3.1.2 基因工程活载体疫苗 |
| 3.1.3 核酸疫苗 |
| 3.2 转基因植物疫苗 |
| 3.3 干酪乳杆菌疫苗 |
| 四、本研究的目的和意义 |
| 研究部分 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒与细胞 |
| 1.1.2 菌株 |
| 1.1.3 载体 |
| 1.1.4 工具酶 |
| 1.1.5 核酸及蛋白质分子量标准 |
| 1.1.6 试剂盒 |
| 1.1.7 主要试剂 |
| 1.1.8 主要溶液 |
| 1.1.9 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒的培养与收获 |
| 1.2.2 TGEV-JL株病毒总RNA的提取 |
| 1.2.3 TGEV-JL株重要保护性抗原位点A、D基因的PCR扩增 |
| 1.2.4 PCR产物的克隆及鉴定 |
| 1.2.5 pMD18-S_1的基因序列的测定与分析 |
| 1.2.6 S_1基因原核表达载体的构建 |
| 1.2.7 重组表达菌的诱导表达 |
| 1.2.7.1 SDS-PAGE分析 |
| 1.2.7.2 Western-blot检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞病变结果 |
| 2.2 TGEV-JL株A、D抗原位点基因S_1的PCR扩增结果 |
| 2.3 重组质粒pMD18-S_1的酶切鉴定结果 |
| 2.4 重组质粒pMD18-S_1的PCR鉴定结果 |
| 2.5 pMD18-S_1基因的序列测定与分析结果 |
| 2.6 重组表达质粒pET-S_1的酶切鉴定结果 |
| 2.7 重组表达质粒pET-S_1的PCR鉴定结果 |
| 2.8 S_1基因表达产物的SDS-PAGE和Western-blot检测结果分析结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 S_1基因的重要作用 |
| 3.2 关于RNA的提取 |
| 3.3 关于RT-RCR扩增 |
| 3.4 S_1基因的序列分析 |
| 3.5 S_1基因的原核表达 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、犬冠状病毒部分纤突蛋白基因的分子克隆（论文参考文献）
- [1]犬冠状病毒M蛋白单克隆抗体的制备及其在胶体金检测试纸条上的应用[D]. 吕海峰. 扬州大学, 2021
- [2]犬猫冠状病毒研究进展[J]. 李少晗,张广智,崔尚金,秦彤. 中国畜牧兽医, 2020(12)
- [3]嵌合犬冠状病毒N、S基因的重组狂犬病病毒的拯救与鉴定[D]. 周亚花. 中国农业科学院, 2020
- [4]中国地区CCoV流行性Meta分析及2018～2019年黑龙江省CCoV分子流行病学调查[D]. 孟嘉欣. 黑龙江八一农垦大学, 2020(10)
- [5]毛皮动物腹泻病病原检测及病毒病三重PCR方法的建立[D]. 李浩. 河北科技师范学院, 2021
- [6]α冠状病毒nsp1蛋白抑制宿主基因表达的分子机制研究[D]. 沈洲. 华中农业大学, 2020
- [7]2014-2015年黑龙江三个地区犬冠状病毒分子流行病学调查及病毒的初步分离[D]. 王欣宇. 黑龙江八一农垦大学, 2017(08)
- [8]北京地区犬瘟热、犬细小病毒感染及犬冠状病毒病的分子流行病学调查[D]. 张晋. 南京农业大学, 2009(S1)
- [9]传染性胃肠炎病毒基因组大片段克隆及其主要抗原片段在伪狂犬病病毒中的表达[D]. 殷华平. 四川农业大学, 2007(02)
- [10]TGEV纤突糖蛋白保护性抗原基因克隆、测序及表达[D]. 鲁娜. 吉林农业大学, 2007(04)