一、降钙素基因相关肽与心血管疾病（论文文献综述）
田军[1]（2021）在《降钙素基因相关肽（CGRP）通过调控Akt/mTOR信号通路介导的凋亡和自噬减轻创伤性颅脑损伤的实验研究》文中指出创伤性颅脑损伤（Traumatic Brain Injury TBI）的定义是由于外部机械力造成的脑损伤,并导致大量的死亡和残疾,许多受害者有功能障碍,如运动和感觉功能障碍,甚至认知功能缺陷。据估计,全世界每年约有5000万人被诊断为TBI。颅脑损伤根据发生的不同过程和阶段,可分为原发性和继发性脑损伤,都是由脑外伤引起的复杂疾病。组织丢失和细胞死亡是主要的损伤,TBI后由于原发性颅脑损伤导致的继发性脑损伤,导致激活的小胶质细胞、募集的中性粒细胞和巨噬细胞以及血液代谢物中引起的炎症反应均可导致继发性脑损伤,进而导致进一步的功能性和器质性的脑损伤。炎症反应被认为是TBI继发性损伤的重要机制。从理论上讲,减少炎症改善受损脑组织能量及代谢可以减轻TBI引起的继发性脑损伤。降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide CGRP）是由37个氨基酸组成的多肽,广泛表达于中枢和外周神经系统。目前,CGRP被认为是最有效的血管舒张药。CGRP在脑组织中起保护作用。当脑组织受到损伤并出现缺血时,小鼠脑TBI后产生大量自我保护物质,CGRP是其中最重要的保护物质之一。研究表明,在TBI后的病理过程中,CGRP的分泌在TBI后增多。增加的目的是使脑血管扩张,尽快为损伤后缺血缺氧的脑组织提供血液供应。然而,当脑组织损伤缺血较严重时,脑组织产生的CGRP不能完全防御这种损伤。因此出现了严重的脑组织继发性和永久性损伤。考虑到CGRP具有保护脑损伤的潜力,而自噬和凋亡在TBI诱导的继发性损伤中发挥重要作用,我们检测了CGRP是否能抑制TBI小鼠的自噬和凋亡的表达。结果表明,CGRP通过减轻脑水肿、调节神经元自噬和凋亡,减低TBI后神经炎症反应来保护大脑。第一部分创伤性颅脑损伤患者血清CGRP水平及与预后的关系目的:临床工作中,观察不同TBI患者CGRP表达变化、判断伤情程度,进一步探讨CGRP与TBI患者病情程度及预后的关系,并探讨CGRP是否可以作为判断TBI预后的可靠指标。方法:选取138例TBI患者进行分组:健康体检者54例（对照组）,重度TBI组73例,轻度TBI组65例。采用酶联免疫分析试剂法（ELISA）,测定TBI患者特定时间的血清CGRP水平。采用格拉斯哥昏迷量表（GCS）判定TBI严重程度。统计分析:各组不同时间CGRP比较采用重复测量资料的方差分析,同一时间组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法。采用wilicoxon秩和检验分析患者血清CGRP水平与临床变量的关系。结果:1.TBI后患者血清CGRP的变化对照组随时间变化呈现平稳状态,TBI（轻度组）和TBI（重度组）先下降后逐渐上升。两组血清CGRP水平均低于对照组。入院时、1天、3天、7天和14天时间点,TBI（重度组）低于TBI（轻度组）,差异显着,有统计学意义;入院时、1天、3天时间点,TBI（轻度组）低于对照组,差异显着,有统计学意义;入院时间点7天和14天,TBI（轻度组）低于对照组,但差异不显着。2.入院时TBI患者血清CGRP水平与临床病理特征关系相对于GCS评分<5分的患者,GCS评分≥5分的患者血清CGRP水平较高（Z=-2.277,P=0.023）。存活患者的CGRP水平高于死亡患者（Z=-3.571,P<0.001）。3.入院血清CGRP预测TBI患者伤后死亡的价值评估血清CGRP水平预测TBI患者伤后死亡的特异度为88.24%,灵敏度为68.82%,CGRP预测最佳临界值为13.255pg/ml。4.TBI患者预后与血清CGRP的相关性CGRP高水平组患者生存情况优于低水平组患者,差异显着;单因素Cox分析发现,年龄,中线结构移位,GCS分数,CGRP水平与TBI患者预后相关;多因素Cox分析发现,中线结构移位,CGRP水平是TBI患者独立预后因素。小结:1.TBI后患者血清中的CGRP变化趋势为随伤后时间变化先降低,然后逐渐升高。约至24小时到达最低点,大约在14天前后达高峰。2.血清CGRP水平可以预测TBI患者的预后不良及死亡,而且该预测效能较高。第二部分降钙素基因相关肽（CGRP）对小鼠创伤性颅脑损伤神经功能的保护作用目的:通过重物打击法（Feeney重物下降挫伤法）,建立开放性创伤性颅脑损伤（Traumatic Brain Injury TBI）动物模型,并予以脑室注射联合尾静脉注射外源性降钙素基因相关肽（CGRP）干预TBI模型小鼠;通过旷场实验、水迷宫实验、巴恩斯迷宫实验、跳台实验对实验小鼠的行为学评分进行测量,验证（CGRP）对创伤性颅脑损伤神经功能的保护作用。通过测量CGRP干预前后小鼠脑挫伤面积比较、脑水肿比较、血脑屏障破坏程度等方面的比较,来探讨CGRP对TBI小鼠脑损伤的保护作用。方法:清洁级（SPF）雄性BALB/C小鼠390只,随机分为sham组、TBI组和TBI+CGRP组。用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg,i.p.i.）麻醉小鼠,根据Feeney重物下降法,建立开放性颅脑创伤模型。TBI+CGRP两组分别用CGRP肽（脑室注射+尾静脉注射）,术后每日采用改良神经严重程度评分（m NSS）检测各组小鼠的神经功能缺损程度。各组小鼠分别于术后相应的时间点（1、3、5、7天）取材;苏木精伊红染色（HE染色法）和（TTC）染色法:测量小鼠脑组织损伤面积,并进行组间对比;通过干湿重法测量不同组别小鼠的脑组织含水量;通过测量Evans Blue（EB）渗透率的方法,来判定TBI后血脑屏障的破坏程度。通过蛋白质印迹法（Western blot）测量脑组织CGRP蛋白的表达量。通过行为学测试对小鼠神经行为学进行测量:术后第8、9天进行旷场实验;术后第10-15天行水迷宫实验;术后第16-22天行巴恩斯迷宫实验;术后第23、24天为跳台实验的训练和测试阶段。结果:1.创伤性颅脑损伤（TBI）（Feeney重物下降挫伤法）动物模型稳定:术后小鼠平均昏迷时间约为1.5-2h,生命体征较平稳,体温恢复,呼吸平稳,逐渐苏醒和爬行,可进食水。脑组织经解剖,均可见局部挫伤灶,局部坏死、淤血,伴部分脑组织的凹陷缺损;部分样本损伤灶同侧可见蛛网膜下腔出血。2.各组小鼠m NSS评分差异术后第1天,TBI+CGRP组和TBI组相对sham组,神经功能均受损明显。TBI+CGRP组和TBI组神经功能基本相同,差异无统计学意义;在TBI后第2-7天,TBI+CGRP组小鼠m NSS评分低于TBI组,差异显着;第2-7天TBI+CGRP组和TBI组神经功能逐渐有所好转,两组小鼠的分数逐渐下降。3.TBI小鼠神经功能行为学评分结果旷场实验（Open field test）评分结果:总活动距离测试:sham组总距离最长,TBI+CGRP组小鼠的总距离居中间水平,TBI组的总距离最短。TBI+CGRP组小鼠的总距离相比TBI组的总距离长,差异显着。静止次数和静止时间和测试方面:TBI组小鼠静止次数最多,sham组和TBI+CGRP组静止次数较低,和TBI组小鼠相比,差异不显着,无统计学意义。TBI组小鼠静止时间最长,sham组和TBI+CGRP组静止时间相对较最低,和TBI组小鼠相比,差异不显着,无统计学意义。水迷宫实验:定位航行实验阶段:水迷宫测试小鼠发现平台的潜伏期,TBI+CGRP组小鼠的潜伏期相比TBI组小鼠的潜伏期时间短,差异显着,有统计学意义。TBI组小鼠比sham组小鼠的潜伏期长,差异显着,有统计学意义。空间探索实验阶段:在测试的第五天小鼠穿过平台次数,sham组最多,TBI组最少,TBI+CGRP组居中。TBI组穿过平台次数相比sham组少,差异显着,有统计学意义;TBI+CGRP组穿越平台次数多于TBI组,差异显着,有统计学意义。巴恩斯迷宫测试:训练阶段:TBI组小鼠的潜伏期相比较TBI+CGRP组小鼠的潜伏期长,差异显着,有统计学意义。第六天试验中,第一次探查目标洞（无暗箱）前的错误探查次数比较,TBI+CGRP组小鼠的探错次数相比TBI组小鼠多,差异显着,有统计学意义。跳台实验评分:在跳台试验测试阶段,TBI+CGRP组小鼠的潜伏期相比较TBI组小鼠的潜伏期长,差异显着,有统计学意义;错误次数:TBI+CGRP组小鼠的错误次数相比较于TBI组小鼠的错误次数少,差异显着,有统计学意义。4.不同组别小鼠脑组织标本创伤面积的测量和比较:三组小鼠脑组织切片相比较:TBI+CGRP组与TBI组相比较,均可见一定程度的脑组织损伤及局灶性神经细胞组织缺失,早期缺损范围的差异性较小。随着时间的推移,TBI小鼠脑组织切片可见更严重的脑损伤;定量计算脑损伤体积,TBI+CGRP组小鼠脑组织切片与TBI组小鼠脑组织切片相比较,损伤面积略小,但差异不显着,无统计学意义。5.脑水肿测定:外源性CGRP干预,将TBI术后脑水肿消退的时间点提前,减少了TBI诱导的脑水肿在TBI后持续时间,加速了TBI诱导的脑组织水肿的吸收,进而减轻脑损伤;另一方面,TBI+CGRP组小鼠的脑含水量在1天、3天、5天、7天这四个时间点,脑水肿程度均低于TBI组小鼠,差异显着,有统计学意义。6.血脑屏障损伤程度:TBI术后第1天,sham组未见明显依文思蓝（EB）渗出,TBI+CGRP组小鼠（EB）渗透率和TBI组相比无明显差异;TBI后第3、5、7天,TBI+CGRP组和TBI组小鼠依文思蓝（EB）渗透率仍较高,TBI+CGRP组小鼠依文思蓝（EB）渗透率低于TBI组,两者差异显着,有统计学意义。7.TBI后各组小鼠CGRP蛋白表达水平的差异:TBI组小鼠脑组织中CGRP表达水平显着降低,并随着时间的推移逐渐升高;TBI+CGRP组脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,差异显着,有统计学意义。小结:1.根据Feeney重物下降法,可建立标准、可靠的开放性颅脑损伤动物模型,术后正常喂养及观察行为学变化,确认TBI模型建立。2.CGRP干预减低了创伤性颅脑损伤小鼠的神经功能损伤,减低了创伤性颅脑损伤挫伤灶的损伤面积;减低了创伤性颅脑损伤后脑水肿的程度,减少了TBI后脑水肿的持续时间;减轻了TBI后血脑屏障的破坏程度。3.通过蛋白印迹法可见TBI后小鼠脑组织中CGRP的表达水平显着降低,24h达最低,随时间推移逐渐回升。TBI+CGRP组小鼠脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,提示本实验采用的脑室注射+尾静脉注射干预途径有效可靠。第三部分降钙素基因相关肽（CGRP）对创伤性颅脑损伤后神经元细胞自噬和凋亡的影响目的:通过对小鼠挫伤脑组织部位取材,对其进行自噬和凋亡相关标志性蛋白检测,观察对比CGRP干预前后自噬和凋亡标志性蛋白的变化情况,探讨CGRP在TBI环境下对自噬和凋亡的调控作用。方法:通过免疫荧光双染法:定位分析LC3和Neu N及GFAP蛋白;蛋白质印迹法,定量分析LC3、P62、Beclin-1、cleaved-caspase-3表达量;TUNEL和Neu N双染色法,分析TBI后神经元凋亡的表达变化情况。结果:1.CGRP对TBI小鼠神经元细胞自噬的影响免疫荧光双染法:脑皮层挫伤区LC3（+）蛋白定位于挫伤部位神经元的胞质中,Sham组可见少量阳性表达,随时间推移阳性表达程度无变化。TBI组于伤后1天可见LC3（+）细胞显着增多,随时间推移表达程度逐渐增强,高于Sham组,差异显着;TBI+CGRP组与TBI组比较,LC3（+）细胞数量较少,表达程度明显减弱,TBI后第1天,差异不显着,无统计学意义;而TBI后第3、5、7天,两组差异性逐渐增强,差异显着,有统计学意义。蛋白质印迹法:部分自噬标志物LC3、P62、Beclin-1蛋白表达与双染结果一致。TBI+CGRP组的LC3II/LC3I比值和Beclin-1水平较TBI组明显降低,差异显着,有统计学意义。P62水平的变化则相反,与sham组相比,TBI导致小鼠P62表达降低,TBI+CGRP组的P62较TBI组明显升高,差异显着,有统计学意义。CGRP的干预导致P62蛋白表达逐渐增强并维持在一个相对较高的阶段。2.CGRP对TBI小鼠神经元细胞凋亡的影响:TUNEL和Neu N双染色显示:TBI导致神经元凋亡增加,挫伤灶周围TUNEL（+）细胞明显增加;TBI+CGRP组的TUNEL（+）较TBI组明显降低,差异显着,有统计学意义;蛋白质印迹法:（Western blot法）:TBI导致神经元凋亡,小鼠挫伤灶脑组织凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3表达升高,皮层组织细胞凋亡增加。TBI+CGRP组的cleaved-caspase-3较TBI组明显降低,差异显着,有统计学意义。3.CGRP对TBI小鼠神经元细胞神经胶质纤维酸性蛋白GFAP的影响:与sham组相比,TBI导致小鼠神经元细胞GFAP数量明显增加,Neu N数量明显减低,而CGRP的干预降低了神经元细胞损伤。脑皮层挫伤区GFAP（+）表达:Sham组可见少量阳性细胞表达,表达不明显。TBI组和TBI+CGRP组伤后1、3、5、7天均可见阳性细胞显着增多。TBI组GFAP（+）计数率高于Sham组,差异显着;TBI+CGRP组GFAP（+）计数率低于TBI组第1、3天差异无显着性,第5、7天差异显着,有统计学意义。脑皮层挫伤区Neu N（+）表达:Sham组可见适量Neu N（+）表达。TBI组和TBI+CGRP组伤后1、3、5、7天均可见Neu N（+）细胞显着减少。TBI组Neu N（+）计数率低于Sham组,差异显着,有统计学意义;TBI+CGRP组Neu N（+）计数率高于TBI组差异显着,有统计学意义。小结:1.TBI后小鼠神经细胞自噬和凋亡水平增加,予以外源性CGRP干预,有效抑制了TBI所致小鼠神经元细胞的自噬和凋亡;2.TBI后小鼠神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在显着增加,CGRP干预后,减少了TBI小鼠颅脑损伤部位的胶质纤维酸性蛋白的出现,保护神经细胞功能。第四部分AKT/m TOR信号通路参与了外源性CGRP对神经元细胞自噬和凋亡的调控目的:通过利用CGRP干预TBI小鼠模型,在信号通路层面探讨CGRP对自噬和凋亡相关通路蛋白的调控情况,进一步探讨CGRP对自噬和凋亡的调控机制。方法:通过CGRP干预TBI小鼠模型,采用蛋白质印迹法（Western Blot法）,测定CGRP干预前后挫伤灶局部脑组织的AKT/m TOR、Fox O3a通路相关标志蛋白的变化情况,并对比CGRP干预前后的蛋白表达变化差异。结果:1.CGRP对AKT/m TOR通路的影响TBI术后导致了小鼠脑神经元细胞内p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR水平降低,TBI+CGRP组和TBI组均低于sham组,差异显着,有统计学意义。CGRP使这两者比值均升高。其中,CGRP对p-Akt/Akt激活作用较明显,术后1、3、5、7天四个时间点,TBI+CGRP组的p-Akt/Akt相比TBI组表达升高,差异显着,有统计学意义;CGRP对p-m TOR/m TOR激活作用较弱,术后第1、3天TBI+CGRP组p-m TOR/m TOR相比TBI组,差异显着,有统计学意义;术后第5、7天TBI+CGRP组p-m TOR/m TOR相比TBI组,差异不显着,无统计学意义;同时,Akt/m TOR信号的激活也在TBI后逐渐增强。2.CGRP对Fox O3a表达的影响TBI术后细胞核中Fox O3a蛋白水平显着升高,而细胞浆中Fox O3a蛋白水平显着降低,证实TBI导致了小鼠脑神经元细胞内Fox O3a蛋白分布的变化。CGRP使细胞核内Fox O3a增加逐渐减弱,而胞浆中Fox O3a逐渐升高。细胞核中Fox O3a蛋白表达情况可见,TBI+CGRP组的Fox O3a蛋白表达低于TBI组,差异显着,有统计学意义;而细胞浆中Fox O3a表达情况可见,TBI术后1、3、5、7天四个时间点,TBI+CGRP组的Fox O3a蛋白表达高于TBI组,差异显着,有统计学意义。小结:1.TBI抑制了Akt/m TOR信号通路的激活,对神经元细胞有损伤作用;外源性CGRP干预促进了Akt/m TOR信号通路的激活,导致了神经元细胞自噬和凋亡的降低,起到了脑保护作用。2.TBI促进了Fox O3a蛋白向神经元细胞核内转移,对神经元细胞有损伤作用;外源性CGRP干预可缓解细胞核内的Fox O3a升高趋势,保护神经元细胞。结论:1.临床TBI患者血清样本中CGRP变化趋势为先迅速降低然后逐渐升高,约24小时到达最低点,大约在14天前后达高峰,与动物模型变化趋势相同。2.血清CGRP水平可以预测TBI患者的预后不良及死亡情况,而且该预测的效能较高。CGRP高水平组远期预后、存活率优于CGRP低水平组;存活患者血清CGRP水平高于因TBI死亡的患者。CGRP可以作为TBI预后不良及死亡评估的参考指标。3.根据Feeney重物下降法,可建立标准、可靠的颅脑挫伤动物模型,术后正常喂养及观察行为学变化,确认TBI模型建立。4.CGRP干预,减低了创伤性颅脑损伤鼠的神经功能损伤,减低了创伤性颅脑损伤挫伤灶的损伤面积;减低了创伤性颅脑损伤后脑水肿的程度,减少了TBI后脑水肿的持续时间;减轻了TBI后血脑屏障的破坏程度;通过蛋白印迹法,可见TBI+CGRP组脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,提示脑室注射联合尾静脉注射的外源性干预途径有效可靠。5.TBI后小鼠神经细胞自噬和凋亡水平增加,神经胶质纤维酸性蛋白GFAP增加;CGRP的干预有效抑制了TBI所致小鼠神经元细胞的自噬和凋亡,减少了TBI小鼠颅脑损伤部位GFAP的表达。6.TBI抑制了Akt/m TOR信号通路的激活,导致了神经元细胞自噬和凋亡水平升高,同时促进了Fox O3a蛋白向细胞核内转移,对神经元细胞有损伤作用;相反,外源性CGRP干预可促进Akt/m TOR信号通路的激活,抑制了神经元细胞自噬和凋亡,缓解了细胞核内的Fox O3a升高趋势,起到了脑保护作用。
雷蕾[2]（2020）在《rAAV9介导的CGRP基因对自发性高血压大鼠血压、左心室纤维化、肾脏损伤的影响》文中研究说明目的:研究静脉注射重组腺相关病毒9型（Recombinant adenoassociated viral,r AAV9）介导的降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide,CGRP）基因对自发性高血压大鼠（Spontaneously hypertensive rats,SHR）血压、左心室纤维化、肾脏损伤的影响。方法:16只自发性高血压大鼠（SHR）,随机分为4组,每组4只,分为对照组、空载体组、CGRP组、贝那普利组,无创测量大鼠血压,检测各组大鼠血浆中CGRP含量,尿微量白蛋白含量,在第8周处死大鼠,检测各组大鼠左室心肌组织中的CGRP表达,左心室重量指数,左心室的心肌胶原容积分数（Collagen volume fraction,CVF）,并对肾脏组织进行病理形态学观察。结果:1.第3周,第6周,第8周CGRP组血浆CGRP浓度较其它三组明显升高（P<0.05）,贝那普利组CGRP含量三个时间点均高于对照组、空载体组（P<0.05）。CGRP组左心室CGRP表达最多,贝那普利组次之,对照组与空载体组最少。2.CGRP组在注射后第3周出现血压下降,在第3周到第7周,收缩压下降与对照组、空载体组有显着性差异（P<0.05）;贝那普利组,CGRP组各个时间点无明显差异（P>0.05）。贝那普利组在给药后第3周开始出现收缩压下降,第3周到第8周收缩压下降与对照组、空载体组血压有统计学差异（P<0.05）。3.大鼠收缩压与血浆CGRP的浓度呈中等程度负相关。4.CGRP组,贝那普利组均与对照组、空载体组CVF有显着性差异（P<0.05）。5.第3周,第6周,第8周,CGRP组尿微量白蛋白浓度较其它三组明显降低（P<0.05）。第3周贝那普利组尿微量白蛋白浓度与对照组、空载体组无明显差异（P>0.05）,第6周及第8周贝那普利组尿微量白蛋白浓度低于对照组、空载体组,有显着性差异（P<0.05）,CGRP组第3周及第6周与贝那普利组无明显差异（P>0.05）,第8周尿微量白蛋白浓度低于贝那普利组,有显着性差异（P<0.05）。在对照组和空载体组可见肾小管基膜和间质硬化,肾小管上皮细胞出现肿胀。在CGRP组和贝那普利治疗组中未见明显肾小管及肾小球的病理改变。结论:1.SHR尾静脉注射r AAV9-CGRP基因后,第3周到第8周血浆CGRP浓度增高。第3周到第7周收缩压下降。2.r AAV9-CGRP基因能减少左心室心肌纤维化,降低尿微量白蛋白,减轻肾小管的损伤,其保护作用与贝那普利相似。
王蕾[3]（2019）在《Calca基因启动子区DNA甲基化影响2型糖尿病大鼠ASCs成骨功能的研究》文中研究表明糖尿病是继心血管疾病之后的第二大慢性疾病,其中2型糖尿病（Type 2diabetes mellitus,T2DM）占据90%-95%。糖尿病的高血糖毒性,异常胰岛素及细胞因子水平、氧化应激等,导致了以低骨量和骨组织微结构破坏为特征糖尿病性骨质疏松的形成。对于口腔种植而言,血糖控制较差的患者早期骨整合能力下降,周围软组织愈合时间延长,感染几率增加。近年来,干细胞的发现为各种组织修复带来了新的希望,干细胞具有多向分化、自我更新以及分泌多种细胞因子能力,可参与损伤组织与器官修复和再生。干细胞可分为全能干细胞,多能干细胞和单能干细胞,分化潜能逐级下降。组织工程技术利用干细胞来提高糖尿病患者的成骨能力,也得到多个实验证实。来源于自体的干细胞,由于临床易得、能促进长期的移植生存和移植耐受等优点,成为理想的种子细胞。其中,骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）及脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells,ASCs）应用最为广泛。但考虑到临床应用中,BMSCs获取困难,同时糖尿病患者来源的BMSCs相比正常BMSCs数量减少,再生能力减弱,增殖和存活能力降低,成骨分化显着下降,限制了其在再生方向的应用。而T2DM来源的ASCs（ASCs-T2DM）获取简便,且获取数量并未减少,生长曲线和对照组类似,故而ASCs成为更具有应用前景的细胞。但是,T2DM个体来源的ASCs相比健康个体来源ASCs（ASCs-Control,ASCs-C）成骨能力减弱,应用于骨组织修复时不能满足需要,主要是因为2型糖尿病的机体环境可改变ASCs成骨及增殖能力。换而言之,对于单独糖尿病患者,其患病前后的不同的机体状态也会影响基因的表达,但个体本身的基因序列并未发生改变,而此种现象可能与表观遗传有关。DNA甲基化是表观遗传中研究最为广泛的部分,往往基因启动子区的DNA甲基化会抑制基因的表达。考虑到研究单独个体时建模前后的不稳定性,因此,我们选择研究T2DM来源的ASCs同健康大鼠来源ASCs在基因启动子区DNA甲基化水平的差异,寻找差异基因,以明确T2DM机体环境对ASCs成骨能力影响的具体机制。第一部分ASCs-T2DM与ASCs-C对比研究目的:建立T2DM大鼠模型,比较ASCs-T2DM及ASCs-C体外成骨及增殖能力。方法:高脂高糖饲料喂养结合小剂量STZ腹腔注射构建T2DM模型;建模成功后,利用酶消化法提取健康及2型糖尿病大鼠ASCs,培养至P3细胞待用;流式细胞术检测细胞表面分子的表达;克隆形成实验检测克隆形成能力;CCK-8方法检测细胞增殖能力;成骨成脂诱导验证多向分化能力;q-PCR检测成骨相关基因的表达,Western Blot检测成骨相关蛋白的表达。结果:成模后大鼠体重降低,血糖持续维持高于16.7mmol/L;流式检测显示两种细胞均阳性表达干细胞相关的表面标志物（CD29和CD90）,不表达血细胞相关的表面标志物（CD34和CD45）;相比ASCsC,ASCs-T2DM克隆形成能力以及增殖能力显着下降;成脂诱导后染色发现:两种干细胞经诱导均可产生脂滴;成骨诱导碱性磷酸酶（ALP）染色可见:ASCs-T2DM细胞ALP的表达量明显低于ASCs-C;茜素红染色显示:ASCs-T2DM形成的矿化结节较少;q-PCR及Western Blot结果表明,ASCs-T2DM成骨相关基因及相关蛋白表达也低于ASCs-C。结论:ASCs-T2DM增殖能力,克隆形成及成骨分化能力显着低于ASCs-C。第二部分ASCs-T2DM与ASCs-C全基因组DNA甲基化测序及差异基因的筛选目的:筛选ASCs-T2DM与ASCs-C中与成骨相关的启动子区DNA甲基化差异基因。方法:提取ASCs-T2DM与ASCs-C的DNA,做全基因组甲基化测序;选取与成骨相关,并且p值小于0.05的GO term,选出相关基因;结合DNA甲基化及q-PCR结果分析,筛选甲基化水平与基因表达水平成负相关的基因;结合IGV软件和文献阅读,确定目的基因。结果:全基因组甲基化结果显示,两者在DNA甲基化水平上确实存在差异。启动子区甲基化差异基因,共有253个。与成骨相关,并且p值小于0.05的GO term基因有:C3（补体C3,complement C3）,Calca（降钙素基因相关肽,alcitonin-related polypeptide）,Ereg（上皮调节蛋白,epiregulin）,il20rb（白细胞介素20受体亚基,interleukin 20 receptor subunit beta）;其中C3及Calca的表达水平与DNA甲基化水平呈负相关。最终确定差异最为显着基因:Calca。结论:ASCs-T2DM与ASCs-C在启动子区DNA甲基化水平上确实存在差异,其中Calca在ASCs-T2DM中的DNA甲基化水平高于ASCs-C,而其表达水平低于ASCs-C。第三部分CGRP促进ASCs-T2DM成骨分化的功能验证目的:探究体外药物CGRP对ASCs-T2DM的形态、增殖和成骨能力的影响。方法:配制含CGRP不同浓度（10-7mol/L,10-8 mol/L,10-9 mol/L,0 mol/L）的完全培养基及成骨诱导培养基,鬼笔环肽染色检测CGRP对细胞形态的影响;CCK-8检测CGRP对细胞增殖能力的影响;成骨诱导染色后检测不同浓度CGRP对ASCs-T2DM体外成骨能力的影响;q-PCR检测其对ASCs-T2DM成骨相关基因表达的影响。结果:不同浓度CGRP对细胞形态无明显影响;但其可影响糖尿病大鼠ASCs的增殖能力,其中10-7-10-8mmol/L浓度培养基可显着提升其增殖能力;ALP染色显示:在此因子的干预下,ALP的表达量显着升高,且呈浓度依赖;茜素红染色显示,CGRP能促进ASCs-T2DM中钙结节的形成,同样呈浓度依赖;q-PCR结果显示:在CGRP的干预下,成骨相关基因表达显着上升。结论:在一定范围内,Calca基因编码产物CGRP不影响ASCs-T2DM的细胞形态,但能提升其体外成骨分化和增殖能力。第四部分Calca基因DNA甲基化改变的位点及功能验证目的:反向验证ASCs-T2DM中Calca基因启动子区DNA目的片段的甲基化水平与基因表达的关系,并研究其具体机制。方法:用甲基化抑制剂5-氮胞苷对ASCsT2DM进行体外干预,鬼笔环肽染色检测5-氮胞苷对细胞形态的影响;亚硫酸氢盐扩增子测序检测5-氮胞苷对ASCs-T2DM目的片段DNA甲基化水平的影响;q-PCR检测5-氮胞苷干预后ASCs-T2DM中Calca及DNMT1的表达。结果:5-氮胞苷可显着改变ASCs细胞形态;测序结果表明:5-氮胞苷可降低的ASCs-T2DM中Calca基因启动子区目的片段DNA甲基化水平;q-PCR结果显示:5-氮胞苷干预后的ASCs-T2DM中Calca表达量上升,同时甲基化转移酶DNMT1表达量下降。结论:5-氮胞苷可降低ASCs-T2DM中Calca基因的启动子区目的片段DNA甲基化水平,此过程可能是通过降低DNMT1的表达来介导,进而提升Calca基因的表达。
刘洋[4]（2019）在《寒痉汤对寒凝型高血压大鼠CGRP、RLX及血管平滑肌细胞UCP2、RXFP2的影响》文中进行了进一步梳理第一部分寒痉汤对寒凝型高血压大鼠血清降钙素基因相关肽及松弛素的影响目的:研究中药复方寒痉汤对寒凝型高血压大鼠血清中降钙素基因相关肽和松弛素的影响,以探究寒痉汤降低高血压的相关机制。方法:将24只SD大鼠随机分为对照组、模型组、寒痉汤组,适应性饲养一周。一周后模型组、寒痉汤组给予含8%高盐饲料,自由饮水,并且每天置于（-15±2）℃冰箱中。对照组给予正常饲料,自由饮水,置于24℃26℃,饲养。测量大鼠尾动脉血压情况,每周三次。从第七周开始寒痉汤组给予中药灌胃治疗,模型组给予生理盐水灌胃,疗程为两周。用药两周后断头取血,采用放射免疫法对各组实验大鼠血清中降钙素基因相关肽进行检测,采用酶联免疫吸附法对各组实验大鼠血清中松弛素进行检测。结果:1.血清中降钙素基因相关肽CGRP（calcitonin generelated peptide）:与正常组比较,模型组血清中CGRP表达水平降低,差异有统计学意义（P（27）0.05）,与模型组比较,寒痉汤组血清中CGRP表达水平升高,差异有统计学意义（P（27）0.05）。2.血清中松弛素RLX（relaxin）:与正常组比较,模型组血清中RLX降低,差异有统计学意义（P（27）0.05）,与模型组比较,寒痉汤组血清中RLX表达水平升高,差异有统计学意义（P（27）0.05）。结论:1.寒痉汤降压效果可能与升高血清中降钙素基因相关肽水平有关。2.寒痉汤降压效果可能与升高血清中松弛素水平有关。第二部分寒痉汤含药血清对冷刺激大鼠血管平滑肌细胞UCP2、RXFP2的影响目的:通过体外培养SD大鼠血管平滑肌细胞并且给予寒冷刺激,研究中药复方寒痉汤含药血清对冷刺激大鼠平滑肌细胞UCP2、RXFP2的影响,探讨寒痉汤对寒凝型高血压的防治机制,为临床上寒痉汤防治动脉粥样硬化、高血压等相关心血管疾病提供实验依据。方法:选用大鼠血管平滑肌细胞株（A7R5）,传代培养,取4-6代平滑肌细胞进行实验。以冷刺激温度20℃为实验条件分别选择2h、4h、6h、8h为冷刺激时间。采用台盼蓝染色法计数细胞存活率,采用MTT法对实验细胞组进行OD值检测,选择最佳冷刺激时间。选用雄性SD大鼠20只,随机分为五组,各组分别中药灌胃与生理盐水灌胃,制备大鼠中药含药血清,作用于不同组别的平滑肌细胞。将长满皿底的平滑肌细胞随机分为正常组、模型组、寒痉汤组、止痉组、麻辛附组,吸弃原培养基,PBS清洗一遍,加入含药血清:1.正常对照组:DMEM+10%正常大鼠血清;2.模型组:DMEM+10%模型大鼠含药血清3.寒痉汤组:DMEM+10%寒痉汤大鼠含药血清;4.止痉组:DMEM+10%止痉散大鼠含药血清;5.麻辛附组:DMEM+10%麻黄附子细辛汤大鼠含药血清。各组分别加入含10%含药血清细胞培养箱培养24小时。含药血清培养结束后,模型组、寒痉汤组、止痉组、麻辛附组放入20℃温度箱给予冷刺激,正常组置于37℃培养箱培养。采用荧光定量PCR、Western-blotting检测平滑肌细胞中解偶联蛋白2和松弛素受体2的表达。结果:1.细胞冷刺激的温度设定20℃,寒冷刺激的时间在4h存活率降低,4h组与6h组相比较差异有统计学意义,P（27）0.05。2.血管平滑肌细胞解偶联蛋白2蛋白表达,与正常组比较,模型组蛋白表达降低差异有统计学意义,P（27）0.05,与模型组比较,寒痉汤组与麻辛附组、止痉组比较蛋白表达升高,P（27）0.05或0.01。与寒痉汤组比较,止痉组蛋白表达降低,P（27）0.05。血管平滑肌细胞松弛素受体2蛋白表达,与正常组比较,模型组蛋白表达降低,P（27）0.01,与模型组比较,寒痉汤组、麻辛附组和止痉组蛋白表达升高,P（27）0.05或0,01,与寒痉汤组比较,麻辛附组蛋白表达降低,P（27）0.05。3.血管平滑肌细胞解偶联蛋白2基因表达,与正常组比较,模型组基因表达降低,P（27）0.05,与模型组比较,寒痉汤组、麻辛附组基因表达升高,P（27）0.05或0.01,与寒痉汤组比较,止痉组基因表达降低,P（27）0.05。血管平滑肌细胞松弛素受体2基因表达,与正常组比较,模型组基因表达降低,P（27）0.05,与模型组比较,寒痉汤组、麻辛附组和止痉组基因表达升高,P（27）0.05或0.01,与寒痉汤组比较,麻辛附组、止痉组基因表达降低,P（27）0.05。结论:1.寒冷刺激可降低血管平滑肌细胞解偶联蛋白2和松弛素受体2的表达。2.寒痉汤可升高寒冷刺激血管平滑肌细胞解偶联蛋白2和松弛素受体2的表达。3.寒痉汤较其拆方麻黄细辛附子汤、止痉散升高血管平滑肌细胞解偶联蛋白2和松弛素受体2的效果更好。
李鹤,吴丹,蒋维,朱玲[5]（2018）在《垂体中叶素与心血管疾病相关性研究进展》文中研究指明垂体中叶素属于降钙素/降钙素基因相关肽家族,相对于家族成员其结构独特,具有调节心血管功能的多重效应,如扩张冠脉血管、影响血供、加强心肌收缩力、增加肾血流、对心血管疾病有抗损伤保护的作用等。本文将对其在心血管系统中的作用及研究进展进行综述。
涂芳芳[6]（2018）在《降钙素基因相关肽改性丝素蛋白材料的制备及表征》文中指出心血管疾病严重威胁着人类健康,为了解决心血管疾病,有关研究者们对血管移植物开展了大量的研究,但小直径（内径<6mm）血管移植物不能实现理想的通畅性,这主要是由于移植后血栓形成、内膜增生。丝素蛋白（SF）具有优良的生物相容性和良好的物理化学性能,而降钙素基因相关肽可以促进内皮细胞生长并抑制平滑肌细胞增殖,因此,降钙素基因相关肽改性的丝素蛋白材料用于小直径人工血管研究,将有利于促进内皮化和抑制内膜增生,阻止血栓形成,有望实现小直径人工血管的临床应用。本文通过己二酸与丝素蛋白共混并使用乙醇固化处理和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）交联两种方法来制备丝素蛋白膜,然后利用静电吸附作用加载降钙素基因相关肽。探究了己二酸（AA）修饰的丝素蛋白（SF）材料对加载降钙素基因相关肽的影响,希望不采用化学反应的原理将降钙素基因相关肽较稳定的加载于丝素蛋白材料中。乙醇固化的SF/AA共混膜具有良好的热水稳定性。质量比SF:AA=100:1.5时,样品的蛋白溶失率达到最小并稳定。随着SF:AA比例的增加,共混膜材料表面的Zeta电位逐渐减小,从SF:AA=100:0～100:2.5,表面Zeta电位由-19.5mV下降至-27.7mV,表明共混后材料表面带有更多的负电荷。采用傅里叶红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）、X射线光电子能谱（XPS）对乙醇固化的SF/AA共混膜进行了组成和结构分析,FTIR和XRD结果表明己二酸可诱导丝素蛋白分子形成了β折叠结构,XPS结果显示共混后的丝素蛋白材料中引入了新的C=O基团,形成了新的酰胺键。使用EDC对己二酸与丝素蛋白进行交联,材料制备的丝素蛋白共混膜也具有良好的热水稳定性,SF:AA=100:1.5时,丝素蛋白分子达到充分反应。己二酸交联反应后的丝素蛋白水溶液Zeta电位逐渐减小,从SF:AA=100:0～100:2.5,Zeta电位由-2..7mV变为-5.4mV;丝素蛋白共混膜表面的Zeta电位明显也逐渐减小,SF:AA=100:0～100:2.5,表面Zeta电位从-14.3mV下降至-32.6mV,表明己二酸交联改性后丝素蛋白共混膜表面带有更多的负电荷。FTIR和XRD结果说明EDC交联己二酸交联改性丝素蛋白材料同样诱导丝素蛋白分子形成了更稳定的二级结构,主要是明显增加了丝素蛋白的β折叠结构,同时也伴随着少量的α螺旋和β转角。XPS结果显示改性后的丝素蛋白材料引入了新的C=O,-（CH2）4-基团,形成了新的酰胺键。综合热水溶失率、Zeta电位、FTIR、XRD和XPS结果,选择了 EDC交联己二酸交联改性的丝素蛋白样品SF:AA=100:0、SF:AA=100:1和SF:AA=100:2.5加载降钙素基因相关肽。己二酸交联改性丝素蛋白膜上加载降钙素基因相关肽,随着己二酸含量的增多而增多,在SF:AA=100:2.5的改性丝素蛋白膜上加载的降钙素基因相关肽的最大量为500ng/cm2,与己二酸交联改性丝素材料表面Zeta电位结果一致。己二酸交联改性丝素膜（SF:AA=100:2.5）上加载浓度为500ng/cm2的降钙素基因相关肽在三种pH（pH=5,7.4和9）下的释放情况,pH为5时降钙素基因相关肽释放一直较缓慢,而pH为7.4和9,降钙素基因相关肽在12h内释放较缓慢,在12h之后快速且大量释放。不同己二酸比例（SF:AA=100:0、100:1和100:2.5）的己二酸交联改性丝素膜上加载浓度为500ng/cm2的降钙素基因相关肽在pH=7.4的释放情况,SF:AA=100:0的材料在12h内快速释放,SF:AA=100:1和100:2.5的两种材料释放一直较缓慢。
李欣,郑玉云,杨玉梅[7]（2016）在《降钙素基因相关肽对心肌顿抑的影响》文中提出心肌顿抑（MS）是心血管疾病发生、发展过程中的一个重要的环节,其发生机制复杂,存在多种学说,而降钙素基因相关肽（CGRP）由于其强大的心血管作用,必定对心肌顿抑也存在着某种影响,本文讨论了降钙素基因相关肽对心肌顿抑各个机制方面的影响,为心肌顿抑的防治提供新的思路和方法。
张宇[8]（2016）在《降钙素基因相关肽在脊髓损伤后引导间充质干细胞归巢机制的研究》文中指出目的:人脐带来源间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUMSCs）被应用于治疗多种神经系统疾病,包括脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）。然而,引导其在SCI后归巢的关键趋化因子并不明确。降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide,CGRP）在SCI后表达上调并大量释放,本研究旨在探索CGRP引导HUNSCs归巢到脊髓损伤部位的机制。方法:以培养基中添加等量PBS处理的HUMSCs作为对照,体外利用Boyden Chamber和Dunn Chamber装置,检测10-9-10-6 mol/L CGRP对HUMSCs跨膜趋化性迁移的作用。采用CCK-8法,AnnexinV-FITC凋亡实验和免疫荧光染色分别观察CGRP对细胞增殖,存活和分化的影响。免疫印迹法分析PI3K/Akt和MAPK信号通路的在HUMSCs向CGRP趋化性迁移过程中的激活情况。随后,建立大鼠T9脊髓横断和钳夹模型,ELISA技术分析014天内脊髓组织中CGRP的含量变化。SCI建模后第3天腰椎穿刺术移植HUMSCs,同时分别在横断模型损伤处持续注射0.1mol/L PBS,10-6 mol/L CGRP 8-37或10-6 mol/L CGRP,7天后免疫组化染色对细胞在脊髓中的分布情况进行观察计数。结果:不同浓度CGRP均引起HUMSCs发生跨膜趋化性迁移,其中,10-6 mol/L CGRP具有最高的效率（1.81±0.13倍）。动态延时拍摄技术揭示,CGRP的刺激改变了细胞迁移的轨迹和方向（CMI）,指导HUMSCs发生趋向性运动;提高其运动速度和迁移效率（FMI）,可使细胞完成CGRP引发的趋化性迁移。在体外CGRP不影响HUMSCs增殖和凋亡,却可以促进经神经诱导10天的HUMSCs表达MAP2,MBP和Nestin。CGRP导致细胞内Akt和p38MAPK的磷酸化水平增高,而抑制这两条信号通路能够显着降低CGRP引导的细胞趋化性迁移作用。T9损伤后2 h损伤节段中CGRP含量即迅速升高,且在两周内其含量一直维持在较高水平。同钳夹组（19.38±3.7个/层）比较,横断组中HUMSCs表现出归巢倾向（158.1±8.6个/层）。于横断处持续注射PBS,CGRP 8-37和CGRP后,HUMSCs归巢数分别为:158.1±8.6,88.07±6.1,205.3±9.2（个/层）,CGRP 8-37能够显着减少归巢细胞数（P<0.01）。结论:CGRP可以与HUMSCs表面的CGRP受体结合,激活Akt和p38MAPK信号通路从而诱导HUMSCs进行趋化性迁移。脊髓损伤后,CGRP的分泌释放能够引导移植的HUMSCs定位到损伤部位更好地发挥作用。CGRP可以作为一种模式分子用于后续研究,以增加迁移到损伤部位的细胞数量,使治疗性的HUMSCs更好的发挥作用。
刘燕荣[9]（2014）在《双侧肾动脉外科去交感神经术对高糖高脂喂养的新西兰大白兔糖耐量和心脏功能异常的影响及其机制研究》文中研究说明前言:糖尿病发病率逐年上升,这与摄入大量的果糖和脂肪及长时间静坐等不良生活方式有关,表现为胰岛素抵抗和血糖升高,可导致严重的大血管和微血管改变,心肌纤维化和心室扩张,最终出现心力衰竭,即糖尿病心肌病。其中心肌细胞凋亡和自噬是糖尿病心肌病是发生发展的主要机制。新近的研究表明经皮双侧肾动脉去交感神经术在降低顽固性高血压患者血压的同时,可改善患者的胰岛素抵抗、减轻心肌肥厚及改善心脏舒张功能,但有动物实验研究发现交感神经系统激活后给予与高糖高脂喂养,反而可改善小鼠的糖耐量及代谢综合征,提示交感神经调控对胰岛素抵抗的作用依赖于喂养方式的不同。由此可见,交感神经、胰岛素抵抗及高糖高脂喂养三者之间的关系十分复杂,亟待进一步的研究来阐明。目的:本研究目的在于观察双侧肾动脉外科去交感神经术对持续高糖高脂喂养的新西兰大白兔的糖耐量、心脏结构和功能的改变,并初步研究其变化的机制。方法:采用高糖、高脂肪饲料（30%白蔗糖,10%猪油）混合60%的基础饲料喂养新西兰大白兔,48周后将动物随机分为四组,正常饮食对照组（Chow,n=8）、假手术组（Sham,n=8）、双侧肾动脉外科去交感神经术组（RDN,n=8）和未手术组（HFD,n=8）,除正常饮食组外,其余三组均继续给予高糖高脂喂养（成分同前）8周。RDN组暴露双侧肾动脉,仔细剥离并破坏双侧肾动脉周围的神经,分离出肾交感神经主干,予以两侧结扎后剪断,再用95%的无水酒精擦拭肾动脉周围以达到尽可能多的神经破坏。分别在术后4周和8周行静脉葡萄糖耐量试验,术后8周行经胸心脏超声检查,并处死动物取得心脏标本,采用神经烯醇化酶（NSE）及酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase）染色观察交感神经术后肾动脉周围交感神经的变化,行心肌H&E染色观察心肌细胞大小、Masson三色染色观察心肌纤维化、TUNEL染色观察心肌细胞凋亡及透视电子显微镜观察心肌细胞自噬现象。ELLISA法检测去交感神经术前及术后8周的血清去甲肾上腺素、肾上腺素及降钙素相关基因肽水平,然后用RT-PCR检测心肌B型脑利钠肽（B-type natriuretic Peptide,BNP）、血清Ⅲ型前胶原肽（Procollagen—Ⅲ-peptide,PⅢP）mRNA及骨骼肌葡萄糖转运体4（glucose transport-4,GLUT4）mRNA的表达情况,采用Western blotting法检测骨骼肌细胞膜和细胞质的GLUT4蛋白及Akt 473位点的磷酸化水平,同时检测Beclin-1和LC3B Ⅱ/Ⅰ比值观察心肌自噬及肾脏降钙素相关基因肽的表达情况。结果:本研究发现:（1）高糖高脂喂养56周后新西兰大白兔出现显着的胰岛素抵抗、心肌细胞肥大、心肌间质纤维化、心肌细胞凋亡及左心室舒张功能减退等糖尿病心肌病的特征,（2）术后8周,RDN组动物肾动脉周围组织内的NSE染色阳性颗粒及酪氨酸羟化酶阳性颗粒显着减少,证实RDN手术成功,（3）与HFD组相比,RDN组术后8周时血清去甲肾素上腺素（Noradrenaline,0.61±0.06 ng/ml vs 0.89±0.07 ng/ml,P=0.001）及降钙素相关基因肽（Calcitonin Gene-Related peptide,0.67±0.08 ng/ml vs 0.82±0.10 ng/ml,P=0.002）明显下降,而血清肾上腺素水平却明显增加（Epienphrine,0.87±0.11 vs 0.76±0.10 ng/ml,P=0.01）,（4）RDN组术后4周（2692.88±225.40 vs 2268.38±202.99mg/dl/min,P=0.005）和8周时（2662.87±255.08 VS 2266.68±182.40mg/dl/min,P=0.002）的静脉葡萄糖耐量实验曲线下面积高于HFD组,（5）与HFD组相比,RDN组术后8周时心脏舒张功能显着改善,表现为室间隔舒张末期厚度（IVDd,3.28±0.28 mm vs 5.48±0.34 mm,P=0.000）及E/E’（4.31±0.18 vs 6.899±0.76,P=0.000）值均明显降低,E/A 比值明显升高（0.96±0.13 vs 0.58±0.06,P=0.000）,同时RDN组心肌细胞肥大、心肌纤维化及心肌细胞凋亡显着减轻,而心肌细胞自噬增强,（6）RT-PCR证实RDN组心肌组织内的BNP及Procollagen Ⅲ的mRNA表达量下降,骨骼肌内GLUT4 mRNA表达量也显着减少,（7）Western Blotting证实RDN组的心肌细胞mTOR表达下降,而心肌细胞的Beclin-1和LC3B Ⅱ/Ⅰ的表达水平增加,骨骼肌细胞的Akt 473位点磷酸化水平降低,GLUT4转膜减少,肾脏的降钙素基因相关肽的表达水平明显降低。而Sham和HFD组的上述研究指标之间的差异无统计学意义。结论:高糖高脂喂养56周可导致新西兰大白兔血糖升高、胰岛素抵抗及形成糖尿病心肌病。双侧肾动脉外科去交感神经术后继续给予高糖高脂喂养反而加重胰岛素抵抗,但去肾动脉交感神经术仍可通过减少心肌细胞的凋亡和增强心肌细胞自噬而表现出心脏保护作用。
李洪丽[10]（2010）在《鲑鱼降钙素与降钙素基因相关肽基因原核表达的研究》文中提出目前,随着我国进入老龄化社会,骨质疏松症和心血管疾病等严重威胁着人类的健康,给老年人的生活带来了严重的影响。鲑鱼降钙素（Salmon Calcitonin,sCT）是天然降钙素中活性最高的一种,对于治疗骨质疏松症有着很好的疗效。降钙素基因相关肽（Calcitonin Gene Related Peptide, CGRP）是迄今为止发现的最强大的内源性扩血管肽类物质,是治疗心血管疾病的首选药物之一。临床上为了治疗骨质疏松症、心血管疾病等老年人常见疾病,对鲑鱼降钙素和降钙素基因相关肽的需要与日俱增,因此,能够获得一种双效的药用蛋白成为了人们日益关注的问题。本实验利用基因工程的方法设计并合成了鲑鱼降钙素和降钙素基因相关肽融合基因,将该基因克隆到pGEX-6p-1表达载体上,并且,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中进行表达。利用IPTG作为诱导剂,分析比较不同诱导温度,不同诱导时间和不同IPTG终浓度条件对蛋白表达量的影响,从而确定最佳诱导表达条件。结果表明,成功构建了大肠杆菌表达载体pGEX（CGRP/msCT）。目的蛋白的最佳诱导温度为37℃,最佳IPTG终浓度为0.2mmol/L,最佳诱导时间为5小时,目的蛋白的表达量最高可达到菌体总蛋白的32.11%。
二、降钙素基因相关肽与心血管疾病（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、降钙素基因相关肽与心血管疾病（论文提纲范文）
（1）降钙素基因相关肽（CGRP）通过调控Akt/mTOR信号通路介导的凋亡和自噬减轻创伤性颅脑损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 创伤性颅脑损伤患者血清CGRP水平及与预后的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 降钙素基因相关肽(CGRP)对创伤性颅脑损伤模型小鼠的神经功能保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 降钙素基因相关肽(CGRP)对创伤性颅脑损伤后神经元细胞自噬和凋亡的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 AKT/mTOR信号通路参与了外源性CGRP对神经元细胞自噬和凋亡的调控 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 自噬和凋亡在颅脑创伤治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 降钙素基因相关肽CGRP在神经系统疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）rAAV9介导的CGRP基因对自发性高血压大鼠血压、左心室纤维化、肾脏损伤的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 各组大鼠收缩压比较 |
| 3.2 各组大鼠血浆中CGRP浓度的比较 |
| 3.3 大鼠收缩压与血浆CGRP浓度的相关性 |
| 3.4 各组大鼠左心室重量指数比较 |
| 3.5 各组大鼠左心室心肌CGRP表达 |
| 3.6 各组左心室心肌胶原纤维比较 |
| 3.7 各组大鼠尿微量白蛋白浓度的比较 |
| 3.8 各组大鼠肾脏组织病理观察 |
| 3.9 各组大鼠存活状态 |
| 4 结论 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（3）Calca基因启动子区DNA甲基化影响2型糖尿病大鼠ASCs成骨功能的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1.2型糖尿病影响种植修复的原因 |
| 1.1 异常代谢水平 |
| 1.2 氧化应激 |
| 1.3 血管病变 |
| 1.4 成骨异常 |
| 1.5 改善措施 |
| 2.脂肪干细胞的应用前景 |
| 2.1 细胞膜片技术 |
| 2.2 Sema3A分子 |
| 3.DNA甲基化的影响 |
| 3.1 DNA甲基化原理 |
| 3.2 DNA甲基化抑制基因转录的机制 |
| 3.3 DNA甲基化与T2DM的关系 |
| 4.降钙素基因相关肽的生理作用 |
| 4.1 降钙素基因相关肽简介 |
| 4.2 α-CGRP分子的功能 |
| 第一部分 ASCs-T2DM与 ASCs-C对比研究 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验试剂与材料 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 实验动物及饲料配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立 |
| 2.2 ASCs提取、分离与培养 |
| 2.3 细胞表面标志物的检测 |
| 2.4 细胞克隆形成率测定 |
| 2.5 细胞生长曲线检测 |
| 2.6 多向分化能力检测 |
| 2.7 qPCR检测成骨相关基因表达 |
| 2.8 Western Blot检测成骨相关蛋白表达 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 2型糖尿病大鼠模型 |
| 3.2 细胞形态观察 |
| 3.3 细胞表面标志鉴定 |
| 3.4 克隆形成率 |
| 3.5 细胞生长曲线测定 |
| 3.6 多向分化能力 |
| 3.7 qPCR结果 |
| 3.8 Western Blot结果 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 ASCs-T2DM与 ASCs-C全基因组DNA甲基化测序及差异基因的筛选 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验试剂与材料 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 实验动物 |
| 2.方法 |
| 2.1 ASCs-T2DM及 ASCs-C培养 |
| 2.2 ASCs DNA的提取 |
| 2.3 样本全基因组DNA的甲基化测序及结果分析 |
| 2.4 DNA启动子区差异化基因的筛选 |
| 2.5 差异基因的表达对比及最终基因筛选 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 细胞形态观察 |
| 3.2 DNA提取结果 |
| 3.3 样本全基因组DNA的甲基化测序结果 |
| 3.4 IGV软件DNA启动子区差异化基因的筛选 |
| 3.5 差异基因的表达对比及最终基因筛选 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 CGRP促进ASCs-T2DM成骨分化的功能验证 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验试剂与材料 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 实验动物 |
| 2.方法 |
| 2.1 ASCs-T2DM培养 |
| 2.2 不同浓度CGRP对 ASCs-T2DM形态的影响 |
| 2.3 不同浓度CGRP对 ASCs-T2DM成骨功能的影响 |
| 2.4 不同浓度CGRP对 ASCs-T2DM成骨相关基因表达的影响 |
| 2.5 不同浓度CGRP对 ASCs-T2DM增殖能力的影响 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 不同浓度CGRP对 ASCs-T2DM形态的影响 |
| 3.2 不同浓度CGRP对 ASCs-T2DM成骨染色的影响 |
| 3.3 不同浓度CGRP对 ASCs-T2DM成骨相关基因表达的影响 |
| 3.4 不同浓度CGRP对 ASCs-T2DM增殖能力的影响 |
| 4.讨论 |
| 第四部分 Calca基因启动子区DNA甲基化改变的位点及功能验证 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验试剂与材料 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 实验动物 |
| 2.方法 |
| 2.1 ASCs-T2DM培养 |
| 2.2 甲基化抑制剂对ASCs-T2DM形态的影响 |
| 2.3 亚硫酸氢盐扩增子测序 |
| 2.4 q-PCR检测Calca及 DNMT1 的表达 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 ASCs-T2DM形态观察 |
| 3.2 亚硫酸氢盐扩增子测序验证 |
| 3.3 q-PCR检测相关基因表达及机制探讨 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（4）寒痉汤对寒凝型高血压大鼠CGRP、RLX及血管平滑肌细胞UCP2、RXFP2的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 寒痉汤对寒凝型高血压大鼠血清降钙素基因相关肽及松弛素的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 寒痉汤含药血清对冷刺激大鼠血管平滑肌细胞UCP2、RXFP2 的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 松弛素及其受体对心血管的研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 高血压病的中医特色理论及药理研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）垂体中叶素与心血管疾病相关性研究进展（论文提纲范文）
| 1 IMD的生物学特征及结构 |
| 2 IMD对心血管系统的作用 |
| 2.1 IMD对心率的影响 |
| 2.2 IMD对心肌收缩功能的影响 |
| 2.3 IMD对冠脉血流的影响 |
| 2.4 IMD对血压的影响 |
| 2.5 IMD与心脏重塑 |
| 2.6 IMD与血管通透性 |
| 2.7 IMD与血管新生 |
| 3 IMD对心血管系统疾病的影响 |
| 3.1 IMD与血管钙化 |
| 3.2 IMD与高血压疾病 |
| 3.3 IMD与心力衰竭 |
| 4 展望 |
（6）降钙素基因相关肽改性丝素蛋白材料的制备及表征（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 人工血管研究背景 |
| 1.2 合成高分子材料小直径人工血管 |
| 1.3 天然高分子材料小直径人工血管 |
| 1.4 小直径人工血管的抗凝血研究 |
| 1.5 降钙素基因相关肽及与血管细胞相关的应用 |
| 1.5.1 降钙素基因相关肽 |
| 1.5.2 降钙素基因相关肽对血管平滑肌细胞的作用 |
| 1.5.3 降钙素基因相关肽对血管内皮细胞的作用 |
| 1.6 本文研究的目的和内容 |
| 第二章 乙醇诱导固化丝素蛋白/己二酸共混膜的制备与表征 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料和试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果和讨论 |
| 2.2.1 乙醇诱导固化SF/AA共混膜热水溶失率 |
| 2.2.2 乙醇诱导固化SF/AA共混膜的表面Zeta电位 |
| 2.2.3 乙醇诱导固化SF/AA共混膜的FTIR光谱分析 |
| 2.2.4 乙醇诱导固化SF/AA共混膜的XRD分析 |
| 2.2.5 乙醇诱导固化SF/AA共混膜XPS分析 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 己二酸交联改性丝素蛋白膜的制备与表征 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料和试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 己二酸与丝素蛋白的反应机理 |
| 3.2.2 己二酸交联改性丝素蛋白水溶液Zeta电位 |
| 3.2.3 己二酸交联改性丝素蛋白共混丝素蛋白膜的热水溶失率 |
| 3.2.4 己二酸交联改性丝素蛋白膜的表面Zeta电位 |
| 3.2.5 己二酸交联改性丝素蛋白膜的FTIR光谱分析 |
| 3.2.6 己二酸交联改性丝素蛋白膜的XRD分析 |
| 3.2.7 己二酸交联改性丝素蛋白膜的XPS分析 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 己二酸交联改性丝素膜加载降钙素基因相关肽 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 CGRP改性丝素蛋白膜的设计示意图 |
| 4.2.2 己二酸交联改性丝素蛋白膜上CGRP加载效率分析结果(ELISA测定) |
| 4.2.3 己二酸交联改性丝素蛋白膜表面电负性对CGRP加载能力的影响 |
| 4.2.4 己二酸交联改性丝素蛋白膜上加载CGRP在不同pH下的释放 |
| 4.2.5 不同比例AA交联改性SF膜上加载CGRP在pH=7.4下的释放 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 结语 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 本文的不足之处 |
| 5.3 今后的工作 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人公开发表的论文 |
| 致谢 |
（7）降钙素基因相关肽对心肌顿抑的影响（论文提纲范文）
| 1 MS的定义和发生机制 |
| 2 CGRP的概念 |
| 3 CGRP对MS的影响 |
| 3.1 对钙学说的影响 |
| 3.2 对氧自由基学说的影响 |
| 3.3 对能量代谢学说的影响 |
| 3.4 对微血管学说的影响 |
| 3.5 对基因层面的影响 |
| 4 结语 |
（8）降钙素基因相关肽在脊髓损伤后引导间充质干细胞归巢机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 序言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表及待发表的论文 |
| 主要词汇中英文缩写表 |
| 本课题所获基金资助 |
| 致谢 |
（9）双侧肾动脉外科去交感神经术对高糖高脂喂养的新西兰大白兔糖耐量和心脏功能异常的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料及方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 糖尿病及糖尿病心肌病的分子生物学机制及治疗研究进展(综述) |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（10）鲑鱼降钙素与降钙素基因相关肽基因原核表达的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 降钙素的概述 |
| 1.1.1 骨质疏松病症的介绍 |
| 1.1.2 降钙素的结构 |
| 1.1.3 降钙素的生理特性 |
| 1.1.4 降钙素的研究现状 |
| 1.1.5 鲑鱼降钙素对骨质疏松病症的治疗 |
| 1.2 降钙素基因相关肽的概述 |
| 1.2.1 心血管疾病的介绍 |
| 1.2.2 降钙素基因相关肽的结构与分布 |
| 1.2.3 降钙素基因相关肽的特性 |
| 1.2.4 降钙素基因相关肽的研究现状 |
| 1.2.5 降钙素基因相关肽对高血压病症的治疗 |
| 1.3 基因表达系统的概述 |
| 1.3.1 原核表达系统 |
| 1.3.2 真核表达系统 |
| 1.4 融合基因的概述 |
| 1.4.1 融合基因技术的简介 |
| 1.4.2 融合基因的表达 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌种和克隆载体 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试剂及培养基的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因的分子设计及获取 |
| 2.2.2 菌种活化 |
| 2.2.3 质粒的提取 |
| 2.2.4 表达载体的构建 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态的制备及转化 |
| 2.2.6 重组质粒的初步筛选与基因测序 |
| 2.2.7 转化菌株的诱导表达 |
| 2.2.8 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 2.2.9 数据分析 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 大肠杆菌载体构建的初筛与测序结果 |
| 3.1.1 pUC(CGRP/msCT)载体双酶切 |
| 3.1.2 pGEX-6p-1载体双酶切 |
| 3.1.3 pGEX-6p-1载体的Kpn Ⅰ酶切位点验证 |
| 3.1.4 重组质粒的筛选 |
| 3.1.5 重组质粒的序列测定 |
| 3.1.6 重组质粒的序列比对 |
| 3.2 菌株的诱导表达条件的优化 |
| 3.2.1 不同诱导温度、时间、IPTG终浓度对蛋白表达量的影响 |
| 3.2.2 最适诱导温度、时间、IPTG终浓度的确定 |
| 第4章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
四、降钙素基因相关肽与心血管疾病（论文参考文献）
- [1]降钙素基因相关肽（CGRP）通过调控Akt/mTOR信号通路介导的凋亡和自噬减轻创伤性颅脑损伤的实验研究[D]. 田军. 河北医科大学, 2021(02)
- [2]rAAV9介导的CGRP基因对自发性高血压大鼠血压、左心室纤维化、肾脏损伤的影响[D]. 雷蕾. 湖南师范大学, 2020(01)
- [3]Calca基因启动子区DNA甲基化影响2型糖尿病大鼠ASCs成骨功能的研究[D]. 王蕾. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [4]寒痉汤对寒凝型高血压大鼠CGRP、RLX及血管平滑肌细胞UCP2、RXFP2的影响[D]. 刘洋. 河北中医学院, 2019(01)
- [5]垂体中叶素与心血管疾病相关性研究进展[J]. 李鹤,吴丹,蒋维,朱玲. 四川生理科学杂志, 2018(03)
- [6]降钙素基因相关肽改性丝素蛋白材料的制备及表征[D]. 涂芳芳. 苏州大学, 2018(12)
- [7]降钙素基因相关肽对心肌顿抑的影响[J]. 李欣,郑玉云,杨玉梅. 陕西医学杂志, 2016(10)
- [8]降钙素基因相关肽在脊髓损伤后引导间充质干细胞归巢机制的研究[D]. 张宇. 苏州大学, 2016(01)
- [9]双侧肾动脉外科去交感神经术对高糖高脂喂养的新西兰大白兔糖耐量和心脏功能异常的影响及其机制研究[D]. 刘燕荣. 南京医科大学, 2014(05)
- [10]鲑鱼降钙素与降钙素基因相关肽基因原核表达的研究[D]. 李洪丽. 黑龙江大学, 2010(11)