一、人源性乙型肝炎表面抗体Fab段的表达及纯化的研究（论文文献综述）
武喆[1]（2020）在《柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的乙型肝炎病毒（HBV）感染是严重的全球公共卫生问题,目前全球慢性HBV感染者约有2.4亿例,其中我国有约有8600万例。慢性乙型病毒性肝炎（CHB）、HBV感染相关肝硬化及HBV感染相关肝细胞性肝癌每年可导致全球超过80万人死亡,对社会造成极大的负担。目前用于治疗HBV感染的一线药物核苷（酸）类似物不能清除被感染肝细胞细胞核内的cccDNA,难以实现CHB的临床治愈,新型抗HBV药物亟需研发。柳胺酚是一种核糖核苷酸还原酶（RR）抑制剂,可以抑制细胞内核糖核苷酸（DNA）的生成,从而减少HBV的复制原料。研究发现柳胺酚对HBV复制及cccDNA形成具有强大的抑制作用,但其体内代谢过程仍不明确,生物学转化及代谢过程可能通过改变药物分子结构形成具有更强药理活性或毒性的代谢产物。本文拟对柳胺酚的代谢产物进行鉴定,并对柳胺酚代谢产物抗HBV活性进行分析,进而对活性代谢物抗HBV机制进行研究。方法1.通过超高效液相色谱串联飞行时间质谱（UPLC-QTOF/MS）鉴定柳胺酚在Sprague Dawley大鼠的体内药物代谢模型和人肝微粒体的体外药物代谢模型中的代谢产物,使用UNIFI软件对柳胺酚的体内代谢通路进行分析。进一步利用重组人肝脏药物代谢酶筛选系统明确参与柳胺酚代谢过程的肝脏药物代谢酶亚型。2.使用计算机虚拟分子对接技术计算柳胺酚代谢产物与RRM2活性位点之间的亲和力,筛选具有RRM2抑制活性的代谢物。使用HBV稳定复制细胞模型HepG2.2.15细胞系以及HBV核苷类似物交叉耐药细胞模型HepG2.A64细胞系验证筛选得到的柳胺酚代谢产物对细胞培养基上清中HBVDNA、HBsAg、HBeAg以及细胞内HBVDNA、cccDNA的抑制活性。通过细胞增殖活性实验及细胞凋亡实验明确具有抗HBV活性的柳胺酚代谢物LAF-OH的细胞毒性。进一步通过联合用药实验,使用ComboSyn软件计算LAF-OH与核苷（酸）类似物的联合用药指数。3.利用蛋白组学筛选LAF-OH作用后表达水平发生改变的差异蛋白并分析差异蛋白参与的生物学过程与抗HBV活性的关系。通过qPCR法、Western Blot法对差异蛋白表达水平进行验证并分析相关蛋白在mRNA及蛋白质水平表达变化对HBV复制的影响。通过流式细胞术测定LAF-OH对细胞周期比例的调节作用。通过ELISA法分析相关蛋白表达水平变化对RR活性的影响。结果1.分别收集SD大鼠经柳胺酚灌胃后在0-3h、3-8h、8-12h及12-24h时间段内的胆汁、粪便、血浆及尿液样本,在0-3h及3-8h收集的胆汁样品中鉴定到6个柳胺酚代谢产物（M1-M6）;在8-12h收集到胆汁样品中鉴定到2个柳胺酚代谢产物（M1、M2）;在0-3h及3-8h收集的粪便样品中鉴定到3个柳胺酚代谢产物（M1、M3和M6）;在其余时间段收集的胆汁、粪便及全部的血浆、尿液样本中未鉴定到柳胺酚的代谢产物。在与人肝微粒体孵育的柳胺酚样本中鉴定到5个柳胺酚代谢产物（M1、M7-M10）。柳胺酚主要的代谢过程包括羟基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化和代谢性降解等。重组人肝药物代谢酶筛选结果表明CYP1A2与CYP2C9参与了柳胺酚的Ⅰ相代谢反应;UGTIA1、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7与UGT2B15参与了柳胺酚的Ⅱ相代谢反应。2.计算机分子对接拟合结果表明柳胺酚葡萄糖醛酸化代谢产物M8、M10以及柳胺酚羟基化代谢产物LAF-OH与RRM2活性位点的亲和力较柳胺酚更强。基于HepG2.2.15细胞及HepG2.A64细胞的HBV抑制实验发现LAF-OH对HBV的抑制活性较柳胺酚更强且成时间与剂量依赖性,可以显着降低野生型HBV及耐药突变HBV模型细胞培养上清中HBV-DNA、HBsAg以及细胞内HBV-DNA、cccDNA的水平。细胞增殖活性及细胞凋亡实验发现LAF-OH在HepG2.2.15细胞、HepG2.A64细胞、HepG2细胞与HEK293细胞中半数细胞增殖抑制剂量IC50 分别为 173.4μM、366.7μM、222.3μM 与 191.8μM,在 150μM 浓度时未对细胞凋亡造成明显影响。联合药效试验结果表明LAF-OH与拉米夫定、恩替卡韦联合抗HBV具有协同效应;LAF-OH与阿德福韦、替诺福韦联合抗HBV具有相加效应。3.蛋白组学筛选发现LAF-OH处理后细胞细胞周期、IL-17信号通路及PPAR信号通路相关蛋白表达水平显着降低。Western Blot分析发现LAF-OH可以通过抑制Akt磷酸化水平降低cyclin D1的表达水平。细胞周期分析结果表明经LAF-OH处理后S期细胞比例明显下降。进一步通过qPCR及Western Blot分析发现LAF-OH可在不引起RRM2B表达代偿性上调的同时显着抑制RRM2蛋白表达水平下降。RR活性分析发现LAF-OH可通过同时抑制RRM2活性与表达水平的方式显着抑制RR活性。结论1.柳胺酚在体内主要通过羟基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化及代谢性降解等途径代谢。CYP1A2、CYP2C9、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7与UGT2B15是柳胺酚主要的肝脏代谢酶亚型。2.LAF-OH与RRM2活性位点具有较高的亲和力,其抗HBV活性较柳胺酚更高。LAF-OH在显着降低细胞培养基上清HBV-DNA、HBsAg与细胞内HBV-DNA、cccDNA水平的同时不产生明显的细胞毒性,具有良好的安全性。此外,LAF-OH对核苷类似物耐药HBV仍具有强大的抑制活性。LAF-OH在与核苷（酸）类似物联合使用时表现出相加效应或协同效应。3.LAF-OH通过降低Akt磷酸化水平而下调cyclin D1的表达水平,改善因HBV感染造成的细胞周期紊乱,以降低S期细胞比例的方式下调RRM2的表达水平,同时不使RRM2B表达水平代偿性增高。LAF-OH在下调RRM2表达水平的同时与RRM2活性位点竞争性结合,从而大幅抑制RR活性,发挥抗HBV作用。LAF-OH可通过调节IL-17介导的免疫学反应以及PPAR、Akt等信号通路为HBV治疗带来更多潜在获益。
温灿[2]（2019）在《高效持久清除乙肝病毒的新型抗体研究》文中研究说明单克隆抗体因其与抗原结合具有高度特异性与强亲和力,已成为抗体药物研发的主要类型。但随着研究的深入,它的诸多缺陷如与抗原结合次数有限、带来非预期的抗体清除效应和抗原累积效应等缺陷也浮出水面。研究热点不再局限于天然抗体的筛选,而是通过改造提升抗体药物的药效。利用基因工程改造以提高抗体与抗原的结合次数,延长抗体半衰期是近年来研究的重点。本研究拟通过对两株抗HBV抗体进行pH依赖抗原结合和Fc的双重改造,获得能够延长体内半衰期的清道夫抗体。主要研究内容包括以下四部分:第一,pH依赖抗原结合改造抗体库的构建、筛选与检测。本研究综合三维结构模拟及合理库容的考虑,最终确定了24或26个组氨酸突变位点。利用噬菌体展示构建了氨基酸组合突变噬菌体抗体库,经过3或4轮筛选获得共5株可变区改造抗体。在pH 7.4时,这5株噬菌体抗体能保持与亲本相当的强抗原结合活性,在pH 6.0时则与抗原呈现弱结合的特点。第二,抗体的表达、纯化和功能评估。构建真核表达载体,在FreeStyleTM 293F细胞中表达5株改造抗体并纯化,进行性质鉴定及功能评估。5株抗体仍能保持中性环境下与亲本相当的抗原结合活性,但酸性环境下与抗原弱结合。利用HBV转基因鼠,对pH依赖抗原结合改造抗体进行体内效果评估。pH依赖抗原结合变体在保持与亲本相当抗原清除效果的同时,较亲本有0.5倍动物体内抗原抑制作用时间的延长。第三,清道夫抗体的构建及细胞水平的功能评估。1)将两株HBV清除效果好的pH改造改造变体进行Fc区段的改造,即V4突变（M252Y、N286E、N434Y,加强中性条件下与hFcRn亲和力）。利用稳定表达带EGFP的hFcRn的MDCK细胞株进行体外细胞吞噬效果评估,结果和亲本抗体相比,带有V4改造的清道夫抗体能显着促进MDCK细胞吞噬HBsAg。2)将一株pH依赖抗原结合改造抗体进行Fc区段的改造,即DY突变（K326D、D328Y,加强中性条件下与mFcγRⅡ亲和力）,利用 THP-1和鼠原代巨噬细胞进行体外细胞吞噬效果评估。带有DY改造的清道夫抗体较亲本可以明显促进两种巨噬细胞吞噬HBsAg。第四,清道夫抗体在动物模型中的功能评估。利用HBV腺相关病毒感染稳定表达hFcRn的转基因小鼠,HBV转基因鼠,评估清道夫抗体的功能。结果显示带V4突变的清道夫抗体具有与亲本抗体相同的抗原清除效果,同时具有更长的抑制时间（约1倍以上的延长）。带DY突变的清道夫抗体在抗原清除能力上比亲本抗体强一个数量级以上且有12 d抗原抑制时间的延长。总之,本研究获得的清道夫抗体较亲本抗体有显着加强了抗原清除效率和延长了抗原抑制时间,具有成为HBV二代治疗性抗体的潜力,对慢乙肝的治疗具有深远的影响。
袁伦志[3]（2019）在《人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究》文中认为乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染在全球范围内造成了严重的疾病负担。HBV感染具有严格的宿主种属特异性和肝细胞嗜性,其感染人肝细胞后能够持续复制,诱发宿主免疫耐受状态、逐步形成慢性化、直接或间接诱导一系列病理生理学变化并造成重症肝炎、肝衰竭、肝纤维化、肝硬化和肝癌等终末期肝脏疾病。目前,虽然预防性疫苗的普及已经在很大程度上控制HBV新发感染率,但是已批准上市的临床药物仍然无法彻底清除病毒,实现功能性治愈。由于HBV的天然宿主人类和猩猩等大型灵长类动物用于研究收到严格的伦理限制,因此发展能够最大限度模拟HBV感染和发病的动物模型成为进一步认识HBV感染发病机制,以及研发和评价新一代抗HBV药物所面临的一项挑战。数十年来,研究人员建立了转基因小鼠、尾静脉高压注射小鼠、旱獭、北京鸭和树鼩等替代模型,然而它们都不能完全模拟HBV在人类中感染发病的自然史,因此,建立人源化小鼠动物模型,特别是人肝和人免疫系统双嵌合的人源化小鼠动物模型,用于支持HBV感染发病相关研究具有相当的重要性。然而,目前已有的人源化小鼠动物模型一直存在原代人细胞来源匮乏和体外难以扩增、个体差异大、多种细胞移植不匹配、伦理问题、造模周期长、实验窗口期短和难以模拟HBV感染相关的终末期肝脏疾病等限制。因此,建立一种方便易用的、能够支持HBV感染发病研究的新型人源化小鼠动物模型对于进一步推进HBV相关基础研究和治疗策略的发展十分必要。本论文中,我们利用临床分离的健康人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs）在免疫缺陷小鼠体内同时重建了同源的人源肝脏和免疫系统,并将此种双嵌合人源化小鼠用于乙肝病毒感染及相关病理生理学研究。我们对乙肝病毒的生物学特征、流行病学、感染自然史、相关肝脏疾病、天然宿主动物、感染细胞和动物模型等方面进行综述研究,基于前期研究和对最新研究成果的考察,我们发现hBMSCs具有重建人类肝脏和免疫系统的巨大的潜力,并选择其作为我们构建新型双嵌合人源化小鼠模型的细胞材料。我们使用hBMSCs移植暴发性肝衰竭免疫缺陷FRGS小鼠,发现其能够在小鼠体内迅速转分化为具有活性的人肝细胞和多种人免疫细胞,同时证明暴发性肝衰竭的肝脏微环境是驱动hBMSCs在免疫缺陷FRGS小鼠体内大量快速转分化为人源肝细胞和免疫细胞的重要驱动因素。我们在hBMSCs移植的免疫缺陷FRGS小鼠（hBMSC-FRGS）体内建立了HBV慢性感染,实现A,B,C,D四种常见HBV基因型病毒感染超过50周。我们连续监测了 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内病毒DNA及蛋白水平,证明被HBV感染的小鼠血清内含有具备感染活力的HBV病毒颗粒。我们初步研究了HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内的免疫病理生理学变化,在感染进行和持续和过程中同步分析了小鼠肝内人源免疫细胞、人源细胞因子、肝脏炎症进展和HBV特异性人源抗体水平等指标,证明HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠出现持续的肝脏炎症和免疫耐受状态。我们在HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内观察到一系列的指示肝硬化发生发展的典型性指标,包括:肝硬化血清学指标持续增高、小鼠肝脏组织中肝硬化相关人源基因表达持续上调、小鼠肝脏组织中胶原纤维堆积持续增加、纤维结节生成、肝小叶结构被破环、肝板塌陷、肝脏外表粗糙体积固缩等。综上所述,我们建立了肝脏和免疫系统双重人源化的hBMSC-FRGS小鼠模型,将其用于HBV感染和相关免疫病理生理学研究,并通过长期观察发现HBV感染后小鼠产生肝脏炎症并且逐步发展为典型的肝硬化。
郑金伟[4]（2019）在《MAPK抑制剂增强体外HBV感染作用和机制的初步探索》文中研究表明乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的慢性感染仍是危害人类健康的公共卫生问题之一,尽管预防性疫苗的普及显着减少了乙型肝炎病毒新发感染,但目前全球仍有超过2.57亿慢性HBV感染者需要及时有效的治疗。由于目前现有的治疗策略只能控制病毒的复制而难以完全治愈慢乙肝,因此开发更为有效的新型药物是迫切而必要的。新药的研发有赖于对HBV生物学和HBV与宿主相互作用的深入认识,这些研究的实施都需要能模拟HBV完整生命周期的体外细胞模型和体内动物模型的构建和发展。其中细胞模型是最常用且方便的用于体外研究HBV的感染和复制、HBV与宿主之间的相互作用、筛选和评价抗HBV药物的重要平台。本团队之前构建了两株细胞模型:HepG2-N10和HepG2-hNTCP（2B1）。其中HepG2-N10是在HepG2细胞中稳定整合了1.1倍体A基因型的HBV基因组,可以支持HBV复制和用于药物筛选和评价。另外HepG2-hNTCP（2B1）可以支持HBV感染和cccDNA形成,但是感染所需病毒剂量高且感染阳性率低,仅为20%～30%,同时感染时依赖PEG。本研究对MAPK抑制剂库进行筛选,旨在优化HepG2-hNTCP细胞感染模型,提高其感染效率和摆脱PEG的约束。同时寻找限制鼠肝细胞不能支持HBV感染的因子,进而构建支持HBV感染且免疫功能健全的小鼠模型。本研究同时在复制模型HepG2-N10和感染模型HepG2-hNTCP上对140种MAPK抑制剂进行筛选,结果发现两种模型得到的结果差异显着。同时进行抗原水平相关性分析没有发现两种模型得到的结果有明显相关性。感染模型可以支持HBV感染,其病毒以类似自然感染状态进行复制,更符合HBV的生理。因此,可以说明复制模型用于药物筛选和评价的结果需要进一步验证。本研究在2B1细胞模型中对140种MAPK抑制剂进行初步筛选,结果发现了30种MAPK抑制剂在感染后第六天加药处理能够增强HBV复制。进一步分析这30种MAPK抑制剂在感染前加入并持续添加对HBV感染的影响,结果显示有12种促进HBV感染效果显着。同时仅在感染前处理24小时,发现SCH772984,Trametinib,PD184352和Cobimetinib这四种MAPK抑制剂就能非常显着的提升HBV感染水平,其中HBeAg均提高了5倍以上,HBsAg均提高了10倍以上。此外,本研究对这些MAPK抑制剂促进HBV感染的机制进行了初步探索。根据是否上调NTCP表达可将这些MAPK抑制剂分为NTCP途径依赖型和非NTCP依赖型。B-Raf IN1为NTCP途径依赖型的MAPK抑制剂,可以增强HBV的感染,特别是对cccDNA。对B-Raf IN1处理后的2B1细胞进行转录组测序,结果显示B-Raf IN1可增强NTCP的表达,另外与HBV感染和复制相关的宿主基因也有不同程度提高。目前己对上调的JunB基因进行了验证,发现过表达JunB可增强HBV在2B1细胞中的感染以及敲低后抑制HBV的感染,因此可以推出B-Raf IN1促进HBV感染与增强JunB的表达有关。但是JunB本身是一种转录因子,并不能直接作用于HBV。因此仍需寻找与HBV感染更关键的因子。其他与HBV感染相关的宿主基因仍在验证当中。此外,针对非NTCP依赖型的MAPK抑制剂,我们首先猜想是否2B1细胞表面存在其他能与HBV结合的受体。因此,我们进行了 HBsAg结合实验,结果显示B-Raf IN-1d,Pimasertib,Selumetinib,PD0325901,SCH772984,Trametinib,TAK632和Cobimetinib能够明显增强HBsAg阳性率,说明这些MAPK抑制剂诱导了细胞表面某种能与HBsAg结合的蛋白,从而促进HBV的感染。进一步我们筛选了其中几个进行转录组测序,涉及HBV感染相关的宿主基因正在验证中。综述所述,本研究在HepG2-hNTCP细胞模型中筛选出了几种能显着促进HBV感染了MAPK抑制剂并对其作用机制进行了初步探索。为构建更优的体外细胞感染模型提供了可能。
周兵[5]（2018）在《快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究》文中指出感染性疾病是指由细菌、病毒等致病微生物侵袭人体,进而引起机体所发生的一系列具有感染性临床症状的疾病,严重威胁着人类的生命及健康。近年来,抗感染的抗体药物研究发展十分迅速,目前,已经有25种抗感染的抗体药物正在进行临床研究。HBV感染可以导致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等疾病,全世界每年约有88万人死于急性或慢性HBV感染。尽管现有预防性疫苗已显着减少了新发HBV感染,全球仍有3亿的慢性HBV感人者需要得到有效的治疗,以预防该病的并发症。当前FDA批准用于慢乙肝治疗的药物有两大类,干扰素和核苷类似物,分别通过调节宿主免疫和抑制病毒的复制从而起到抗病毒的效果。现有的药物虽有着很强的安全性和抗病毒活性,但治疗效果十分有限。这些药物HBsAg的阴转率都不足5%,无法实现临床治愈。因此,需要开发更有效的新药物,以改善HBV相关疾病的临床管理。尽管全人源抗体技术的发展极大增加了全人源抗体成为临床候选株的数量,但FDA批准的大部分治疗性抗体药物仍然以人源化抗体为主。抗体人源化技术主要包括CDR移植（常用噬菌体展示等抗体库技术）、表面重塑、链替换以及计算机辅助设计等,但是现有技术存在改造后人源化抗体亲和力降低、具有较大的免疫原性、工作量大、筛选不可视以及与转换成完整抗体活性不一致等问题,这些都延长了抗体人源化的时间,因此发展新的快速人源化方法势在必行。本研究旨在建立快速点突变抗体人源化新方法,实现快速获得人源化程度高、保持亲本鼠抗活性的人源化抗体。并利用该方法对HBV鼠抗E6F6进行人源化改造,获得有临床治疗潜力的人源化抗体。本研究分为两部分,第一部分是快速点突变抗体人源化平台的建立。通过对CDR划分方法、人源化模板选择方法的比较和分析,确定结合采用Kabat和Contact定义CDR区域,并选择同源性最高的人胚系基因作为模板。通过对现有大量上市或者临床试验中抗体序列和结构的分析以及一些前期人源化改造工作经验总结,抗体序列中每个氨基酸的位置和功能是有一定的规律可寻的。总结规律包括:（1）FR中有些氨基酸存在于CDR接触面上,直接或间接参与抗体与抗原的结合或者对维持抗体CDR构象具有重要的作用,突变时通常选择保留;（2）有些FR残基存在于VH-VK的交界面上,突变时通常选择保留;（3）还有些FR残基属于抗体序列中内部包埋的氨基酸,突变时选择性保留;（4）最后剩下的FR残基就是对抗体活性影响很小的氨基酸,可以直接突变。不管是属于哪一种功能的FR残基,它的位置是相对固定的。12G6是本实验室筛选获得的一株能高效中和乙型流感病毒（Flu-B）的具有广谱性的鼠源单克隆抗体,我们首先分别对它的轻重链可变区进行Kabat编号,然后按照Kabat和Contact定义的CDR区域划分CDR。再利用IMGT网站搜索比对,找出同源性最高的2-3条人胚系基因,进行序列比对。最后根据上述总结的氨基酸规律,对和胚系基因FR中存在的差异氨基酸进行选择性突变,共设计4条重链和4条轻链,分别将其两两互搭进行真核表达,以亲本鼠抗为对照,检测16株人源化抗体的表达情况、结合活性、中和活性等生物学功能。最终,针对12G6,我们挑选出7株优势的人源化抗体。发现在2个不同亚系的乙型流感病毒HA蛋白的结合实验、中和实验和HI实验中,7株人源化抗体保留了 12G6的生物学活性。5B11和7G5是本实验室筛选获得的两株能同时高效中和A/B型呼吸道合胞病毒（RSV）的鼠源单克隆抗体。根据12G6的实验结果,分别对5B11和7G5各设计一种人源化方案,获得N-5B11和N-7G5两株人源化抗体。两株人源化抗体均显示出良好的反应活性和中和活性,且活性与亲本相当。至此我们针对12G6、5B11和7G5三株鼠抗的人源化改造初步完成,验证了改造方案的可行性,完成快速点突变抗体人源化平台的构建。本研究第二部分是利用第一部分建立的新的人源化平台对乙型肝炎病毒鼠抗E6F6人源化,并对获得的人源化抗体进行性质验证及成药性评估。E6F6是本实验室筛选获得的一株针对HBV外膜蛋白（HBsAg）上一个特定表位的鼠源单克隆抗体;它能够有效并持久地清除转基因小鼠体内的HBV和HBsAg,具有发展成为HBV治疗性抗体的潜力。在前期研究中,我们利用噬菌体展示技术对其进行了人源化及亲和力成熟,成功获得了人源化程度为89%,体内外活性与鼠抗相当的人源化抗体162。本研究利用BIAcoreT200对162进行了亲和力测定,其亲和力为4.18×10-10M。通过对162 Fab的晶体培养及结构解析,获得了 162晶体三维结构。将162与HBsAg表位短肽进行对接,得到抗原-抗体相互作用的重要氨基酸。为了验证第一部分所建立的人源化平台的可行性及提高抗体的人源化程度,本研究第二部分利用第一部分中建立的快速点突变抗体人源化平台,结合162氨基酸序列、162晶体结构、与HBsAg短肽对接数据及Discovery Studio模拟平台,对E6F6进行人源化改造,获得3株人源化抗体,huAb1、huAb2和huAb3。在CHO-S细胞中瞬时表达和纯化,并从抗体的均一性、与抗原反应性、中和活性、体内病毒清除效果、成药性评估等方面进行综合分析。huAb1、huAb2和huAb3的人源化程度高达97%,体外结合及中和活性与162相当,但是在HBV转基因小鼠体内持续清除HBsAg的能力有所下降。C57b1/6小鼠体内发现人源化程度为97%的huAb1清除速率较快。说明人源化程度高的抗体在异源小鼠动物模型中免疫原性增加,被较快的清除,但是人源化程度高的抗体在人体内可能具有更高的优势。同时,huAb1、huAb2和huAb3的反嵌合抗体的体外结合、中和以及体内活性均与鼠抗E6F6相当。162、huAb1、huAb2和huAb3的溶解度高达140mg/mL以上,粘度小于14,等电点在8-9之间,达到了抗体药物的标准,TM值大于80℃,具有较好的热稳定性。在人体内环境和药物储存环境的模拟条件下同样具有较好的稳定性。食蟹猴体内药代动力学实验评估162、huAb1、huAb2和huAb3的半衰期符合标准,均能持续有效的清除食蟹猴体内的HBsAg,其中意外发现huAb3的半衰期较长,分析与其表面电荷分布有关,表面电荷降低可能会延缓抗体的清除。药代动力学参数及食蟹猴血常规和血生化结果提示,162、huAb1、huAb2和huAb3具有良好的药物有效性和安全性。进一步研究发现162、huAb1、huAb2和huAb3与HBsAg形成免疫复合物较小,有利于细胞的高效吞噬。通过对人IgG1Fc区域的突变,获得了体外活性与162相当,吞噬效应显着提高的162-IgG1-KD突变体。发现CH的替换可能导致Fc不依赖与FcγR作用途径,而是通过改变Fab与靶标的结合方式,形成不同大小的免疫复合物,影响吞噬效应。同时首次发现了抗体VH和CH1之间的linker对吞噬的影响,在162重链可变区末端引入柔性linker（Gly4Ser）3可能会增大Fab双臂间的距离,降低抗体的吞噬功能。综上所述,本研究建立了快速点突变抗体人源化方法并利用3株不同靶点的鼠抗完成了全面的验证,大大缩短了改造的时间,为鼠源抗体人源化的改造奠定了坚实的基础,丰富了人源化技术手段,为抗体人源化改造提供了新的选择。获得了具有专利保护的用于HBV感染相关疾病治疗的人源化抗体分子162、huAb1、huAb2和huAb3,并完成了较为全面的体内外活性评估及成药性分析,完善了抗体人源化改造平台,为相应疾病治疗性人源化抗体的研发奠定了坚实的基础,有望成为治疗慢乙肝的新药物。
王一文[6]（2018）在《基于记忆B细胞体外刺激培养的Anti-HBsAg食蟹猴单克隆抗体筛选及性质初步鉴定》文中指出乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）感染是全球主要的公共卫生问题之一,目前,全球约有2.4亿人为慢性乙肝感染者,每年约有60多万人死于慢性乙肝导致的肝硬化、肝癌等疾病。现有的基于干扰素和核（苷）酸类似物的治疗尚不能根治乙肝。本实验室前期在Gut期刊上报道了一株针对慢乙肝的治疗性鼠源单克隆抗体E6F6及其识别的核心靶点（HBsAg-aa119-125、SA线性表位）,并基于该靶点设计出乙肝治疗性表位疫苗。本研究拟从单克隆抗体水平对该疫苗介导的体液免疫反应进行初步研究。由于非人灵长类（Non-Human Primate,NHP）与人的免疫球蛋白基因高度同源,接种疫苗后可以激起相似的免疫反应,常被用作疫苗评估的动物模型,本研究选择食蟹猴作为上述疫苗评估的模型。本研究初步建立了食蟹猴记忆B细胞体外刺激培养体系并对上述表位疫苗在食蟹猴中诱导产生的抗体及其功能和识别表位进行初步探索,其结果为该治疗性疫苗的评估提供参考。研究内容共分为以下四个部分:第一,基于记忆B细胞体外刺激培养的猴源抗体筛选系统的初步建立及HBsAg特异性猴抗筛选。本研究首先在原有的人记忆B细胞体外刺激培养体系的基础上,对食蟹猴记忆B细胞分选和刺激培养条件进行了初步确定,即采用人PanB和人IgM、人IgD两种负选磁珠联用的方式进行记忆B细胞的分选;记忆B细胞按起始培养数（5-10）个/孔和104个/孔的CD40L饲养细胞共同培养至含10%FBS、50 ng/mL hIL21的RPMI 1640培养基,该体系可以有效的刺激记忆B细胞分化为浆细胞;其次我们进一步验证了文献报道抗体扩增引物的有效性。利用该系统,从28个阳性培养孔中克隆出10株HBsAg阳性抗体。第二,HBsAg阳性抗体的功能评估。评估结果显示,5株抗体1-12H4、1-23、3-13、3-23H1、3-23H4与HBsAg具有较优的抗原结合活性且能被E6F6（针对HBsAg SA线性表位的鼠抗）明显阻断,同时这些抗体在HBV转基因鼠中都显示出明显的HBsAg和HBV DNA清除效果,其中1-23和3-23H1的病毒清除能力最为显着。第三,猴源抗体的进一步人源化改造及性质鉴定。利用IMGT数据库,将1-23和3-23H1抗体轻重链可变区的骨架（Framewrok region,FR）的非人源氨基酸定点突变为人源氨基酸,并最终通过性质评估筛选性质较优的人源化抗体。进一步对这些人源化的抗体进行性质鉴定,参比亲本抗体及E6F6人源化抗体（162）,最终选出人源化程度为98.33%的M1D（亲本抗体1-23）及人源化程度为97.78%的M3D（亲本抗体3-23H1）,这两株抗体很好地保留了亲本抗体的抗原结合及体内抗原清除能力。对M1D、M3D广谱活性测定结果显示,M1D、M3D对乙型肝炎病毒三种主要的基因型A型、B型、C型都有较强的结合活性。第四,对人源化抗体M1D、M3D与抗原的相互作用进行研究。确定了抗体与抗原结合的关键CDR区和关键的氨基酸位点以及识别的抗原核心表位,M1D结合的核心表位为TGPCKTCT（aa1 18-125）,M3D结合的核心表位为CKTCT（aa121-125）。综上,该研究对基于SA线性表位的治疗性疫苗在食蟹猴中诱导产生的抗体进行了初步探索。获得了两株食蟹猴来源的人源化抗体M1D、M3D,在HBV转基因鼠中具有显着清除HBsAg和DNA的能力。基于M1D、M3D识别表位的研究证明,二者均识别SA表位,且核心表位与E6F6识别表位部分重叠,进一步揭示SA线性表位特异性的抗体能够介导高效的HBV病毒清除,该研究结果也为基于该表位的治疗性疫苗的有效性评估提供了一定的指导意义,可为乙肝治疗性抗体药物的开发提供候选分子。此外,该研究建立的方法也可为性能优良的类人抗体开发提供新的手段。
李卓[7]（2017）在《人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定》文中进行了进一步梳理肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）是一种以发热、出血、急性肾功能损害为特征的急性传染病,通常由汉坦病毒（Hantaviruses,HTV）感染引起,在世界范围内广泛分布,中国是世界上发病人数最多的国家,而陕西省为我国HFRS的高发地区之一。长期以来,我国通过对重点疫区人群进行疫苗接种预防HFRS的发生,因此需要对HFRS疫苗的免疫效果进行定期评价。抗汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）抗体特别是中和抗体（neutralizing antibody,NAb）可直接与HTNV结合,参与机体对病毒的免疫清除。鼠源性抗体因为异源性反应很难应用于人体,目前很少有人源性抗体用于HFRS的紧急预防和治疗,因此,制备具有潜在中和活性的人源性抗体十分必要。本研究在评价了HFRS抗体检测试剂盒和疫苗接种者免疫接种效果的基础上,建立了疫苗接种者的B淋巴母细胞系（Blymphoblastoid cell lines,BLCLs）。将NAb阳性的疫苗接种者和HFRS患者的BLCLs抗体基因重组到噬菌体载体上,建立噬菌体Fab抗体库,筛选HTNV特异性抗体和中和活性抗体,经表达、纯化和鉴定获得了具有潜在中和活性的人源性抗HTNV Fab抗体,为HFRS的紧急预防、治疗以及疾病的诊断提供新的途径。为此,我们进行了以下实验:第一部分:HFRS疫苗接种者和患者BLCLs的建立、筛选和克隆化首先,基于HTNV抗体检测的需要,评价了国产与进口HFRS IgG抗体ELISA试剂盒的性能,结果表明国产试剂盒敏感性高,进口试剂盒特异性强。然后,采集疫苗接种者的血液标本,应用EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）转化技术建立了70株疫苗接种者BLCLs,检测了疫苗接种者的血清标本和BLCLs培养上清中HTNV特异性抗体,评价了咸阳地区HFRS疫苗接种的免疫效果。疫苗接种人群血清中HTNV核蛋白（nucleocapsid protein,NP）特异的IgM、IgG抗体以及HTNV NAb的水平和阳性率明显升高,三者具有较好的相关性;最强烈的抗体分泌反应发生在接种疫苗后3个月,与血清检测结果一致,表明针对HFRS的疫苗免疫接种计划在中国西北地区人群中可以有效地诱导体液免疫应答。最后,明确了NAb阳性的BLCLs（占44%）并对BLCLs进行了克隆化,NAb阳性的35株BLCLs（HFRS疫苗接种者与科室保存的患者BLCLs）为构建具有潜在中和活性的噬菌体抗体库提供基因资源;BLCLs的成功克隆化有望为单克隆抗体制备开辟新的途径。第二部分:抗HTNV噬菌体Fab抗体库的构建和筛选提取NAb阳性BLCLs的mRNA并合成cDNA,应用噬菌体展示技术建立了库容量为1.3×109的抗HTNV噬菌体Fab抗体库,Fab的阳性插入率为95%,抗体序列正确率为68%。以HTNV全抗原为靶分子,用固相筛选法经过4轮“吸附-洗脱-扩增”,对洗脱的噬菌体滴度进行测定,结果显示回收率明显增加。筛选前随机克隆测序正确率为68%,第4轮筛选后随机克隆测序正确率为81%;筛选前多样性为95%,第4轮筛选后多样性为31%。经Phage-ELISA检测,最终从第3、4轮筛选的50个克隆中选出了15个序列正确的特异性强的HTNV噬菌体Fab抗体。通过此部分实验,我们成功构建了抗HTNV噬菌体Fab抗体库并对其进行了筛选。第三部分:人源性抗HTNV Fab抗体的可溶性表达和中和活性检测将第二部分筛选获得的特异性HTNV Fab噬菌体转染Ecoli.HB2151,诱导表达制备可溶性HTNV Fab抗体,并应用亲和层析法进行纯化。表达及纯化产物经还原电泳检测分析,发现在约25kDa处出现明显目的条带,与Fab的预期大小相符。间接ELISA表明这些可溶性HTNV Fab抗体均能与HTNV特异性结合。病毒中和实验结果显示3个Fab抗体具有中和活性。测序分析了15个Fab抗体轻链和重链可变区氨基酸序列,结果表明这些Fab抗体分属于6个抗体家族,大多数轻链和重链属于V3和V4家族,以IGKV3-20*01、IGHV4-59*01家族为主。同源性分析显示,3个具有中和活性的Fab抗体基因序列来自人胚系基因,未发现与其完全相同的抗体基因序列。第四部分:HTNV感染巨噬样人急性单核细胞白血病细胞系（differentiated THP-1,dTHP-1）诱导内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ER stress）反应HTV感染机体后可诱导强烈的免疫应答,但其致病机制尚未明确,我们从ER stress的角度,初步观测了HTNV感染对dTHP-1内质网应激的影响。检测结果显示HTNV感染dTHP-1细胞后,其内质网应激标志性分子葡萄糖调节蛋白（78kDa glucose-regulated protein,GRP78）的mRNA和蛋白水平、X盒结合蛋白1（X box-binding protein 1,XBP-1）的mRNA水平均明显升高,表明HTNV感染可以诱导dTHP-1启动ER Stress。而在病毒感染后2h,C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）的mRNA水平在病毒感染组与未感染组无明显差异;凋亡检测结果显示,HTNV感染dTHP-1 12h后细胞未发生明显凋亡;这些结果提示HTNV诱导的ER Stress在病毒感染早期（12h内）并未直接导致dTHP-1凋亡。
张天娇[8]（2015）在《乙肝表面抗体亲和力成熟的实验研究》文中认为乙型肝炎作为全球十大致死性疾病之一，严重影响人类的生命健康。现阶段对于乙型肝炎来说还是预防为主，各类抗病毒药物的应用并没有取得令人满意的效果。但是，抗乙型肝炎病毒抗体的出现对乙型肝炎产生有效的防治作用，为乙型肝炎的防治带来新的希望。随着基因工程技术和结构生物学的飞速发展，对抗体的研究和应用起到了巨大的推进作用。通过基因工程技术改造的抗体虽然具有较好的特异性，但是操作繁琐，工作量大。结构生物学的发展有效的弥补了基因工程技术在抗体改造中的不足，可以通过计算机模拟技术对基因工程抗体的亲和力进行计算，减少突变抗体的数量，并进行进一步的优化。本课题通过计算机模拟技术对已获得的乙肝表面抗体亲和力进行优化，并通过生物学实验对其亲和力进行验证。我们首先利用生物信息学方法研究了乙肝病毒表面抗原M（Middle Hepatitis B SurfaceAntigen, MHBsAg）和目标抗体的序列特征，并从已有的数据库中分别找到了与之同源性较高、质量比较好的晶体结构。接着，利用同源模建技术以晶体结构1WZ4为模板构建了目标病毒MHBsAg表位的三维结构，以晶体结构4JDT中的H链和晶体结构4KMT中L链为模板同源模建了目标抗体的重链和轻链，参考晶体结构1F11中抗体轻链和重链的组装方式构建了目标抗体的三维结构。然后，利用分子力学技术，先后通过最陡下降法和共轭沉降法两步对预测得到的MHBs Ag表位和抗体复合物结构进行了适度优化。接着，通过分子对接技术将优化后的MHBsAg表位与目标抗体结构进行蛋白质‐蛋白质分子对接，优选出了目标病毒MHBsAg表位与目标抗体的较好的结合方式。该结合模式中MHBs Ag表位的一个螺旋部分镶嵌在轻、重两条链的loop区中间，MHBsAg的两个螺旋所形成的角度也尽可能多地把重链的CDR3区包住，增大了抗原‐抗体之间的相互作用，增强了抗体对抗原的识别，这些与之前的文献调研结果相符合。在对抗原‐抗体复合物进行了适度优化之后，我们对二者之间的相互作用进行了结构分析。在这个结合状态中，MHBs Ag能够很好的嵌入到抗体复合物轻链和重链CDR3区形成的凹槽中间，并与之进行充分地接触，在二者之间共产生了8个氢键相互作用，1个盐桥相互作用和1个阳离子‐π相互作用。在氢键相互作用中，抗体轻链参与的氨基酸主要有两个，Arg30和Tyr32，重链参与的氨基酸主要有4个，Tyr32、Arg98、Gln108和Tyr109，而MHBsAg表位参与的氨基酸有8个，Asn1、Ser2、Gln4、Phe5、His6、Tyr18、Gly22和Gly23。以这些相互作用为线索，对抗体轻链上的Arg30，Ala50和重链上的Arg98进行饱和突变，通过计算获得了突变前后的自由能变化图谱。将这三个位点联合突变为结合能最大的氨基酸残基，构建抗体突变体并诱导表达，对其活性鉴定发现联合突变体的亲和力明显高于未经过结构优化的抗体。综上所述，本课题通过计算机模拟技术实现了对乙型肝炎表面抗体结构的优化，并且通过生物学方法证明经过结构优化的抗体亲和力确实得到了明显的提升。为全人源化乙型肝炎表面抗体的临床应用奠定了基础。
刘丰[9]（2014）在《人抗乙肝表面抗体在毕赤酵母中的表达》文中研究表明如今，乙肝在全世界广泛流行，造成严重危害。乙肝抗体在预防和治疗方面的作用逐渐为人们所重视。现有乙肝抗体主要来源于血浆，存在潜在风险，所以采用发酵方式生产基因工程抗体即成为一种十分必要的选择。本研究将前期筛选获得的乙肝抗体轻链、重链基因分别重组到相应表达载体，获得完整乙肝抗体轻链、重链以及全抗体重组载体。分别采用全抗体重组载体转化酵母感受态细胞的一步转化法，以及轻链、重链抗体依次转化酵母细胞的两步转化法，构建乙肝完整抗体表达体系，诱导表达，获得了具有良好乙型肝炎表面抗原结合活性的完整分泌型抗体，为完整乙肝抗体的发酵生产奠定基础。
崔传佳[10]（2014）在《乙型肝炎病毒治疗性抗体的人源化》文中指出鼠单抗6D11（6D11 mAb）是本实验室利用高复制的HBV转基因小鼠模型,筛选得到的针对乙型肝炎病毒（HBV）外膜蛋白上的一个特定表位的抗体,它能有效并持久清除转基因小鼠体内的乙肝病毒及乙肝表面抗原（HBsAg）。在前期研究工作中,我们已经成功将其改造成嵌合抗体形式（6D11cAb）,但嵌合抗体的鼠源可变区仍能诱导人体产生人抗鼠抗体（HAMA）反应,基于治疗性抗体研发的目的,需要对6D11 cAb的可变区进一步人源化。本研究主要是利用噬菌体展示技术对6D11 cAb的可变区进行CDR移植和FR区的优化,以进一步提高6D11cAb的人源化程度,同时保留其生物活性。首先,通过搜索数据库,确定了以序列同源性最高的人胚系基因4-28-02和2D-28-01作为改造模板。通过分析人源、鼠源序列中差异氨基酸的性质相似性以及空间位置对CDR区的影响,对不确定的重链的20个氨基酸和轻链的6个氨基酸进行突变,将人源、鼠源两种氨基酸同时编入人源化设计序列中,利用简并引物,通过重叠延伸PCR技术构建了 6D11人源化噬菌体单链抗体库,实际有效库容达到5×107。采用抗原直接包被酶联免疫板和“捕获法”两种固相筛选法,对抗体库进行了三轮筛选,获得了 20条人源化抗体序列,选取其中10条优势序列构建入PTT5真核表达载体,瞬时转染CHO-S细胞进行完整抗体表达。从与抗原反应性、体内病毒清除效果、中和活性三方面进行抗体评估,获得了编号为B-S3-45的活性最优抗体,其人源化程度为89.94%。B-S3-45与抗原的反应性与6D11 cAb相似,EC50浓度约为3 ng/mL;在HBV转基因小鼠体内能持续有效抑制HBVDNA和HBsAg达5天;进行细胞中和实验时,290 ng/mL的抗体浓度就使病毒感染抑制率达到50%,2500 ng/mL的抗体浓度时病毒感染抑制率达到90%。此外,还发现6D11cAb的结合活性相比于6D11mAb明显降低。因此,构建并表达了重组抗体B45-mC,其可变区为B-S3-45的序列,恒定区为鼠源序列,经活性验证,B45-mC的抗原结合能力和病毒中和能力比B-S3-45分别提高了 14倍和2倍,表明恒定区是影响6D11 cAb及其人源化抗体生物活性的因素之一,提示针对抗体恒定区序列的优化和改造是进一步提高6D11人源化抗体亲和力的重点方向。
二、人源性乙型肝炎表面抗体Fab段的表达及纯化的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人源性乙型肝炎表面抗体Fab段的表达及纯化的研究（论文提纲范文）
（1）柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 柳胺酚代谢产物鉴定及代谢通路研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 配置柳胺酚溶液 |
| 3.2 动物实验方案 |
| 3.3 体内代谢产物样品的收集与处理 |
| 3.4 体外代谢产物的制备 |
| 3.5 色谱与质谱条件 |
| 3.6 数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 柳胺酚母离子分析 |
| 4.2 柳胺酚代谢产物鉴定 |
| 4.3 柳胺酚肝脏药物代谢酶亚型鉴定 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 第二部分 柳胺酚代谢产物抗HBV活性研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 细胞株 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 RRM2活性位点与柳胺酚及其代谢产物分子对接 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 细胞增殖毒性测定 |
| 3.4 细胞凋亡检测 |
| 3.5 细胞水平抗乙肝病毒活性测定 |
| 3.6 柳胺酚羟基化代谢产物与核苷(酸)类似物联合效应测定 |
| 3.7 数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 RRM2分子活性位点定义 |
| 4.2 柳胺酚及其代谢产物与RRM2分子对接结果 |
| 4.3 LAF-OH对细胞增殖毒性影响的研究 |
| 4.4 LAF-OH对细胞凋亡影响的研究 |
| 4.5 LAF-OH抗HBV活性研究 |
| 4.6 LAF-OH与核苷(酸)类似物联合用药研究 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 第三部分 柳胺酚活性代谢物LAF-OH抗HBV机制研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 细胞株及载体 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 细胞转染 |
| 3.3 细胞内RRM2活性检测 |
| 3.4 LAF-OH处理后细胞内RRM1、RRM2、RRM2B在mRNA及蛋白水平的表达检测 |
| 3.5 iTRAQ标记定量蛋白组分析方法 |
| 3.6 细胞周期检测方法 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 LAF-OH对细胞周期及IL-17、PPAR等信号通路产生调控 |
| 4.2 LAF-OH通过降低Akt的磷酸化水平下调cyclin D1表达水平 |
| 4.3 LAF-OH在mRNA水平及蛋白质水平抑制RRM2的表达 |
| 4.4 LAF-OH对RR活性具有抑制作用 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 参考文献 |
| 综述 抗乙型肝炎病毒治疗药物研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（2）高效持久清除乙肝病毒的新型抗体研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1 治疗性抗体药物的研究历史 |
| 2 抗体的结构与功能 |
| 3 再循环抗体的工程改造 |
| 3.1 再循环抗体的作用机制 |
| 3.2 再循环抗体的研究进展 |
| 3.3 再循环抗体的进一步改造 |
| 4 FcRn的结构与功能 |
| 5 乙型肝炎病毒及治疗现状 |
| 6 噬菌体展示技术 |
| 6.1 丝状噬菌体特征 |
| 6.2 噬菌体抗体库筛选流程 |
| 7 本研究的思路、目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂与材料 |
| 1.3 常用溶液及培养基配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 分子克隆常规操作 |
| 2.2 细胞实验常规操作 |
| 2.3 蛋白水平相关常规操作 |
| 2.4 pH依赖抗原结合抗体库的构建、筛选及检测 |
| 2.5 真核表达载体的构建、抗体表达、纯化及质控 |
| 2.6 HBV转基因鼠体内半衰期及抗原清除效果评估 |
| 2.7 清道夫抗体的表达纯化及质控 |
| 2.8 hFcRn转基因鼠体内半衰期及抗原清除效果评估 |
| 2.9 常用分析软件及工具 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 pH依赖抗原结合抗体库的构建、筛选及检测 |
| 1.1 pH依赖抗体改造突变位点的确定 |
| 1.2 pH依赖抗原结合抗体库的筛选 |
| 1.3 pH依赖抗原结合抗体库的检测 |
| 1.4 本节小结 |
| 2 候选分子真核表达纯化、质控及评估 |
| 2.1 候选分子真核表达纯化和质控 |
| 2.2 HBV转基因鼠体内半衰期及抗原清除效果评估 |
| 2.3 本节小结 |
| 3 清道夫抗体的表达纯化、质控及功能评估 |
| 3.1 结合hFcRn的清道夫抗体 |
| 3.2 结合mFcγR Ⅱ的清道夫抗体 |
| 3.3 本节小结 |
| 第四章 讨论 |
| 1. A31-73与HBsAg的pH依赖结合作用机制探讨 |
| 2. A41-8半衰期长的的可能原因 |
| 3. 动物模型的选择 |
| 4. HBV清道夫抗体可研发成为备选的HBV治疗性抗体药物 |
| 第五章 小结与展望 |
| 1. 小结 |
| 2. 展望 |
| 研究生期间科研成果 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1. 乙型肝炎病毒 |
| 1.1 HBV的起源与进化 |
| 1.2 HBV的病毒结构 |
| 1.3 HBV的基因组结构及其编码蛋白 |
| 1.4 HBV的感染机制和生命周期 |
| 2. 乙型肝炎病毒感染及其造成的相关肝脏疾病 |
| 2.1 HBV感染的主要宿主 |
| 2.2 HBV的全球流行状况 |
| 2.3 HBV感染的自然历史过程 |
| 2.4 HBV感染慢性化诱发的相关肝脏疾病 |
| 2.5 HBV感染的诊断和治疗 |
| 3. 乙型肝炎病毒感染细胞模型 |
| 3.1 基于人肝癌细胞系的HBV稳定复制细胞系 |
| 3.2 基于原代人肝细胞和原代树鼩肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.3 基于人肝脏祖细胞系HepaRG的HBV感染细胞模型 |
| 3.4 基于受体过表达的人肝癌细胞系的HBV感染细胞模型 |
| 3.5 基于受体过表达的原代猪肝细胞和原代猴肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.6 基于人干细胞分化获得类肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 4. 乙型肝炎病毒感染动物模型 |
| 4.1 灵长类HBV感染模型 |
| 4.2 树鼩HBV感染模型 |
| 4.3 土拨鼠替代模型 |
| 4.4 北京鸭替代模型 |
| 4.5 HBV转基因小鼠 |
| 4.6 基于病毒基因组转染的HBV复制小鼠模型 |
| 4.7 人类肝脏单嵌合小鼠模型支持HBV感染及抗病毒研究 |
| 4.7.1 免疫缺陷小鼠和细胞移植 |
| 4.7.2 uPA缺陷的免疫缺陷小鼠模型 |
| 4.7.3 HSV-tk/NOG小鼠模型 |
| 4.7.4 Fa~(-/-)Rag2~(-/-)IL2rg~(-/-)(FRG)小鼠模型 |
| 4.7.5 FRGS小鼠模型 |
| 4.8 人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型支持HBV相关疾病研究 |
| 4.8.1 AFC8-hu HSC/Hep小鼠模型 |
| 4.8.2 人肝和人免疫系统双嵌合的FRGN和uPA-NOG小鼠 |
| 4.8.3 A2/NSG-hu HSC/Hep小鼠 |
| 4.8.4 HIS-Hep-FRGN小鼠 |
| 4.8.5 HIS-HUHEP-uPA/NRG小鼠 |
| 5. 人骨髓间充质干细胞的生物学特性 |
| 5.1 人骨髓间充质干细胞的发现 |
| 5.2 人骨髓间充质干细胞的分离纯化和体外培养 |
| 5.3 人骨髓间充质干细胞的多向分化分化潜能和免疫调节功能 |
| 5.4 人骨髓间充质干细胞移植治疗暴发性肝衰竭的分子机制 |
| 6. 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 7. 研究中用到的主要仪器、耗材和试剂 |
| 7.1 主要仪器 |
| 7.2 常规耗材 |
| 7.3 生物化学与细胞生物学常规基础试剂 |
| 7.4 定性和定量检测试剂盒 |
| 7.5 实验用主要溶液及培养基配制 |
| 7.6 常规PCR引物 |
| 7.7 常规抗体和荧光素 |
| 7.8 实验动物和细胞 |
| 8. 常规分子生物学及细胞生物学实验方法 |
| 8.1 ELISA/CLEIA检测 |
| 8.2 Western Blot检测 |
| 8.3 细胞免疫荧光实验 |
| 8.4 免疫组化和病理学染色实验 |
| 8.5 常规流式细胞技术 |
| 8.6 常规哺乳动物细胞培养方法 |
| 9. hBMSC-FRGS小鼠模型构建和鉴定 |
| 9.1 hBMSCs分离、传代培养、冻存、复苏和鉴定 |
| 9.2 FHF-FRGS小鼠的构建及hBMSCs移植手术 |
| 9.3 肝脏灌流分离肝内实质细胞和非实质细胞 |
| 9.4 分离鉴定人源细胞及检测相关标志物 |
| 9.5 鉴定人源肝细胞和鼠源肝细胞是否发生融合 |
| 10. HBV感染相关病毒学和病理学检测 |
| 10.1 不同基因型HBV病毒生产与纯化 |
| 10.2 HBV蛋白与核酸检测方法 |
| 10.3 hBMSC-FRGS小鼠人源免疫反应分析 |
| 10.4 肝硬化诊断方法 |
| 11. 数据处理与统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 hBMSCs移植暴发性肝衰竭FRGS小鼠 |
| 12.1 hBMSCs表型鉴定 |
| 12.2 hBMSCs移植拯救FHF-FRGS小鼠免于死亡 |
| 12.3 hBMSC-FRGS小鼠实现人源肝细胞嵌合 |
| 12.4 hBMSC-FRGS小鼠实现多种人源免疫细胞嵌合 |
| 12.6 嵌合肝脏内的人源肝和鼠源肝细胞未发生融合 |
| 12.7 hBMSC-FRGS小鼠长期安全性评估 |
| 12.8 FHF肝脏微环境是hBMSCs转分化的关键驱动因素 |
| 12.9 第一部分小结 |
| 第二部分 hBMSC-FRGS小鼠支持慢性化HBV感染 |
| 13.1 hBMSC-FRGS小鼠支持多种基因型HBV感染 |
| 13.2 hBMSC-FRGS小鼠支持C基因型HBV感染慢性化 |
| 13.3 第二部分小结 |
| 第三部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠免疫病理生理学研究 |
| 14.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠肝人源内免疫细胞变化 |
| 14.2 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内人源细胞因子变化 |
| 14.3 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠发生重症肝炎 |
| 14.4 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠产生特异性针对HBV抗原的T细胞 |
| 14.5 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠血清HBV特异性抗体水平变化 |
| 14.6 第三部分小结 |
| 第四部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠诱发人源肝硬化 |
| 15.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清学肝硬化指标变化 |
| 15.2 HBV感染肝hBMSC-FRGS小鼠组织学肝硬化指标变化 |
| 15.3 肝硬化区域种属特异性鉴定 |
| 15.4 第四部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 16. HBV细胞模型和动物模型的发展历程 |
| 17. 基于间充质干细胞的人类肝脏再生和免疫系统重建 |
| 18. HBV感染慢性化和诱导肝脏疾病发生的关键机制 |
| 19. 新型HBV抗病毒治疗策略与关肝脏疾病的防治措施 |
| 第五章 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间科研成果 |
（4）MAPK抑制剂增强体外HBV感染作用和机制的初步探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章: 前言 |
| 1 乙型肝炎病毒生物学特征 |
| 1.1 病毒分类 |
| 1.2 HBV的血清型和基因型 |
| 1.3 HBV的病毒结构 |
| 1.4 HBV基因组及其功能 |
| 1.5 HBV生命周期 |
| 2 乙型肝炎病毒感染 |
| 2.1 HBV感染的全球地理分布情况 |
| 2.2 HBV的传播途径 |
| 2.3 乙型肝炎病毒感染的自然史 |
| 2.4 HBV感染的预防 |
| 2.5 HBV抗病毒治疗 |
| 3 乙型肝炎病毒研究模型 |
| 3.1 细胞培养模型 |
| 3.2 动物模型 |
| 4 MAPK通路与HBV的相关研究 |
| 5 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章: 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 耗材 |
| 1.3 菌株、质粒、cDNA和细胞株 |
| 1.4 常用试剂 |
| 1.5 实验室常规溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 常规细胞生物学实验 |
| 2.2 HBV感染实验 |
| 2.3 MAPK抑制剂筛选 |
| 2.4 HBV的DNA的提取与检测 |
| 2.5 HBV HBeAg、 HBsAg和HBcAg的检测 |
| 2.6 PreS1结合实验 |
| 2.7 HBsAg结合实验 |
| 2.8 细胞内蛋白水平的检测-Western Blot |
| 2.9 CCK-8细胞毒性检测 |
| 2.10 过表达和敲低宿主基因的慢病毒的构建及感染 |
| 2.11 转录组测序及分析 |
| 2.12 数据处理与统计学分析 |
| 第三章: 结果与分析 |
| 1 MAPK抑制剂的筛选 |
| 1.1 MAPK抑制剂在复制模型HepG2-N10细胞上的初步筛选 |
| 1.2 MAPK抑制剂增强HBV对2B1感染水平的初步探索 |
| 1.3 MAPK抑制剂增强HBV的复制与表达 |
| 1.4 MAPK抑制剂增强HBV的感染与进入 |
| 2 MAPK抑制剂增强HBV对2B1感染的机制探索 |
| 2.1 MAPK抑制剂促进HBsAg与肝细胞表面某宿主蛋白的结合 |
| 2.2 B-Raf IN1可通过上调JunB来增强HBV的复制 |
| 第四章: 讨论 |
| 1 HBV复制模型筛选和评价药物结果的可靠性需进一步验证 |
| 2 MAPK抑制剂不依赖NTCP途径促进HBV感染 |
| 3 B-Raf IN1促进cccDNA形成 |
| 第五章: 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 抗体(Antibody)的概述 |
| 1.1.1 抗体的结构与功能 |
| 1.1.2 抗体的人源化 |
| 1.1.3 抗体药物市场 |
| 1.1.4 抗感染抗体药物的概况及趋势 |
| 1.1.5 Fc改造对效应功能的影响 |
| 1.2 乙型肝炎病毒(HBV)的概述 |
| 1.2.1 HBV基因组 |
| 1.2.2 HBV的病毒结构 |
| 1.2.3 HBV的生命周期 |
| 1.2.4 HBV基因编码的蛋白 |
| 1.2.5 HBV的基因型 |
| 1.2.6 HBV的流行病学 |
| 1.2.7 HBV的预防 |
| 1.2.8 HBV感染的抗病毒治疗 |
| 1.3 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要耗材 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 实验常用溶液及试剂配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.2.2 常规细胞生物学方法 |
| 2.2.3 抗体的表达、纯化及鉴定 |
| 2.2.4 免疫学相关实验方法 |
| 2.2.5 体外调理吞噬实验 |
| 2.2.6 抗原-抗体免疫复合物特征分析 |
| 2.2.7 HBV相关抗体的小鼠体内实验方法 |
| 2.2.8 亲和力常数测定 |
| 2.2.9 抗体晶体培养及结构解析 |
| 2.2.10 食蟹猴体内评估抗体的药代动力学 |
| 2.2.11 抗体生物物理特性相关实验方法 |
| 2.2.12 数据处理统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 快速点突变抗体人源化平台的构建 |
| 3.1 流感病毒鼠源抗体12G6的人源化 |
| 3.1.1 12G6-cAb体外活性的评估 |
| 3.1.2 12G6-cAb的人源化设计 |
| 3.1.3 12G6人源化抗体真核表达载体的构建 |
| 3.1.4 12G6人源化抗体小量转染细胞上清性质鉴定 |
| 3.1.5 12G6人源化抗体大量表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.2 呼吸道合胞病毒鼠源抗体5B11和7G5的人源化 |
| 3.2.1 5B11-cAb和7G5-cAb体外活性的评估 |
| 3.2.2 5B11-cAb和7G5-cAb的人源化设计 |
| 3.2.3 5B11和7G5人源化抗体构建、表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.3 第一部分小结 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒治疗性抗体的改造及成药性评估 |
| 3.4 E6F6人源化抗体162的亲和力测定 |
| 3.4.1 E6F6人源化抗体162的晶体培养及结构解析 |
| 3.4.2 E6F6鼠抗的人源化改造 |
| 3.4.3 E6F6人源化抗体体内外活性的评估 |
| 3.4.4 E6F6人源化抗体的成药性评估 |
| 3.4.5 E6F6人源化抗体与HBsAg免疫复合物的结构特征分析 |
| 3.4.6 E6F6人源化抗体162 Fc改造对吞噬的影响 |
| 3.5 第二部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼠源抗体人源化方法 |
| 4.2 抗体CDR的划分和人源化模板的选择 |
| 4.3 FR区人源化点突变规则 |
| 4.4 E6F6人源化抗体在小鼠体内的清除速率 |
| 4.5 E6F6人源化抗体huAb1和huAb3在食蟹猴体内的半衰期 |
| 4.6 抗原-抗体复合物电镜观察与纳米流式检测 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（6）基于记忆B细胞体外刺激培养的Anti-HBsAg食蟹猴单克隆抗体筛选及性质初步鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1 治疗性抗体药物的研究历史 |
| 2 抗体的结构与功能 |
| 3 非人灵长类与非人灵长类抗体 |
| 3.1 非人灵长类及其在生物学中的应用 |
| 3.2 非人灵长类抗体应答研究的重要意义 |
| 3.3 NHP抗体与全人源抗体的异同点 |
| 4 NHP抗体研究技术 |
| 4.1 库展示技术 |
| 4.2 单个B细胞重组技术 |
| 4.3 深度测序 |
| 5 NHP抗体的应用 |
| 5.1 在病毒性感染疾病及相关疫苗有效性评估中的应用 |
| 5.2 治疗性抗体药物的开发 |
| 6 乙型肝炎病毒 |
| 6.1 乙型肝炎病毒及分布流行情况分析 |
| 6.2 乙型肝炎病毒的预防及治疗 |
| 7 本研究的思路、目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂与材料 |
| 1.3 常用溶液及培养基配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 常规分子克隆方法 |
| 2.2 常规细胞实验操作 |
| 2.3 食蟹猴的免疫 |
| 2.4 食蟹猴记忆B细胞的分离 |
| 2.5 食蟹猴记忆B细胞体外刺激培养 |
| 2.6 抗体可变区基因钓取 |
| 2.7 抗体的人源化改造 |
| 2.8 抗体的真核表达及纯化 |
| 2.9 抗体性质分析相关实验方法 |
| 2.10 抗体抗原相互作用研究相关实验方法 |
| 2.11 常用分析软件及工具 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 食蟹猴抗体筛选系统的初步确立与阳性抗体获取 |
| 1.1 食蟹猴的免疫 |
| 1.2 食蟹猴记忆B细胞分离 |
| 1.3 记忆B细胞体外刺激培养 |
| 1.4 抗体可变区基因克隆及重组表达 |
| 1.5 本节小结 |
| 2 HBsAg特异性食蟹猴单克隆抗体性质分析 |
| 2.1 食蟹猴单克隆抗体序列信息分析 |
| 2.2 食蟹猴单克隆抗体的抗原结合活性评估 |
| 2.3 食蟹猴单克隆抗体结合表位的初步鉴定 |
| 2.4 食蟹猴单克隆抗体在HBV转基因鼠上的治疗效果测试 |
| 2.5 本节小结 |
| 3 1-23和3-23H1的人源化改造及人源化抗体性质评估 |
| 3.1 1-23和3-23H1的人源化改造设计 |
| 3.2 人源化抗体的抗原结合活性评估 |
| 3.3 人源化抗体结合表位的初步鉴定 |
| 3.4 人源化抗体在HBV转基因鼠上的治疗效果测试 |
| 3.5 人源化抗体M1D、M3D的广谱活性测定 |
| 3.6 本节小结 |
| 4 抗体抗原相互作用研究 |
| 4.1 M1D、M3D关键CDR区确定 |
| 4.2 M1D、M3D关键氨基酸位点确定 |
| 4.3 M1D、M3D识别的核心表位鉴定 |
| 4.4 本章小结 |
| 第四章 讨论 |
| 1 疫苗的有效性评估和治疗性抗体药物的开发 |
| 2 基于SA表位的NHP抗体筛选优化策略探讨 |
| 3 抗体序列的特殊性 |
| 4 抗体的pH依赖性改造 |
| 第五章 小结与展望 |
| 1. 小结 |
| 2. 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 汉坦病毒概述 |
| 2 汉坦病毒人工制备抗体研究进展 |
| 3 病毒感染与内质网应激 |
| 第一部分 HFRS疫苗接种者和患者BLCLs的建立、筛选和克隆化 |
| 实验一 国产与进口人HFRS IgG抗体ELISA检测试剂盒的性能比较 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 利用EBV转化技术建立HFRS疫苗接种者BLCLs |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 中国西部地区人群HFRS疫苗接种后的抗体反应 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 具有潜在中和活性的HTNV噬菌体抗体库的构建及筛选 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 人源性抗HTNV Fab抗体的可溶性表达及中和活性的检测 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 HTNV感染巨噬样人急性单核白血病细胞（dTHP-1）诱导内质网应激（ER stress）反应的初步探讨 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）乙肝表面抗体亲和力成熟的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 抗体的研究进展 |
| 1.1.1 抗体的结构和功能 |
| 1.1.2 抗体的发展历程 |
| 1.1.3 抗体在疾病治疗中的应用 |
| 1.2 乙型肝炎免疫治疗的研究进展 |
| 1.3 结构生物学的研究进展 |
| 1.3.1 蛋白质结构的预测 |
| 1.3.2 计算机模拟的分子对接技术 |
| 1.3.3 结构生物学对抗体工程的影响 |
| 1.4 立题依据 |
| 第2章 乙肝表面抗体亲和力成熟的实验研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 利用 Discovery Studio 计算机模拟平台对乙肝表面抗体进行改造和优化 |
| 2.2.2 高亲和力抗体突变体重组表达载体的构建 |
| 2.2.3 重组抗体在酵母中的表达和亲和力鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 乙型肝炎表面抗体结构模拟突变，初步分析及序列选择 |
| 2.3.2 以 1WZ4 为模板，利用同源模建的方法构建序列已知的MHBs Ag 的 123‐145 位氨基酸结构 |
| 2.3.3 利用同源模建的方法构建抗体结构 |
| 2.3.4 利用能量最小化对构建得到的 MHBs Ag 以及抗体结构进行充分优化 |
| 2.3.5 预测目标病毒 MHBs Ag 与抗体 CDR 区可能的相互作用模式 |
| 2.3.6 目标病毒 MHBs Ag‐抗体的相互作用模式进行优选 |
| 2.3.7 利用能量最小化对该相互作用模式进行充分优化 |
| 2.3.8 分析相互作用模式特征，找到参与相互作用的关键氨基酸 |
| 2.3.9 关键氨基酸位点饱和突变后对抗体结合能力的影响 |
| 2.3.10 重链及轻链抗体突变体重组表达载体的构建 |
| 2.3.11 轻链抗体转化酵母的基因鉴定 |
| 2.3.12 完整抗体突变体转化酵母的基因鉴定 |
| 2.3.13 重组抗体突变体亲和活性的变化 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 研究总结 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（9）人抗乙肝表面抗体在毕赤酵母中的表达（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 研究背景 |
| 一、抗体的结构与生物学功能 |
| 1. 抗体的结构 |
| 1.1 重链 |
| 1.2 轻链 |
| 1.3 CDRs、Fv、Fab、Fc 结构域 |
| 2.抗体的功能 |
| 2.1 抗原结合 |
| 2.2 效应功能 |
| 二、抗体的研究进展 |
| 1. 多克隆抗体 |
| 2. 单克隆抗体 |
| 3. 基因工程抗体 |
| 3.1 鼠单克隆抗体人源化 |
| 3.2 小分子抗体 |
| 3.3 双（多）价及双特异抗体分子 |
| 3.4 抗体融合蛋白 |
| 4. 抗体库技术 |
| 三、抗体的表达 |
| 1. 大肠杆菌表达体系 |
| 2. 酵母表达体系 |
| 3. 哺乳动物细胞表达体系 |
| 4. 植物表达体系 |
| 5. 转基因动物表达系统 |
| 四、抗体在临床上的应用 |
| 1. 肿瘤的治疗 |
| 1.1 注射用曲妥珠单抗 HERCEPTIN (TRASTUZUMAB FOR INJECTION) |
| 1.2 美罗华 (rituximab,rituxan,mabthera) |
| 1.3 Panorex (mAb17-1A) |
| 2. 作为免疫抑制剂方面的应用 |
| 3. 乙型肝炎的免疫治疗 |
| 研究目的 |
| 研究方案 |
| 1. 技术路线图 |
| 2. 备注 |
| 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 所用仪器 |
| 1.2 主要药品 |
| 1.3 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 完整抗-HBs 抗体表达载体的构建 |
| 2.2 完整抗-HBs 抗体的表达 |
| 2.3 两步转化法建立完整抗体表达体系 |
| 2.4 重组抗体的发酵及纯化 |
| 实验结果 |
| 3.1 重组载体的鉴定 |
| 3.2 完整抗-HBs 抗体转化子的鉴定 |
| 3.3 完整抗-HBs 抗体的诱导表达 |
| 3.4 两步转化法建立完整抗体表达体系 |
| 3.5 重组抗体的纯化与鉴定 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 致谢 |
（10）乙型肝炎病毒治疗性抗体的人源化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1 HBV的生物学特征 |
| 1.1 HBV流行现状 |
| 1.2 HBV病毒结构和分子流行病学 |
| 1.3 HBV的生命周期 |
| 1.4 HBV的传播和感染 |
| 1.5 HBV感染的抗病毒治疗 |
| 2 抗体结构和功能 |
| 2.1 抗体的结构 |
| 2.2 抗体的分类 |
| 2.3 抗体的生物学功能 |
| 3 治疗性抗体的研究进展 |
| 3.1 治疗性抗体的发展历史 |
| 3.2 我国治疗性单抗药物的现状 |
| 4 噬菌体展示技术 |
| 4.1 丝状噬菌体生物特性 |
| 4.2 噬菌体抗体库技术 |
| 5 抗体人源化 |
| 5.1 嵌合抗体 |
| 5.2 人源化抗体 |
| 6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂与材料 |
| 1.3 常用溶液及培养基配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 分子克隆常规操作 |
| 2.2 细胞试验常规操作 |
| 2.3 6D11 mAb的人源化设计 |
| 2.4 6D11人源化单链抗体库的构建 |
| 2.5 6D11人源化单链抗体库的筛选和检测 |
| 2.6 6D11人源化抗体的构建 |
| 2.7 抗体的转染表达和纯化 |
| 2.8 人源化抗体的鉴定 |
| 2.9 6D11人源化抗体恒定区改变的克隆 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 6D11 mAb人源化设计 |
| 1.1 人源化模板的选择 |
| 1.2 CDR区的确定 |
| 1.3 人源化抗体设计突变点的确定 |
| 2 6D11人源化单链抗体库的构建和筛选 |
| 2.1 人源化单链抗体库的构建 |
| 2.2 人源化单链抗体库的筛选 |
| 2.3 人源化单链抗体库筛选后的检测 |
| 3 人源化IgG抗体的表达纯化 |
| 3.1 抗体真核表达载体的构建 |
| 3.2 人源化IgG抗体的表达纯化 |
| 4 人源化IgG抗体的活性验证 |
| 4.1 人源化IgG抗体与抗原的结合活性 |
| 4.2 人源化IgG抗体动物体内实验 |
| 4.3 人源化抗体中和活性验证 |
| 4.4 抗体恒定区对其生物活性的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 1 6D11的人源化设计 |
| 2 人源化单链抗体库的构建和筛选 |
| 3 人源化抗体的序列分析 |
| 4 人源化抗体的活性检测 |
| 5 恒定区对抗体生物活性的影响 |
| 第五章 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、人源性乙型肝炎表面抗体Fab段的表达及纯化的研究（论文参考文献）
- [1]柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究[D]. 武喆. 浙江大学, 2020(01)
- [2]高效持久清除乙肝病毒的新型抗体研究[D]. 温灿. 厦门大学, 2019(09)
- [3]人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究[D]. 袁伦志. 厦门大学, 2019(08)
- [4]MAPK抑制剂增强体外HBV感染作用和机制的初步探索[D]. 郑金伟. 厦门大学, 2019(09)
- [5]快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究[D]. 周兵. 厦门大学, 2018(06)
- [6]基于记忆B细胞体外刺激培养的Anti-HBsAg食蟹猴单克隆抗体筛选及性质初步鉴定[D]. 王一文. 厦门大学, 2018(07)
- [7]人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定[D]. 李卓. 第四军医大学, 2017(05)
- [8]乙肝表面抗体亲和力成熟的实验研究[D]. 张天娇. 吉林大学, 2015(08)
- [9]人抗乙肝表面抗体在毕赤酵母中的表达[D]. 刘丰. 吉林大学, 2014(10)
- [10]乙型肝炎病毒治疗性抗体的人源化[D]. 崔传佳. 厦门大学, 2014(05)