一、免疫耐受对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响（论文文献综述）
刘壮壮[1]（2021）在《T淋巴细胞在SD大鼠抗血吸虫疾病中的作用》文中研究指明背景血吸虫病是由裂体吸虫感染引起的一种人体感染性疾病。该病在我国的流行区域异常广泛,防控形势十分严峻,且疾病后期常并发上消化道出血、肝性脑病等致死性疾病,危害十分严重。因此深入研究血吸虫病的免疫调节机制十分必要。早期研究显示在血吸虫适应性宿主小鼠模型中,T淋巴细胞与该疾病的进展密切相关,而对于血吸虫非适应性宿主SD大鼠中T细胞的具体作用,受限于遗传操作以及免疫表型分析方法,其抗感染免疫调节机制尚未阐明。目的通过CRISPR/Cas9介导的SD大鼠T淋巴细胞缺失的动物模型,研究T细胞在其抗血吸虫感染中重要作用同时揭示其抗血吸虫病的具体免疫调节机制。为血吸虫病的免疫调节提供新的理论依据,同时也为该疾病的治疗提供新的思路。方法1.基于前期研究中提到的T细胞在小鼠血吸虫感染中的重要作用,首先通过多色流式细胞分析,绝对计数手段,详细评价野生型小鼠感染血吸虫前后,外周血、脾脏等淋巴器官中T细胞亚群的比例,数目的变化情况。2.利用现有的T细胞缺失的小鼠CD3e-/-B6,对比野生型B6小鼠,通过体式显微镜分析两者在血吸虫感染后体内成虫数目、形态、回收比例等方面的差异;同时对感染后的肝脏进行H&E染色、Masson染色以及qPCR检测,分析两者虫卵肉芽肿数目、面积,肝脏纤维化恶性程度等相关指标的差异。3.通过血吸虫适应性宿主、非适应性宿主动物模型B6小鼠、SD大鼠,对比分析在血吸虫感染后二者体内成虫的形态、回收比例;同时,利用流式细胞仪分析SD大鼠感染血吸虫前后外周血、脾脏等淋巴器官中T淋巴细胞亚群的比例、数目变化。4.利用CRISPR/Cas9基因编辑工具,设计SD大鼠T淋巴细胞缺失的动物模型Lck-/-SD,并通过流式细胞仪对T细胞缺陷的SD大鼠进行检测,分析其胸腺以及次级淋巴结中T细胞比例、数目,验证T细胞敲除是否成功。5.利用T细胞缺失的SD大鼠,对比野生型,分析血吸虫感染后两者体内血吸虫成虫数目、形态差异,同时通过H&E染色、Masson染色、qPCR检测,分析肝脏虫卵肉芽肿数目、面积,肝脏纤维化恶性程度等相关指标的差异。6.流式细胞检测、qPCR定量检测分析B6小鼠、SD大鼠在感染、非感染状态下T细胞分化相关转录因子表达水平的差异,深度研究T细胞参与抗感染的具体调节方式。结果1.野生型B6小鼠在感染后,外周血中总T细胞、CD4 T细胞亚群绝对数目显着降低,脾脏中T细胞以及相关亚群数目明显升高。2.CD3e-/-B6小鼠感染血吸虫后,相较于野生型B6小鼠,体内成虫数目、成虫回收比例明显增多,但成虫长度未有明显变化,且成虫的宽度下降明显;肝脏H&E染色显示,CD3e-/-B6小鼠的肝脏虫卵肉芽肿面积、大小均显着降低;肝脏Masson染色、qPCR检测提示,CD3e-/-B6小鼠的肝脏纤维化面积、大小均明显降低。3.相较于B6小鼠,SD大鼠感染血吸虫后体内血吸虫成虫宽度、长度均显着下降,且成虫的回收率明显低于小鼠。同时,流式分析结果显示,相较于野生型SD大鼠,在感染状态下,SD大鼠外周血中T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞绝对数目均显着降低。4.流式分析Lck-/-SD大鼠外周血、脾脏、淋巴结等淋巴器官结果显示,胸腺中T细胞发育明显受损,外周次级淋巴器官中T细胞几乎完全缺失。确认SD大鼠T细胞缺陷模型构建成功。5.Lck-/-SD大鼠感染血吸虫后,对比野生型SD大鼠,其体内成虫数目、成虫宽度、长度均显着升高,同时成虫回收比例也明显升高,血吸虫累积的负担显着加重。而H&E染色、Masson染色、qPCR检测结果显示,T细胞缺失的SD大鼠,其肝脏中虫卵肉芽肿大小、面积显着降低,同时肝脏纤维化面积、大小也显着减轻,与小鼠T细胞缺失后肝脏表型一致。6.T细胞胞内转录因子染色结果显示,野生型B6小鼠血吸虫小鼠感染后,调节性T细胞比例明显上调,而野生型SD大鼠在感染后调节性T细胞显着下调,而在其他辅助性T细胞亚群中没有观察到两种宿主的差异。结论通过Lck-/-SD血吸虫感染实验,直接证明,T细胞缺失直接导致了SD大鼠天然抗血吸虫能力的显着下降或丧失,加剧了感染程度,但与此同时却减缓了肝脏的病变程度。进一步分析显示,B6小鼠易感血吸虫、SD大鼠耐受血吸虫现象可能与调节性T细胞-Treg介导的免疫耐受密切相关。该结果是对血吸虫免疫调节机制的进一步完善,同时也为临床治疗提供了新的策略和思路。
黄文铃[2]（2020）在《日本血吸虫组织蛋白酶L3与甘油醛-3-磷酸脱氢酶的免疫功能分析》文中研究指明血吸虫病是一种流行甚广、危害严重的人畜共患病。抗血吸虫病疫苗的研制对预防血吸虫病发挥重要作用。研究发现,血吸虫肺期童虫是宿主免疫攻击的主要靶标,其抗原分子被视为最佳的疫苗候选因子。本实验室前期研究已经筛选出腺苷酸激酶1（AK1）、组织蛋白酶L3（CL3）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）等105个在宿主因子影响下呈差异表达的日本血吸虫（Schistosoma japonicum,S.j）肺期童虫基因,其中SjAK1基因表达的重组蛋白可诱导50%的减虫率与40%的减卵率,但SjCL3与SjGAPDH基因的功能目前尚不明确。为此,本研究克隆表达了SjCL3与SjGAPDH,观察其在日本血吸虫不同发育时期的表达及其水平以及组织学定位,研究其单独及联合免疫对小鼠抗日本血吸虫感染的能力与可能的机制,探索其在免疫逃避及I型糖尿病治疗中的作用,为探索血吸虫与宿主的相互作用关系、抗虫靶点及血吸虫病疫苗研究增添了新内容,不仅既有理论意义,也具有现实意义。SjCL3与SjGAPDH基因经克隆表达后发现,rSjCL3与rSjGAPDH均为具活性的蛋白,酶活性分别为26822 U/g与3220 U/g;将重组蛋白分别免疫新西兰大白兔后,获得的多克隆抗血清anti-rSjCL3与anti-rSjGAPDH抗体滴度分别为1:160000与1:320000。免疫荧光化学结果显示,SjCL3主要定位于虫卵卵壳、消化道、虫体体被以及部分肌肉层;SjGAPDH主要定位于虫卵卵壳、虫体体被及绝大部分肌肉层。荧光定量PCR结果发现,SjCL3及SjGAPDH在血吸虫的各个发育阶段均有表达,其中SjCL3在虫卵中表达水平最高,在10天童虫中最低;SjGAPDH的表达水平在雄虫中最高,在18天童虫中最低。将rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫小鼠后,可诱导小鼠分别产生30.5%、37.8%、65.6%的减虫率与31.7%、38.1%、70.9%的减卵率,其肝脏肉芽肿面积减少率分别为29.5%、41.1%、74.6%,肝纤维化面积减少率分别为35.4%、52.4%、76%;但若无弗氏佐剂的作用,rSjCL3与rSjGAPDH联合免疫仅可诱导小鼠产生12.1%的减虫率与14.2%的减卵率,提示:rSjCL3不能发挥佐剂样作用。流式细胞术结果显示,rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫小鼠后,其Tregs百分率分别为3.94%、3.68%、2.61%,与弗氏佐剂对照组比较,联合免疫组Tregs百分率下降显着（P<0.05）;ELISA结果发现,3组小鼠的血清IgG1/IgG2a比值分别为0.8、0.71、0.48,均<1,表明免疫后小鼠均为Th1型偏移的免疫反应;体外研究显示,免疫血清介导的巨噬细胞对童虫的杀虫率分别是12.05%、14.08%、18.86%,与阴性血清组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。体外观察rSjCL3与rSjGAPDH在抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）对童虫的杀伤作用时发现,rSjCL3与rSjGAPDH均可通过减少巨噬细胞对童虫的黏附而破坏ADCC的杀虫作用;而且加入相应的酶抑制剂后,杀虫效果均有恢复,分别由8.17%上升至15.46%与6.1%上升至19.49%,黏附在童虫表面的巨噬细胞数分别由2.45上升至5.75个与1.43上升为6.57个,差异均具统计学意义（P<0.05）。当分别用SjCL3与SjGAPDH的dsRNA单独及联合抑制目的基因后,机械转变童虫的存活率分别为72.7%、62.5%、56.5%,与对照组比较,SjCL3组无差别,其余2组的差别显着（P<0.05）;21天童虫的存活率分别为92.77%、91.83%、90.56%,差异无统计学意义（P>0.05）;42天成虫的存活率分别为100%、96.15%、93.33%,差异也均无统计学意义（P>0.05）。此外,还构建了I型糖尿病小鼠模型,探索了rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫对糖尿病小鼠的治疗作用,结果显示:各组小鼠的血糖水平无差别（P>0.05）,血清IgG1/IgG2a比值分别为0.65、1.06、0.51。综上所述,本研究克隆表达了具有活性的肺期童虫rSjCL3与rSjGAPDH,发现两种蛋白分别定位于卵壳、消化道、体被、部分肌肉层以及与卵壳、体被及绝大部分肌肉层,表达水平最高的部位分别是虫卵与雄虫;它们能在逃避宿主免疫中发挥重要作用;重组蛋白免疫小鼠后,rSjCL3不能发挥佐剂样作用,但在弗氏佐剂的作用下其与rSjGAPDH联合可诱导小鼠产生65.6%的减虫率与70.9%的减卵率,值得进一步研究。
孙磊[3]（2020）在《γδ T细胞促进日本血吸虫感染小鼠早期肝纤维化作用及其机制研究》文中认为目的血吸虫病（schistosomiasis）是由裂体属吸虫感染而引起的一种危害严重的人兽共患寄生虫病,同时也是被忽视的重要热带病。世界上有70多个国家和地区流行血吸虫病,全球感染人数约2亿,受威胁人口约8亿人。除了影响人的生命健康,畜类血吸虫病也给经济造成了巨大的损失。我国流行的是日本血吸虫病,血吸虫病预防和治疗尚有诸多待解决的问题。感染宿主后,日本血吸虫多个发育阶段均能导致宿主损害。其中成虫在门静脉系统寄生,所产大量虫卵随血流而沉积于肝脏,诱导剧烈的炎症反应。宿主体内的先天免疫系统和适应性免疫系统先后被激活,免疫反应也由Th1型向Th2型过度,逐渐由Th2型免疫反应占优势,此时宿主肝脏组织内开始形成虫卵肉芽肿以及纤维化等免疫病理反应。CD4+T细胞、B细胞等适应性免疫细胞和巨噬细胞、NK细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和γδ T细胞等先天免疫细胞共同参与该病理的形成。γδT细胞作为一种先天免疫细胞,识别抗原无MHC限制,可以迅速对血吸虫抗原作出反应,导师课题组前期研究发现γδ T细胞和血吸虫感染小鼠肝纤维化有紧密的联系,但其确切机制尚不清楚。本研究聚焦在血吸虫感染宿主肝脏纤维化早期病变,初步探讨γδ T细胞在血吸虫感染宿主早期肝纤维化形成的机制。方法实验小鼠分为WT（Wild Type）未感染对照组、WT感染组和TCRδKO（T cell receptor δ chain knock out）感染组,小鼠腹壁贴片法感染日本血吸虫尾蚴建立小鼠感染模型。WT感染组和TCR δ KO感染组各随机取16只监测生存时间;剩余小鼠在感染后不同时间解剖,采集外周血检测肝功能,比较两组小鼠感染后肝功能变化;采用ELISA方法检测小鼠血清中细胞因子表达水平,分析各组小鼠IL-17A的表达水平;解剖分离出完整的小鼠肝脏,取适量肝组织用于提取总RNA,以未感染对照组作为参照,分析两组小鼠的肝纤维化相关指标转录水平变化;取适量肝组织固定于4%多聚甲醛,病理切片及染色,观察两组小鼠肝虫卵肉芽肿大小和纤维化程度,进一步分析TCRδ KO后对肉芽肿和纤维化的影响;取适量肝组织研磨并用裂解液裂解,离心取上清,ELISA方法检测肝细胞因子表达水平;剩余肝脏和脾脏研磨后过滤和离心,分离白细胞,进行胞膜、胞内因子和核内因子流式抗体染色,检测γδT细胞、CD11b+Gr-1+细胞及其分泌细胞因子在不同感染时间的变化,探讨γδ T细胞对相关细胞及其细胞因子分泌的影响。体外试验,经细胞因子IL-17A刺激体外培养的肝星状细胞系（LX-2）,观察IL-17A对肝星状细胞的直接激活作用。结果1.流式细胞术分析显示,血吸虫感染小鼠肝脏γδ T细胞在感染进程（0周、4周和6周）中比例变化不明显,但细胞绝对数量明显上升,分别是3.2X 104、7.3×104和9.8×105个,各组间差异具有统计学意义（P<0.0001）:同时,Vγ2亚型γδT细胞比例增多,在0周、4周和6周分别为（24.72±2.02）%、（30.36±3.47）%和（44.46±3.20）%,组间差异具有统计学意义（P<0.01）,并且该亚群细胞分泌IL-17A的比例逐渐升高,分别为（17.06±1.64）%、（25.32±4.57）%和（48.06±1.03）%,组间差异具有统计学意义（P<0.0001）。2.感染小鼠监测16周观察生存率,与WT感染组小鼠比较,TCRδ KO感染组小鼠生存率提升,且差异具有统计学意义（P<0.05）;与WT感染组小鼠比较,TCRδ KO感染组小鼠在感染4周和6周时,肝功能（ALT和AST）改善（P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05）;与WT感染组小鼠比较,TCRδ KO感染组小鼠在感染4周和6周时,脾指数下降（P<0.05,P<0.001）,在感染6周时,肝指数下降（P<0.01）。3.HE染色显示,WT组小鼠和TCRδ KO组小鼠感染6周后,肝脏单个虫卵所致肉芽肿面积分别是（1.3±0.095）×105μm2和（0.95± 0.033）×105μm2,TCR δ KO组低于WT组,且差异具有统计学意义（P<0.0001）;Masson染色显示,WT组小鼠和TCR δ KO组小鼠感染6周后,肝脏单个虫卵所致纤维化面积为（6.63±0.40）× 104 μm2 和（3.76±0.18）× 104 μm2,同样的,TCR δ KO组低于WT组,且差异具有统计学意义（P<0.0001）。4.WT组小鼠肝IL-1 7A的mRNA水平是TCR δ KO组小鼠的（3.0±0.45）倍（P<0.05）;小鼠肝组织裂解液上清中,WT组小鼠和TCRδ KO组小鼠IL-17A 的含量分别为（217.2±19.15）pg/ml 和（101.6± 18.95）pg/ml,KO 组低于WT组,差异具有统计学意义（P<0.01）。在小鼠外周血中,WT组小鼠和TCRδ KO组小鼠IL-17A的含量分别为（143.9±33.82）pg/ml和（34.0±22.29）pg/ml,同样的,KO组低于WT组,差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,TCR δ KO小鼠肝组织Col 1和TFG-β等mRNA也有所下降,而IL-13 mRNA水平无差异。5.WT感染组小鼠和TCRδKO感染组小鼠在感染进程中,感染后0、4和6周肝脏和脾脏CD11b+Gr-1+细胞比例发生变化:WT组小鼠肝脏CD11b+Gr-1+细胞分别是（1.32±0.15）%、（10.20±1.47）%和（33.64±1.09）%;WT组脾脏分别是（1.00±0.07）%、（3.20±0.02）%和（15.05±0.99）%;TCRδKO 组肝脏分别是（1.46±0.10）%、（9.80±0.81）和（22.22±1.57）%;TCRδ KO 组脾脏分别是（1.10±0.13）%、（1.60±0.07）%和（8.30±0.64）%。0周时,两组小鼠肝脏、两组小鼠脾脏CD11b+Gr-1+细胞均无差异;4周时,TCR δ KO组小鼠脾脏CD11b+Gr-1+细胞低于WT感染组,差异具有统计学意义（P<0.001）,此时两组小鼠肝脏中CD11b+Gr-1+细胞仍没有差异;6周时,TCR δ KO组小鼠肝脏和脾脏CD11b+Gr-1+细胞均低于WT感染组,差异具有统计学意义（P<0.001,P<0.001）。另一组过继试验中,向感染3周的TCR δ KO小鼠注射IL-17A,其肝脏CD11b+Gr-1+细胞比例又恢复到WT感染组水平。6.流式细胞术显示,感染6周时,WT组和TCR δ KO小鼠肝脏CD11b+Gr-1+细胞分泌 TFG-β 的比例分别为（30.20±4.01）%和（20.73±1.13）%,TCRδKO小鼠比例下降,差异具有统计学意义（P<0.01）。此外,在感染后4周,WT小鼠肝脏和脾脏CD11b+Gr-1+表达IL-17A受体的比例分别约为54.3%和26.0%,在感染后6周时,这一比例分别约为52.9%和20.3%。7.体外试验显示,肝星状细胞LX-2经IL-17A刺激后被激活,α-SMA和Col 1表达分别上调（3.7±0.7）倍（P<0.05）和（3.9±0.1）倍（P<0.0001）。8.流式细胞术显示,WT组小鼠和TCRδ KO组小鼠肝脏B细胞的比例分别为（15.56±0.75）%和（28.18±2.88）%,KO 组肝脏 B 细胞高于 WT组,差异具有统计学意义（P<0.01）;在脾脏中两组小鼠B细胞的比例为（55.48±2.01）%和（62.83±1.46）%,同样的,KO组B细胞比例高于WT组,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论1.γδ T细胞分泌IL-17A参与日本血吸虫感染早期小鼠肝脏病变进程,并加重纤维化。2.IL-17A 通过受体 IL-17RA 招募 CD11b+Gr-1+细胞,CD11b+Gr-1+细胞分泌TGF-β促进肝脏纤维化。3.IL-17A还可能直接激活肝星状细胞促进肝纤维化。
高勇强[4]（2020）在《髓源性抑制细胞在日本血吸虫病小鼠模型中的免疫调节作用》文中研究说明血吸虫病（Schistosomiasis）是一种呈世界性分布、严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,也是一种免疫病理性疾病。在中国危害最大的血吸虫病原体是日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）。在血吸虫病免疫病理形成过程中,存在多种免疫细胞和免疫分子的作用,如Th1/Th2、Th17/Treg细胞亚群的失衡,IL-1、IL-6及TNF-α等前炎性细胞因子的显着性升高,IL-4与IFN-γ细胞因子的失衡等。近年来研究发现:在寄生虫感染宿主后,体内髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC）大量增殖和聚集在病变组织中,显着抑制宿主免疫应答,从而调节过度炎症反应,但这种抑制作用也有利于虫体逃避宿主的免疫攻击。为探索MDSC在日本血吸虫感染宿主体内的分布及免疫调节作用,本研究在构建日本血吸虫病小鼠模型的基础上,采用流式细胞术鉴定、分离和分析血吸虫病模型小鼠各时期骨髓、血液、肝脏以及脾脏中的MDSC增殖状况、特性和动态水平变化;研究MDSC亚群对血吸虫病模型小鼠体内CD4+T和CD8+T细胞增殖水平的影响及作用机制;分析MDSC对Treg细胞水平的影响。从而为MDSC在日本血吸虫病小鼠模型中的免疫调节作用提供实验依据,进一步补充和完善日本血吸虫感染宿主后的免疫调节网络,为日本血吸虫病防治提供新的研究靶点和实验依据。第一部分日本血吸虫病小鼠模型中MDSC动态水平分析及亚群鉴定目的:构建日本血吸虫病小鼠模型,研究MDSC在模型小鼠不同组织中的分布和在自然病程中的动态水平变化,分离、鉴定其亚群和细胞形态。探讨MDSC在血吸虫病免疫病理过程中的动态变化。方法:1.采用血吸虫尾蚴腹部敷贴法,每只小鼠感染尾蚴30±条,构建日本血吸虫病小鼠模型,感染40只BALB/c小鼠作为实验组。同时设置正常小鼠10只作为正常对照组,在计划时间点麻醉后处死小鼠,采用HE染色和Masson染色法观察日本血吸虫病模型小鼠的肝脏病理变化。（备注:实际感染小鼠数量是计划数的120%,以防在长病程饲养和实验中因疾病或其他原因而死亡,本论文涉及到构建疾病模型的实验小鼠数量皆采取此方法计算;本论文中所有动物实验严格按照南华大学伦理委员会规定执行,实验动物在麻醉下处死,尽一切努力最大程度减少其疼痛、痛苦和意外死亡。）2.采用流式细胞术检测日本血吸虫病模型小鼠在第0w（周）,2w、4w、6w、8w、12w、16w、20w体内的血液、肝脏、脾脏和骨髓MDSC的动态水平变化,每个时间点取5只小鼠做样本。同时,正常对照组小鼠与感染组小鼠同步饲养,在感染组小鼠自然病程的第4w、8w的时间点,检测MDSC在两组小鼠体内上述四种组织中的水平。3.选取模型小鼠自然病程的第8w时间点,采用流式细胞仪分选法,以CD11bGr-1Ly6G为鉴定分子,分选出模型小鼠骨髓MDSC中表型为CD11b+Gr1+Ly6G+的粒系亚群（granulocytic MDSC,G-MDSC）和表型为CD11b+Gr1+Ly6G-的单核系亚群（mononuclear MDSC,M-MDSC）,采用Write-Giemsa染色进行形态学鉴定和分析。结果:1.模型小鼠肝脾标本肉眼观:肝脾的大体改变与日本血吸虫病肝脾病变相符。血吸虫感染第6w后肝脏呈褐色、质地变硬,表面可见明显的虫卵颗粒状结节,血吸虫感染第4w后脾脏体积开始增大;2.模型小鼠肝脏组织HE染色和Masson染色显示:BALB/c小鼠感染日本血吸虫后第4w出现炎症反应和胶原蛋白表达,第6w后肝脏出现虫卵肉芽肿病变和纤维化病变,且随时间延长病变加剧。流式细胞术检测结果显示,在第4w和第8w时,对照组正常小鼠体内肝、脾、骨髓、血液四种组织MDSC水平变化无显着性差异,P>0.05;与同期实验组（血吸虫病模型组）比较,四种组织的MDSC均显着低于实验组,P<0.05。3.在日本血吸虫病模型小鼠的自然病程中,采用流式细胞术连续检测血吸虫病模型小鼠在第0w、2w、4w、6w、8w、12w、16w、20w时,体内肝、脾、骨髓、血液四种组织的MDSC的动态水平变化,检测结果显示:血吸虫感染组小鼠体内骨髓、脾脏、肝脏、外周血等四种组织中MDSC水平较对照组正常小鼠显着性升高,P﹤0.05。在骨髓和血液组织中,MDSC在血吸虫感染后第2w出现第一个峰值;在血吸虫感染后第8w,MDSC在四种组织中达到较高水平后,一直维持在高水平状态,与日本血吸虫病模型小鼠肝脏组织病理变化的严重程度相一致,呈现出MDSC在组织的聚集状态。4.采用流式细胞仪分选法,从处于自然病程第8w时的血吸虫病模型小鼠的骨髓组织内,分离纯化出MDSC粒系亚群（granulocytic MDSC,G-MDSC）和MDSC单核系亚群（mononuclear MDSC,M-MDSC）,其中粒系亚群（G-MDSC）细胞占比约85%,单核系亚群（M-MDSC）占比约15%。Wright-Giemsa染色观察,显示粒系MDSC（G-MDSC）亚群细胞主要由中晚幼粒细胞为主的幼稚粒细胞构成,单核系MDSC（M-MDSC）亚群细胞主要由幼稚单核细胞构成。小结:在日本血吸虫病小鼠模型中,随着虫卵肉芽肿形成及炎症反应的加剧,MDSC水平显着升高,并聚集于小鼠骨髓、血液、肝脏及脾脏等组织中;MDSC呈异质性,可分为表型为CD11b+Gr1+Ly6G+的粒系MDSC亚群（granulocytic MDSC,G-MDSC）和表型为CD11b+Gr1+Ly6G-的单核系亚群（mononuclear MDSC,M-MDSC）,并以粒系亚群（G-MDSC）为主。第二部分日本血吸虫病小鼠模型中MDSC亚群分离及对CD4+T和CD8+T细胞的免疫作用研究目的:分离和纯化日本血吸虫病小鼠模型中的MDSC亚群,研究各亚群对CD4+T和CD8+T细胞的免疫抑制作用,并探讨其作用机制。方法:1.重新构建日本血吸虫病小鼠模型,分批感染45只BALB/c小鼠,置SPF动物房饲养。取病程第8w时日本血吸虫病模型小鼠12只,麻醉后处死,取模型小鼠双股骨、胫骨的骨髓组织,采用流式细胞仪分选法分选出表型为CD11b+Gr1+Ly6G-的单核系MDSC（mononuclear MDSC,M-MDSC）和表型为CD11b+Gr1+Ly6G+的粒系MDSC（granulocytic MDSC,G-MDSC）两个亚群细胞,同时采用免疫磁珠分选法分选出10只正常BALB/c小鼠脾脏的CD4+T细胞和CD8+T细胞,采用CFSE（carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester;二醋酸羧基荧光素,琥珀酰基酯）标记T细胞,将分选出的G-MDSC和M-MDSC亚群细胞分别与两种T细胞以1:2、1:4、1:8的比例混合培养72小时,实验分为3组:阴性对照组（T细胞单独培养组）、阳性对照组（活化剂Dynabeads CD3/28-T-Activator刺激的T细胞培养组）、实验组（MDSC和活化剂刺激的T细胞混合培养组）。流式细胞术检测各组CFSE染色的增殖抑制指数。2.取病程第8w时日本血吸虫病模型小鼠6只,麻醉后处死,取两侧的股骨和胫骨的骨髓组织,流式细胞仪分选法分选出BM-MDSC,q RT-PCR法检测相关细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ、TGF-β和精氨酸酶1（Arginase 1,Arg1）、诱导性一氧化氮合酶2（induced nitric oxide synthetase 2,NOS2）的m RNA表达水平。3.麻醉后处死病程第8w时日本血吸虫病模型小鼠27只和正常小鼠18只,分别提取制备骨髓MDSC,实验分4组,模型小鼠BM-MDSC加10μg/m L Sj SEA（血吸虫可溶性虫卵蛋白）刺激组,模型小鼠BM-MDSC加10μg/m L Con A（刀豆蛋白A）刺激组,模型小鼠BM-MDSC加PBS组,正常小鼠BM-MDSC加PBS组（空白对照组）。细胞培养72h,应用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）,检测培养液上清中相关细胞因子TGF-β、IL-10、IL-4和IFN-γ的表达水平。结果:1.G-MDSC和M-MDSC两种亚群细胞均能抑制CD4+T、CD8+T细胞的增殖,且呈现浓度/数量依赖性。共培养体系中MDSC数量越多,抑制T细胞增殖作用越强。G-MDSC表现的抑制作用较M-MDSC更明显。2.实时荧光定量PCR（q RT-PCR）结果显示:血吸虫模型小鼠体内MDSC表达的TGF-β、IL-10、IL-4和IFN-γ等细胞因子以及Arg 1、NOS2两种酶的m RNA水平均显着高于正常对照组,P<0.05。3.ELISA结果显示模型小鼠MDSC加SEA刺激组分泌的TGF-β、IL-10、IL-4和IFN-γ等细胞因子水平显着高于正常小鼠MDSC加PBS组。且Sj MDSC加SEA刺激组的四种细胞因子水平均高于Sj MDSC加Con A和Sj MDSC加PBS组,其中,TGF-β、IL-10的水平显着性升高,P<0.05。小结:MDSC能显着抑制CD4+T、CD8+T细胞的增殖,其中以MDSC粒系（CD11b+Gr1+Ly6G+）亚群抑制作用更强;其作用机制可能与MDSC分泌相关细胞因子TGF-β、IL-10、IL-4和IFN-γ,上调精氨酸酶1（Arg1）和诱导性一氧化氮合酶2（NOS2）的表达有关。第三部分日本血吸虫病小鼠模型中MDSC对Treg细胞的影响目的:研究日本血吸虫病小鼠模型Treg细胞在肝脾组织中的动态水平变化,分析血吸虫病免疫病理过程中MDSC与Treg细胞的相关性,探讨MDSC对Treg细胞的影响。方法:1.重新构建30只日本血吸虫病小鼠模型,流式细胞术检测模型小鼠在自然病程的第0w、4w、8w、12w、16w、20w时的肝、脾组织中Treg细胞的数量和比例,分析Treg细胞在日本血吸虫病小鼠模型体内的动态水平变化。2.采用pearson法分析模型小鼠体内同期时间点的MDSC与Treg细胞的相关性。结果:1.FCM结果显示,感染组与对照组正常小鼠比较,小鼠肝、脾组织中的Treg细胞在病程第8w,第12w,第16w时,占CD4+T细胞数量百分比显着性升高,P<0.05,具有统计学意义。Treg细胞的比例在血吸虫病病程的第8w达峰值,肝组织为37.2±3.04%,脾组织为30.2±1.2%,均显着性高于其它时间点,P<0.01。2.Pearson法分析长病程中相同时间点的MDSC和Treg细胞两者动态水平变化的相关性,二者在肝组织中r=0.429,P<0.05,脾组织中r=0.498,P<0.01。说明在肝脾组织中,两者呈中等程度的正相关,且在脾组织中表现出更大的相关性。小结:在日本血吸虫病小鼠模型中,随着肝虫卵肉芽肿病变严重程度的加剧,MDSC与Treg细胞在肝脾组织中均显着升高,两者呈中度正相关,可能在日本血吸虫病免疫病理改变中发挥抑制协同作用。总结论1.MDSC在日本血吸虫病模型小鼠骨髓、血液、肝、脾组织中显着性升高,并在外周免疫器官脾脏及病变组织肝脏中呈现明显聚集现象。2.日本血吸虫病小鼠模型体内的MDSC由粒系MDSC亚群（G-MDSC）和单核系MDSC亚群（M-MDSC）构成,以G-MDSC为主。G-MDSC与M-MDSC均可以抑制CD4+T和CD8+T细胞的增殖。其机制可能与其分泌的TGF-β、IL-10、IL-4、IFN-γ等细胞因子及上调NOS2和Arg1的表达有关。3.日本血吸虫病模型小鼠肝脾组织中的MDSC与Treg细胞呈中度正相关,可能在血吸虫病免疫病理反应中发挥免疫抑制协同作用。
战廷正[5]（2019）在《ICOSL/ICOS信号调控Th9分化介导日本血吸虫病肝纤维化的分子机制》文中提出日本血吸虫病是由日本血吸虫成虫寄生于人和哺乳动物的肠系膜下静脉而引起的严重危害人类健康的传染性疾病。从尾蚴侵入到虫卵排出均可对宿主造成损害,最主要的致病虫期为虫卵。虫卵能沉积在宿主结肠壁和肝脏等组织的小静脉内,通过释放可溶性虫卵抗原（soluble egg antigen,SEA）而引起组织出现肉芽肿并继发纤维化。其致病机制为辅助性T细胞（helper T cell,Th）介导的ⅣV型超敏反应。研究证实,Th2细胞、Th17细胞和滤泡辅助性T细胞（Follicular helperT cell,Tfh）可分别分泌特异性的细胞因子白介素4（interleukin-4,IL-4）、IL-17和IL-21发挥促进虫卵肉芽肿和纤维化形成的作用,而Th1细胞和调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）则通过分泌功能性细胞因子干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）和IL-10起相反的抑制作用。Th9细胞是一种新的Th细胞亚群,有研究发现Th9细胞参与了乙肝纤维化的发生发展过程,并在CC14诱导的小鼠肝纤维化过程中起到促进作用,但Th9细胞在日本血吸虫病引起的虫卵肉芽肿和继发的肝纤维化过程中是否发挥作用尚未阐明。ICOSL/ICOS信号与Th细胞的分化与极化密切相关。已有研究表明,该信号通路对Th2、Th17和Tfh细胞的极化具有调节作用,从而影响日本血吸虫病虫卵肉芽肿以及纤维化等免疫病理变化的发生和发展。但ICOSL/ICOS信号通路对Th9细胞的极化是否同样发挥调节作用还未见报道。本研究应用日本血吸虫尾蚴感染小鼠建立日本血吸虫病实验动物模型,通过特异性的增强ICOSL/ICOS信号通路观察该通路对Th9细胞分化和极化的影响;以及通过体内和体外实验探索Th9细胞与肝纤维化发生和发展之间的相关性;此外,通过探讨Th9与Th2不同的免疫应答特征,为进一步阐明日本血吸虫病肝纤维化发生的分子机制提供科学依据,为有效控制血吸虫病虫卵肉芽肿病变和抑制纤维化的发生提供新思路。一、日本血吸虫感染小鼠免疫病理过程中Th9及IL-9的动态变化目的:探讨宿主感染日本血吸虫后Th9细胞增殖分化的特征及其免疫调节作用。方法:应用HE染色法制作病理切片,观察并分析日本血吸虫尾蚴感染小鼠前（0周）以及感染后4周、7周、9周和12周肝脏虫卵肉芽肿的病理变化趋势;应用免疫组织化学方法观察并检测感染前后不同时期肝脏虫卵肉芽肿周围IL-9和转录因子PU.1的表达水平;应用流式细胞术分析不同感染时期的小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞中Th9细胞所占的比例;应用酶联反应吸附法检测不同感染时期的小鼠血清中细胞因子IL-9的表达水平。结果:HE染色结果显示,小鼠感染日本血吸虫后第4周出现虫卵肉芽肿,在第7周肉芽肿面积最大,随后逐渐减小;免疫组织化学法结果显示IL-9与PU.I在肝脏虫卵肉芽肿周围的表达水平在感染后4周即显着增加并于第7周达到最高水平,随后缓慢下降;流式细胞术检测结果显示小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞中Th9细胞的比例从感染后4周明显增高,感染后7周达到峰值,9-12周逐渐降低;酶联反应吸附法检测小鼠血清中IL-9的表达水平趋势与流式细胞术检测Th9细胞的趋势一致。结论:感染日本血吸虫后,小鼠Th9细胞及IL-9水平明显增加,且动态变化趋势与肝脏虫卵肉芽肿体积的变化趋势一致,表明Th9细胞及其细胞因子IL-9参与了日本血吸虫病的免疫应答并与虫卵肉芽肿的发生发展相关。二、Th9细胞在日本血吸虫病虫卵肉芽肿反应及肝纤维化形成中的作用目的:探讨宿主感染日本血吸虫后,Th9细胞及其细胞因子IL-9在肝脏虫卵肉芽肿和纤维化的发生发展过程中发挥的作用。方法:1.将18只小鼠随机分为3组:对照组、anti-IL-9组和IgG组。对照组为正常小鼠,anti-IL-9组为感染日本血吸虫尾蚴小鼠且感染后每周两次经腹腔注射100 ug anti-IL-9抗体,IgG组为感染日本血吸虫尾蚴小鼠且每周两次经腹腔注射100 ug IgG抗体。日本血吸虫感染后9周,分别应用流式细胞术检测各组小鼠脾淋巴细胞中Th9细胞的比例,ELISA测定各组小鼠血清中IL-9的浓度,HE染色方法和Masson染色法观察并分析肝脏虫卵肉芽肿的病理变化以及肝脏组织内胶原面积的变化情况。2.采用在体原位肝脏灌注法和密度梯度离心技术,分离感染前小鼠和日本血吸虫尾蚴感染7周后小鼠的原代HSCs。体外培养24小时后,将HSCs分为对照组和刺激组,对照组在DMEM完全培养基中培养,刺激组在含20ng/ml IL-9的DMEM完全培养基中培养,分别于刺激后的48小时和72小时收集细胞,用Western blotting技术分析检测HSCs中α-SMA、Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ蛋白的表达水平。结果:感染9周后anti-IL-9组和IgG组小鼠肝脏均出现明显的虫卵肉芽肿性炎症和纤维化病变。但与IgG组相比,体内阻断IL-9后小鼠肝脏脾淋巴细胞中Th9细胞的比例以及血清中IL-9的浓度显着下降,并且肝脏虫卵肉芽肿病变和纤维化程度均明显减轻。体外IL-9诱导实验结果显示,在感染前（0周）和感染后7周,分离的原代HSCs经IL-9体外刺激后α-SMA、Collagen-1、Collagen-Ⅲ蛋白的表达水平均明显高于对照组。结论:Th9/IL-9可促进日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的发生和发展,其调控机制可能是通过激活HSCs来实现的。三、日本血吸虫病免疫病理进程中Th9先于Th2发挥免疫调节作用目的:探讨Th9与Th2细胞在日本血吸虫病免疫病理进程中相互之间的免疫网络调节效应。方法:应用流式细胞术检测日本血吸虫尾蚴感染小鼠前（0周）以及感染后4周、7周、9周和12周脾脏CD4+ T淋巴细胞中Th9细胞和Th2细胞所占的比例的变化趋势;应用酶联反应吸附法检测不同感染时期的小鼠血清中细胞因子IL-9和IL-4的表达水平;应用免疫组织化学方法观察并检测感染不同时期小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围炎症细胞中IL-9和IL-4的表达水平。结果:流式细胞术检测结果显示小鼠感染日本血吸虫后脾淋巴细胞中Th9细胞的比例从第4周开始明显增高并在7周达到峰值,9-12周逐渐下降。Th2细胞则在感染后持续上升,直到12周达到峰值;ELISA与流式细胞术以及免疫组织化学结果保持一致,在小鼠血清和肝脏组织中IL-9的表达的峰值出现在感染后7周,IL-4表达的峰值则出现在感染后12周。结论:在日本血吸虫病的免疫病理过程中,Th9/IL-9可能比Th2/IL-4更早的发挥免疫调节作用。四、ICOSL/ICOS信号通路在小鼠日本血吸虫病免疫病理进程中对Th9细胞和Th2细胞的调控作用目的:探讨ICOSL/ICOS共刺激信号对小鼠日本血吸虫病致病过程中Th9细胞和Th2细胞分化增值的免疫调控作用。方法:应用流式细胞术检测日本血吸虫尾蚴感染前（0周）以及感染后4周、7周、9周和12周ICOS-Tg小鼠及其野生型对照小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞中Th9细胞和Th2细胞所占的比例;应用ELISA检测不同感染时期ICOS-Tg小鼠及其野生型小鼠血清中细胞因子IL-9和IL-4的表达水平;应用免疫组织化学方法观察并检测不同感染时期的ICOS-Tg小鼠及其野生型小鼠肝脏虫卵肉芽肿IL-9和IL-4的表达水平。结果:流式细胞术检测结果显示,日本血吸虫感染后ICOS-Tg小鼠与其野生型小鼠相比,Th9细胞在4周、7周和9周显着增高,Th2细胞在7周和9周明显上调;ELISA结果显示,日本血吸虫感染后ICOS-Tg小鼠血清中IL-9在4周、7周、9周和12周的表达以及IL-4在7周的表达显着高于感染同期野生型小鼠;免疫组织化学结果显示,日本血吸虫感染后ICOS-Tg小鼠肝脏中IL-9在4周、7周、9周和12周的表达以及IL-4在7周、9周和12周的表达均明显高于同期野生型对照小鼠。结论:上调ICOSL/ICOS信号通路可促进日本血吸虫病免疫应答过程中Th9细胞和Th2细胞的分化和增殖。本研究结果表明:Th9细胞极化在日本血吸虫病免疫病理过程中发挥着重要的作用,Th9细胞及其功能因子IL-9能促进日本血吸虫病肉芽肿和肝纤维化发生和发展。通过特异性的增强或减弱ICOSL/ICOS信号通路可调控Th9细胞的极化,从而为有效控制血吸虫病肉芽肿和肝纤维化病变以及防止晚期肝硬化的发生发展提供新思路。
金鑫[6]（2016）在《阻断PD-1信号可增强日本血吸虫感染小鼠Th2型免疫反应并加重其肝脏免疫病理》文中认为血吸虫病是一种严重危害人类健康及社会发展的人兽共患寄生虫病,全球有2亿多人感染血吸虫,继而导致严重疾病甚至死亡。血吸虫病的主要免疫病理损害是由沉积于肝脏中的虫卵引起的虫卵肉芽肿和肝脏纤维化。但宿主免疫系统存在多种免疫负调节机制,可通过抑制宿主体内过度的免疫反应从而防止肝脏迅速发生严重的病理损害。CD4+T细胞及其亚群不仅参与血吸虫病中肝脏免疫病理的形成,亦可对其调控发挥重要作用。大量研究表明,主要表达于T细胞上的程序性死亡受体PD-1（programmed death 1 receptor,PD-1）活化后,可使T细胞功能被显着抑制,从而产生多种免疫负调节效应。但是,在血吸虫感染过程中,PD-1信号能否调控肝脏免疫病理损害及可能的机制,至今仍不清楚。本研究首先证实日本血吸虫感染病人外周血CD4+T细胞上PD-1的表达显着上调;此外,本研究也发现日本血吸虫感染小鼠的CD4+T细胞上PD-1的动态表达特点,即随感染进程而持续增高,且至慢性期一直保持较高水平表达。进一步体外实验结果提示,虫卵来源的抗原SEA（soluble egg antigens,SEA）可能是诱导CD4+T细胞上PD-1表达增加的最主要因素。此外,通过阻断抗体（anti-PD-1 Ab）在感染小鼠体内封闭PD-1信号后,Th2型免疫反应显着增强,且小鼠肝脏免疫病理损害也进一步加重,但小鼠肝脏内沉积的虫卵数与对照组相比并无差异。从而,本研究的结果提示了 PD-1信号对血吸虫感染导致的肝脏免疫病理损害有重要的调控作用。综上,本研究发现血吸虫虫卵抗原可诱导CD4+T细胞上PD-1表达增加,选择性削弱了 Th2型免疫反应从而减轻血吸虫感染导致的肝脏免疫病理损害。因此,以上研究结果为设计以PD-1为靶点的肝脏免疫病理干预策略提供了新的思路。
周春雷[7]（2015）在《日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞功能分化的研究》文中进行了进一步梳理日本血吸虫病（Schistosomiasis japonica）严重危害人体健康,截止到2012年底,我国大约还有24万的血吸虫病患者。血吸虫的生活史复杂,其在体内发育的各个阶段的排泄分泌抗原都可以引起的宿主免疫病理反应,其中Th1/Th2型细胞应答在感染过程中发挥重要作用。肝脏虫卵肉芽肿反应以及继发的肝纤维化是血吸虫病的主要病理损伤。HSCs（hepatic stellate cells,肝星状细胞）的活化是肝纤维化发生的中心环节。除了已经被证实具有储存脂滴和参与纤维化的功能外,HSCs还有其他重要的功能如参与肝脏免疫反应等。近来的研究发现,HSCs在肝脏中具有异质性和可塑性,存在不同细胞表型和功能的亚群。因此,研究在日本血吸虫感染过程中,不同亚群的HSCs发挥的功能作用,有助于加深对肝纤维化发病机制的认识。吡喹酮（Praziquantel）作为首选的抗血吸虫药物,具有高效、低毒、副作用少的特点。除对吸虫、绦虫等蠕虫具有杀虫作用外,近年来有研究者提出吡喹酮可以直接作用于宿主组织和细胞发挥药效。本实验室前期研究发现,在日本血吸虫感染小鼠模型中,吡喹酮长疗程治疗可以抑制肝脏纤维化的发展。本研究将从不同亚群的HSCs入手,研究吡喹酮对其功能的影响,进一步揭示吡喹酮发挥抗纤维化作用的机制。miRNA（microRNA,小RNA）是一类高度保守的非编码小RNA,通过其种子序列与靶基因的3’UTR端互补序列结合,抑制靶基因的转录后翻译过程,从而调控一系列生理和病理过程。miRNA在多种因素引起的肝病及肝纤维化的发生发展中发挥重要的调控作用。研究发现,miRNA-454在日本血吸虫感染过程中表达下降,通过与靶基因smad4的3’UTR端互补,可以抑制HSCs的活化。我们通过观察日本血吸虫感染过程中HSCs miRNA的动态变化,分析参与HSCs活化的miRNA,及其在不同HSCs亚群中可能发挥的调控作用。本课题以HSCs为研究对象,研究其在日本血吸虫感染过程中的功能特征。首先,我们建立了日本血吸虫感染小鼠模型,观察感染过程中HSCs的功能亚群分化特征及其可能机制;接着,我们建立日本血吸虫病慢性期小鼠模型,给予吡喹酮长疗程治疗,观察其对不同HSCs亚群功能的影响;最后,我们利用miRNA表达谱芯片,研究感染过程中HSCs miRNA的动态变化,寻找与功能分化相关的miRNA。本研究获得如下主要结果:1.日本血吸虫感染过程中活化的HSCs具有功能可塑性本研究发现,感染过程中HSCs表面MHC II类分子及免疫共刺激分子CD80、CD86、B7-H1表达明显上调,提示活化的HSCs具有免疫细胞的功能,参与肝脏免疫应答;同时,感染过程中HSCs的α-SMA、Col1a1的基因表达水平也明显上升,提示活化的HSCs具有肌成纤维样细胞的功能,发挥促纤维化作用。以上结果提示,日本血吸虫感染过程中活化的HSCs功能具有可塑性。2.日本血吸虫感染过程中活化的HSCs功能分化,可以分为MHC II+/-两群HSCs文献报道,HSCs在肝脏不同位置、正常或肝损伤时存在功能差异,其结构和功能具有异质性。我们推测在日本血吸虫感染过程中活化的HSCs功能分化,存在不同的细胞亚群。我们利用磁珠分选的方法,以MHC II类分子为标记,将日本血吸虫感染小鼠HSCs分为MHC II+/-两群HSCs。研究发现,MHC II+/-两群HSCs的LRAT、维生素A表达的水平无统计学差异,提示在日本血吸虫感染过程中MHC II+/-两群HSCs都是来源于静息态HSCs,参与维生素A的储存和代谢功能。而MHC II-HSCs表达α-SMA的水平明显高于MHC II+HSC,提示两群细胞活化后的状态存在异质性,MHC II-HSCs具有肌成纤维样细胞的特征。进一步研究MHC II+/-两群HSCs功能,我们发现在感染过程中MHC II+HSCs表面CD80、CD86、B7-H1表达水平明显高于MHC II-HSCs,而MHC II-HSCs的α-SMA、Col1a1、TIMP1表达水平明显高于MHC II+HSC。上述研究结果提示,在日本血吸虫感染过程中存在细胞表型和功能异质性的MHC II+/-两群HSCs,MHC II+HSCs具有免疫学功能,参与T淋巴细胞应答,MHC II-HSCs具有肌成纤维样细胞功能,发挥促纤维化作用。3.血吸虫感染过程中MHC II+/-两群HSCs的功能分化可能受IFN-γ调控本研究发现,在日本血吸虫感染过程中,IFN-γ在感染早期表达水平开始上升,与HSCs MHC II类分子的表达具有时间一致性,推测HSCs的功能分化可能与IFN-γ有关。体外用IFN-γ刺激各种不同状态的HSCs,均可以上调MHC II和CIITA的表达水平,下调纤维化相关Col1a1基因的表达水平;IFN-γ-/-小鼠感染血吸虫后相比于野生型小鼠HSCs MHC II的表达水平明显下降。以上结果表明,IFN-γ可以诱导HSCs细胞表型改变,促进MHC II-HSCs向MHC II+HSCs的转化,提示日本血吸虫感染过程中HSCs的功能分化可能受IFN-γ调控。4.吡喹酮通过作用于MHC II-HSCs,发挥抗纤维化功能最近有学者认为,吡喹酮可以直接作用于宿主的组织和细胞发挥药效。本实验室前期研究发现,在日本血吸虫感染小鼠模型中,吡喹酮长疗程治疗可以抑制肝纤维化的发展。我们通过对感染慢性期（12W）小鼠进行持续4W的吡喹酮长疗程治疗,观察吡喹酮对不同亚群的HSCs影响。结果发现,吡喹酮可以抑制HSCs MHC II类分子和CD86的表达。结合前期的研究结果推测,吡喹酮可以通过抑制Th1类细胞因子IFN-γ的分泌,下调MHC II类分子的表达。同时,吡喹酮还能抑制MHC II-HSCs纤维化相关基因α-SMA、Col1a1、Timp1的表达,提示吡喹酮抗纤维化功能与MHC II-HSCs有关。进一步研究吡喹酮对MHC II+/-两群HSCs功能影响的可能机制,我们观察了吡喹酮治疗后两群细胞的凋亡情况,结果发现MHC II+/-两群HSCs不存在凋亡率升高或降低现象。以上结果提示,吡喹酮发挥抗纤维化作用是通过作用于MHC II-HSCs,下调其纤维化相关基因表达,并不影响HSCs的凋亡。5.感染过程中HSCs的miRNA动态表达谱及与功能分化相关的miRNA为了研究在日本血吸虫感染过程中HSCs miRNA的动态变化,以及差异miRNA在不同HSCs亚群中可能发挥的调控作用,我们利用miRNA表达谱芯片检测,结果发现日本血吸虫感染早期,HSCs miRNA表达已发生明显变化,其中17个miRNA表达上调、22个miRNA表达下调。进一步利用pathway分析差异miRNA,发现富集度高的信号通路包括MAPK信号通路、调节肌动蛋白细胞骨架信号通路、PI3K-AKT信号通路等。在日本血吸虫感染过程中,可能与HSCs促纤维化功能和免疫功能相关的差异miRNA包括miR-21a-3p、miR-21a-5p、miR-146b-5p、miR-29c-3p、以及miR-217-3p。靶基因预测发现miR-21a-5p与smad7的3’UTR端结合互补,抑制smad7的翻译;而miR-217-3p可以与STAT1的3’UTR端结合互补,抑制STAT1的翻译。qRT-PCR检测miRNA的表达水平,结果发现miR-21a-5p在感染过程中持续升高,且在MHC II-HSCs中表达水平明显高于MHC II+HSCs,提示miR-21a-5p可能通过活化TGF-β/Smad信号通路,促进HSCs向MHC II-HSCs转化;miR-217-3p在感染过程中表达下降,且在MHC II+HSCs中表达水平低于MHC II-HSCs,提示miR-217-3p可能通过活化IFN-γ/STAT1信号通路,促进HSCs向MHC II+HSCs转化。miRNA可能通过调控转录后翻译水平,参与调控MHC II+/-两群HSCs功能分化。综上所述,本研究发现,在日本血吸虫感染过程中活化的HSCs存在异质性,可以分为MHC II+/-两群HSCs,且在感染过程中的功能分化可能受IFN-γ调控;利用吡喹酮长疗程治疗模型,发现吡喹酮主要通过作用于MHC II-HSCs,通过下调纤维化相关基因表达从而发挥抗纤维化作用;同时,利用miRNA芯片分析感染过程中HSCs的动态表达谱,初步揭示了可能调控分化的miRNA。研究结果有助于我们从一个新的角度认识日本血吸虫感染过程中HSCs的功能,为抗纤维化治疗提供新的理论基础和实验依据。
段明明[8]（2014）在《日本血吸虫SJCHGC06822分子调节肝虫卵肉芽肿炎症反应的初步研究》文中认为血吸虫病与利什曼原虫病、疟疾、丝虫病、锥虫病和麻风病共同确定为六大重点热带病,至今仍是亟待解决的公共卫生问题之一。肝脏虫卵肉芽肿是血吸虫感染的一个重要病理特征,其病理基础是虫卵及其孵化毛蚴释放抗原刺激宿主免疫系统,引发的由CD4+T细胞介导的,虫卵周围大量的炎性细胞浸润为特征的超敏反应。研究表明含EF-hand手性域的分子可以诱导小鼠模型产生一定的抗血吸虫免疫病理保护,而其免疫调节机制仍不清楚。因此我们挖掘大量已有数据,发现日本血吸虫EF手性分子SJCHGC06822分子可能通过APC提呈活化不同的CD4+T细胞,调节日本血吸虫肝脏虫卵肉芽肿炎症反应。本研究旨在探索日本血吸虫SJCHGC06822分子调节虫卵周围炎性反应的机制。1、日本血吸虫SJCHGC06822基因的克隆、生物信息学分析、原核表达以及免疫原性初步鉴定。利用分子生物学技术克隆和表达日本血吸虫SJCHGC06822分子,生物信息学分析该分子结构,His-Ni柱纯化rSJCHGC06822/His蛋白,制备小鼠多抗,western blot分析该蛋白免疫原性。依据Genbank载入序列设计引物,PCR成功扩增出591bp完整的ORF序列,并构建了pET28a（+）-SJCHGC06822质粒,测序及双酶切证明插入序列及方向正确。Blastp分析显示该分子与日本血吸虫21.7kDa相似度高达97%,并与日本血吸虫Sj22.6,曼氏血吸虫Sm21.7蛋白相似度大于80%,ScanProsite分析该分子在37-72aa处有一个明显的EF-hand结构域,SignalP和TMHMM分析该分子无信号肽和跨膜结构。将重组质粒导入大肠杆菌原核表达系统,经IPTG诱导、His-Ni柱纯化得到可溶性表达的23kDa的rSJCHGC06822/His蛋白。Western blot分析该蛋白免疫原性较好,制得的小鼠多抗能很好识别42d、35d、23d、14d和10d天然虫体蛋白。该部分为后续试验奠定了基础。2、rSJCHGC06822/His蛋白免疫保护试验评价及虫卵肉芽肿模型的建立。用rSJCHGC06822/His蛋白结合ISA206佐剂免疫Balb/c小鼠进行保护试验,并依此建立虫卵肉芽肿模型,制作6周和8周肝脏HE病理切片。结果显示rSJCHGC06822/His蛋白诱导了30.36%、40.26%的减虫率（p<0.01）和30.14%、12.28%（p<0.01）的减卵率,ELISA检测血清抗体亚型显示,该重组蛋白在小鼠体内诱导了高水平的IgG抗体。而IgG2a、IgG1亚型水平随着三次免疫升高,感染后出现下降趋势。免疫和感染后IgG2a/IgG1比值（<1）持续升高,IgE持续升高。提示日本血吸虫SJCHGC06822分子能够诱导Balb/c小鼠产生Thl型抗体免疫应答。病理学HE切片显示与PBS对照组相比rSJCHGC06822/His蛋白免疫6周能够募集更多的炎性细胞,且组织坏死率较低；8周rSJCHGC06822/His蛋白免疫组纤维化弱,且募集炎性细胞能力下降,但仍高于对照组。3、日本血吸虫SJCHGC06822蛋白诱导致敏小鼠淋巴细胞反应。测rSJCHGC06822/His蛋白免疫Balb/c小鼠淋巴细胞淋巴细胞亚群状况,再用去除LPS的该蛋白刺激致敏Balb/c小鼠淋巴细胞,检测细胞因子胞内分泌图式及增值状况。结果显示,SJCHGC06822可以活化CD4细胞；rSJCHGC06822/His蛋白能够刺激致敏淋巴细胞增殖,同时分泌较高水平的INF-γ,提示SJCHGC06822分子可以诱导Balb/c小鼠产生Thl型细胞免疫应答。4、免疫组化检测虫卵肉芽肿周围Foxp3动态表达。结果显示,PBS对照组单虫卵周围Foxp3在6周时反应弱,8周时变强。而rSJCHGC06822/His蛋白免疫组中6周时反应强阳性,8周时变弱。但较对照组反应仍强。表明SJCHGC06822分子可以活化CD4+CD25+Treg细胞,且CD4+CD25+Treg细胞活化可能抑制SJCHGC06822过度活化的Thl型免疫应答。综上所述,本研究克隆表达了日本血吸虫SJCHGC06822基因,纯化得到rSJCHGC06822/His蛋白,且证明该蛋白具有较好免疫原性。SJCHGC06822分子可以诱导Balb/c小鼠产生Thl型免疫应答,并可以同时活化CD4+CD25+Treg细胞,它可能参与调解肝脏虫卵肉芽的肿炎症过程。
张丽[9]（2014）在《日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj26GST）疫苗的构建及其免疫应答的动态观察》文中研究指明目的采用分子生物学技术构建重组Bb（pGEX-Sj26GST）疫苗，利用分子免疫学技术研究该疫苗免疫BALB/c鼠诱导的动态免疫应答，以期为血吸虫病的防治提供一种新型、安全、有效的疫苗。方法家兔感染Sj尾蚴42d后剖杀，经门静脉灌注法收集Sj成虫，以用RNeasy Mini试剂盒抽提到的成虫总RNA为模板，RT-PCR法扩增Sj26GST抗原编码基因；从本室保存的重组菌BL21中抽提载体质粒（pGEX-1λT）；利用T4DNA连接酶将抗原编码基因与载体连接，得到重组质粒pGEX-Sj26GST；将重组质粒电穿孔转化Bb得到重组Bb（pGEX-Sj26GST）疫苗，再将重组质粒转化至E.coli BL21（DE3）中，经TPTG诱导后，利用SDS-PAGE和Western blot研究其表达效率。将88只BALB/c鼠随机分为两组，每组44只，分别经皮下注射（SC组）和鼻腔粘膜（IN组）接种重组疫苗免疫小鼠，在免疫后020周，每2周每组随机剖杀4只小鼠，取眼球血，用常规ELISA法检测血清抗体IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgE，双抗体夹心ELISA法检测血清细胞因子；无菌取脾，制备悬浮脾细胞，用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测脾细胞增殖、流式细胞仪（FACsort）检测T细胞亚群和脾细胞凋亡、双抗体夹心ELISA法检测脾细胞上清液中细胞因子（IFN-γ、IL-10和IL-17）的动态变化。结果RT-PCR扩增出676bp的Sj26GST抗原编码基因；双酶切证实Sj26GST抗原编码基因成功插入pGEX-1λT载体中，在重组Bb疫苗中，经PCR扩增得到长度为676bp的目的基因片段；SDS-PAGE分析提示重组质粒pGEX-Sj26GST经IPTG诱导后，可在E.coli BL21（DE3）中表达大小约52kDa的融合蛋白，薄层扫描分析示表达的融合蛋白约占总菌体蛋白的20%，且在诱导后35h表达量较高，Western blot表明该融合蛋白可被Sj感染的兔血清识别。SC组小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA水平分别于免疫后8、6、10、8、10和10周达最大值（P<0.01或P<0.05）；IN组IgG、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA分别于免疫后6、10、4、12和6周达峰值（P<0.01或P<0.05），IgG1在整个过程中升高不明显，且于1620周轻微下降；两组均未检测到IgE。SC组小鼠血清IFN-γ于4周升高明显并达峰值，IN组于10周达最大值（P<0.01或P<0.05）；SC组IL-17于68周显着升高并达峰值；IN组于4周达最大值（P<0.05），两组均未检测到IL-10。SC组小鼠脾细胞增值水平于免疫后8W达最高水平；IN组于免疫后4W达最大值（P<0.01或P<0.05）。SC组和IN组CD4+T细胞均于8W达峰值（P<0.01或P<0.05）；两组CD8+T细胞分别于8W和6W达较高值（P>0.05）。SC组脾细胞凋亡水平于免疫后2W达最大值（P<0.01或P<0.05）；IN组于4周达峰值（P<0.01）。与0W比，SC组和IN组脾细胞上清液中IFN-γ水平均于免疫后2W达峰值（P<0.01）；SC组和IN组IL-17水平分别于14W和12W达较高水平（P<0.01或P<0.05）；两组均未检测到IL-10。结论成功构建了日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj26GST）疫苗；重组质粒pGEX-Sj26GST可在大肠埃希菌BL21中获得表达，且表达的融合蛋白具有特异的抗原性；该重组疫苗可诱导小鼠产生有效的免疫应答。
彭微,汪世平,郑长黎,宋海鹏,刘怀[10]（2012）在《日本血吸虫pVAX1/SjRPS4·CB多价疫苗免疫对小鼠肝脏虫卵肉芽肿形成的影响》文中认为目的观察血吸虫pVAX1/SjRPS4.CB多价疫苗诱导免疫对小鼠肝脏虫卵肉芽肿大小的影响。方法 55只昆明小鼠随机分成5组。PBS对照组、pVAX1空质粒组、pVAX1/SjRPS4单价疫苗组、pVAX1/SjCB单价疫苗组、pVAX1/SjRPS4.CB多价疫苗组,每组小鼠在左后腿股四头肌肌注100μg相应质粒或等量PBS。每隔2周加强免疫1次,共3次。末次免疫后2周经腹部皮肤攻击感染日本血吸虫尾蚴。感染后第6周剖杀小鼠,取出肝脏,常规切片染色,光镜下进行组织学观察及单个虫卵肉芽肿大小的测量。结果与对照组相比,pVAX1/SjRPS4.CB多价疫苗免疫组虫卵肉芽肿平均周长和面积明显减小（P<0.05）。形态学观察免疫小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围仅有少量的嗜酸性粒细胞聚集,很少见到胶原纤维。结论 pVAX1/SjRPS4.CB多价疫苗具有明显抑制肝脏血吸虫卵肉芽肿的效果。
二、免疫耐受对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、免疫耐受对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响（论文提纲范文）
（1）T淋巴细胞在SD大鼠抗血吸虫疾病中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 T淋巴细胞主导的免疫调节在血吸虫疾病中的作用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略语对照表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）日本血吸虫组织蛋白酶L3与甘油醛-3-磷酸脱氢酶的免疫功能分析（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 主要缩略语 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 SjCL3与SjGAPDH基因的分子生物学信息分析、克隆表达及重组酶的活性测定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 SjCL3与SjGAPDH在日本血吸虫不同发育时期的表达水平及其组织学定位 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三章 rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫小鼠对抗日本血吸虫感染的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四章 rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫小鼠对抗日本血吸虫感染的机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第五章 SjCL3与SjGAPDH在日本血吸虫免疫逃避及生长发育中的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第六章 rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫在治疗I型糖尿病中的作用及机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 现存问题与局限性 |
| 展望 |
| 综述 血吸虫病早期诊断技术的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果 |
| 致谢 |
（3）γδ T细胞促进日本血吸虫感染小鼠早期肝纤维化作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 日本血吸虫感染小鼠早期γδ T细胞的表型 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备和器材 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 日本血吸虫尾蚴 |
| 1.2.2 实验动物及感染 |
| 1.2.3 小鼠肝脏白细胞分离 |
| 1.2.4 细胞胞外染色 |
| 1.2.5 胞内细胞因子染色 |
| 1.2.6 流式染色方案 |
| 1.2.7 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 日本血吸虫感染小鼠肝脏白细胞分选后鉴定 |
| 2.2 日本血吸虫感染早期小鼠γδT细胞及其亚型的表达 |
| 2.3 日本血吸虫感染早期小鼠γδT细胞细胞因子的表达 |
| 2.3.1 小鼠肝脏Vγ1亚型γδT细胞表达IFN-γ |
| 2.3.2 小鼠肝脏Vγ2亚型γδT细胞表达IFN-γ和IL-17A |
| 2.3.3 小鼠肝脏γδT细胞不表达TNF-α与GM-CSF |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 γδT细胞促日本血吸虫感染小鼠早期肝纤维化 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备和器材 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 日本血吸虫尾蚴 |
| 1.2.2 实验动物及感染 |
| 1.2.3 RNA提取 |
| 1.2.4 RNA反转录 |
| 1.2.5 RT-qPCR |
| 1.2.6 感染小鼠血吸虫成虫和肝脏虫卵计数 |
| 1.2.7 HE染色 |
| 1.2.8 Masson染色 |
| 1.2.9 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 日本血吸虫感染TCR δ KO小鼠生存率比WT小鼠明显提高 |
| 2.2 日本血吸虫感染TCRδ KO小鼠肝脾指数比WT小鼠降低 |
| 2.2.1 脾脏指数变化 |
| 2.2.2 肝脏指数变化 |
| 2.3 日本血吸虫感染TCR δ KO小鼠肝功能比WT小鼠改善 |
| 2.4 日本血吸虫感染TCRδ KO小鼠纤维化比WT小鼠减轻 |
| 2.5 日本血吸虫感染TCR δ KO小鼠纤维化相关基因表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 γδ T细胞促进日本血吸虫感染早期纤维化机制的研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备和器材 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 日本血吸虫尾蚴 |
| 1.2.2 实验动物及感染 |
| 1.2.3 小鼠肝脏和脾脏白细胞分离 |
| 1.2.4 细胞胞外染色 |
| 1.2.5 胞内细胞因子染色 |
| 1.2.6 Treg细胞染色 |
| 1.2.7 RNA提取 |
| 1.2.8 RNA反转录 |
| 1.2.9 RT-qPCR |
| 1.2.10 ELISA 试验 |
| 1.2.11 细胞因子注射实验 |
| 1.2.12 流式染色方案 |
| 1.2.13 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 日本血吸虫感染TCRδKO小鼠中IL-17A表达量下调 |
| 2.2 日本血吸虫感染小鼠γδT细胞对CD11b~+Gr-1~+的影响 |
| 2.2.1 日本血吸虫感染WT和TCRδKO小鼠肝脏中CD11b~+Gr-1~+细胞动态变化 |
| 2.2.2 日本血吸虫感染WT和TCR δ KO小鼠脾脏中CD11b~+Gr-1~+细胞动态变化 |
| 2.2.3 日本血吸虫感染TCR δ KO小鼠过继IL-17A试验 |
| 2.3 日本血吸虫感染小鼠肝脏γδT细胞招募CD11b~+Gr-1~+细胞机制 |
| 2.4 日本血吸虫感染小鼠肝脏CD11b~+Gr-1~+细胞促进纤维化机制 |
| 2.5 日本血吸虫感染小鼠γδT细胞促进纤维化其它可能机制探索 |
| 2.6 日本血吸虫感染WT和TCR δ KO小鼠T细胞和B细胞、Th1、Th2、Th17以及巨噬细胞、DC和Treg细胞比例 |
| 2.6.1 日本血吸虫感染WT和KO小鼠肝脏T细胞和B细胞的比例 |
| 2.6.2 日本血吸虫感染WT和TCR δ KO小鼠脾脏T细胞和B细胞的比例 |
| 2.6.3 日本血吸虫感染WT和TCRδKO小鼠脾脏Th1、Th2和Th17细胞的比例 |
| 2.6.4 日本血吸虫感染WT和TCRδ KO小鼠巨噬细胞、DC细胞和Treg细胞的比例 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读博士期间发表文章 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（4）髓源性抑制细胞在日本血吸虫病小鼠模型中的免疫调节作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略语中英文索引 |
| 绪论 |
| 第一部分 日本血吸虫病小鼠模型中MDSC动态水平分析及亚群鉴定 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验动物和主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 日本血吸虫病小鼠模型的构建 |
| 2.3.2 HE和 Masson染色观察日本血吸虫病小鼠模型肝组织的病理变化 |
| 2.3.3 FCM检测日本血吸虫病模型小鼠体内四种组织MDSC的动态水平 |
| 2.3.4 FCM分选及Giemsa染色鉴定小鼠模型中骨髓MDSC粒系和单核系亚群 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 日本血吸虫病小鼠模型肝脏和脾脏的病理变化 |
| 3.1.1 日本血吸虫病小鼠模型肝脏和脾脏的大体改变 |
| 3.1.2 日本血吸虫病小鼠模型肝脏组织的HE染色 |
| 3.1.3 日本血吸虫病小鼠模型肝脏组织的Masson染色 |
| 3.2 流式细胞术检测日本血吸虫感染小鼠体内MDSC动态水平变化 |
| 3.2.1 FCM检测Sj模型小鼠、对照组正常小鼠MDSC水平 |
| 3.2.2 FCM检测Sj模型组小鼠MDSC动态水平 |
| 3.3 FCM分选日本血吸虫病小鼠模型骨髓MDSC亚群 |
| 3.4 日本血吸虫病小鼠模型骨髓粒系和单核系MDSC亚群细胞的形态学鉴定 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 第二部分 日本血吸虫病小鼠模型中MDSC亚群分离及对CD4+T和CD8+T细胞的免疫作用研究 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 其他实验用试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 日本血吸虫病小鼠模型的构建 |
| 2.4.2 免疫磁珠法分选CD4+T和CD8+T细胞 |
| 2.4.3 CD4+T和CD8+T细胞的CFSE染色 |
| 2.4.4 日本血吸虫病小鼠模型骨髓MDSC亚群细胞的分离与纯化 |
| 2.4.5 MDSC亚群对CD4+T和CD8+T细胞增殖抑制试验 |
| 2.4.6 qRT-PCR检测相关细胞因子及Arg1、NOS2 mRNA的水平 |
| 2.4.7 ELISA检测相关细胞因子水平 |
| 2.4.8 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 MDSC亚群对CD4+T和CD8+T细胞的增殖抑制实验 |
| 3.2 PCR检测相关细胞因子及Arg1、NOS2酶的mRNA水平 |
| 3.3 ELISA检测相关细胞因子的表达水平 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 第三部分 日本血吸虫病小鼠模型中MDSC对Treg细胞的影响 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 主要实验动物和试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 日本血吸虫病小鼠模型的构建 |
| 2.3.2 FCM检测血吸虫病小鼠模型肝脏和脾脏Treg细胞动态水平 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 FCM检测血吸虫病小鼠模型肝脾组织的Treg细胞动态水平 |
| 3.2 日本血吸虫病小鼠模型体内MDSC与 Treg细胞相关性分析 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| References |
| 攻读博士学位期间课题与论文 |
| 一、研究及参与课题 |
| 二、发表论文 |
| 课题资助 |
| 致谢 |
（5）ICOSL/ICOS信号调控Th9分化介导日本血吸虫病肝纤维化的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 一、日本血吸虫感染小鼠免疫病理过程中TH9及IL-9的动态变化 |
| (一) 主要试剂与材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 结果 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 二、TH9细胞在日本血吸虫病肝纤维化中的作用 |
| (一) 主要试剂与材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 结果 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 三、日本血吸虫病免疫病理进程中TH9先于TH2发挥免疫调节作用 |
| (一) 主要试剂与材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 结果 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 四、ICOSL/ICOS信号通路在日本血吸虫感染小鼠免疫病理进程中对TH9细胞和TH2细胞的调控作用 |
| (一) 主要试剂与材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 结果 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 英文缩写词表 |
| 常用试剂的配置 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 博士学习期间已发表和待发表的论文 |
| 基金项目 |
| 致谢 |
（6）阻断PD-1信号可增强日本血吸虫感染小鼠Th2型免疫反应并加重其肝脏免疫病理（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录1 引物列表 |
| 附录2 英文缩略词表 |
| 附录3 硕士在读期间参加活动及成绩 |
| 硕士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（7）日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞功能分化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 主要英文缩写词 |
| 承担课题及发表文章情况 |
| 致谢 |
（8）日本血吸虫SJCHGC06822分子调节肝虫卵肉芽肿炎症反应的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 日本血吸虫生物学概述 |
| 1.1.1 血吸虫及血吸虫病 |
| 1.1.2 日本血吸虫生活史 |
| 1.2 血吸虫体被结构及体被蛋白 |
| 1.3 宿主对血吸虫抗原的免疫应答 |
| 1.4 CD4~+T细胞在日本血吸虫免疫病理调节中的作用 |
| 第二章 日本血吸虫SJCHGC06822基因的克隆、表达以及免疫原性初步鉴定 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 菌种、实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 SJCHGC06822基因的克隆 |
| 2.2.2 pET28a(+)-SJCHGC06822克隆载体构建 |
| 2.2.3 生物信息学分析 |
| 2.2.4 大肠杆菌中表达 |
| 2.2.5 多抗制备 |
| 2.2.6 western blot分析rSJCHGC06822/His蛋白的免疫原性 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 SJCHGC06822基因克隆及pET28a(+)-SJCHGC06822克隆载体构建 |
| 2.3.2 SJCHGC06822基因生物信息学分析结果 |
| 2.3.3 pET28a(+)-SJCHGC06822在大肠杆菌中的表达与重组蛋白纯化结果 |
| 2.3.4 rSJCHGC06822蛋白免疫原性鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 重组SJCHGC06822蛋白免疫效果评价及肝脏病理观察 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 小鼠免疫保护实验 |
| 3.2.2 间接ELISA测IgG、IgG1、IgG2a和IgE |
| 3.2.3 HE切片制作及结果观察 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 小鼠免疫保护试验结果 |
| 3.3.2 小鼠血清中抗SJCHGC06822蛋白特异性抗体检测 |
| 3.3.3 rSJCHGC06822/His蛋白免疫小鼠肝脏病理学观察结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 日本血吸虫SJCHGC06822蛋白诱导致敏小鼠淋巴细胞反应 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 小鼠免疫 |
| 4.2.2 去除原核表达rSJCHGC06822/His蛋白中LPS |
| 4.2.3 淋巴细胞增殖现象观察 |
| 4.2.4 流式细胞术检测胞内细胞因子 |
| 4.2.5 脾脏淋巴细胞亚群测定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 脾脏混和淋巴细胞增值现象观察 |
| 4.3.2 淋巴细胞亚群测定 |
| 4.3.3 流式细胞术检测胞内细胞因子 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 Treg细胞在日本血吸虫SJCHGC06822蛋白免疫Balb/c小鼠肝脏虫卵肉芽肿的动态变化研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 免疫组织化学法检测肝脏虫卵肉芽组织Foxp3表达 |
| 5.3 肝组织虫卵肉芽肿周围Foxp3表达结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj26GST）疫苗的构建及其免疫应答的动态观察（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST)疫苗的构建及其表达效率的研究 |
| 第一节 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST)疫苗的构建及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 日本血吸虫重组质粒 pGEX-Sj26GST 的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST)疫苗诱导 BALB/c 小鼠免疫应答的动态观察 |
| 第一节 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST)疫苗诱导 BALB/c 小鼠血清抗体和血清细胞因子的动态观察 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST)疫苗免疫 BALB/c 小鼠脾细胞增殖的动态观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST)疫苗免疫BALB/c小鼠 T细胞亚群的动态观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四节 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST)疫苗免疫 BALB/c 小鼠脾细胞因子的动态观察 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五节 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST)疫苗免疫 BALB/c 小鼠脾细胞凋亡的动态观察 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（10）日本血吸虫pVAX1/SjRPS4·CB多价疫苗免疫对小鼠肝脏虫卵肉芽肿形成的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 质粒 |
| 1.3 动物分组及实验方案 |
| 1.4 肝组织石蜡切片及HE染色 |
| 1.5 虫卵肉芽肿周长和面积的测量 |
| 2 结 果 |
| 2.1 小鼠肝脏组织病理学变化 |
| 2.2 对虫卵肉芽肿形成影响的观察 |
| 3 讨 论 |
四、免疫耐受对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响（论文参考文献）
- [1]T淋巴细胞在SD大鼠抗血吸虫疾病中的作用[D]. 刘壮壮. 新乡医学院, 2021(01)
- [2]日本血吸虫组织蛋白酶L3与甘油醛-3-磷酸脱氢酶的免疫功能分析[D]. 黄文铃. 武汉大学, 2020
- [3]γδ T细胞促进日本血吸虫感染小鼠早期肝纤维化作用及其机制研究[D]. 孙磊. 中国疾病预防控制中心, 2020(02)
- [4]髓源性抑制细胞在日本血吸虫病小鼠模型中的免疫调节作用[D]. 高勇强. 南华大学, 2020
- [5]ICOSL/ICOS信号调控Th9分化介导日本血吸虫病肝纤维化的分子机制[D]. 战廷正. 苏州大学, 2019(06)
- [6]阻断PD-1信号可增强日本血吸虫感染小鼠Th2型免疫反应并加重其肝脏免疫病理[D]. 金鑫. 南京医科大学, 2016(04)
- [7]日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞功能分化的研究[D]. 周春雷. 南京医科大学, 2015(01)
- [8]日本血吸虫SJCHGC06822分子调节肝虫卵肉芽肿炎症反应的初步研究[D]. 段明明. 中国农业科学院, 2014(11)
- [9]日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj26GST）疫苗的构建及其免疫应答的动态观察[D]. 张丽. 重庆医科大学, 2014(02)
- [10]日本血吸虫pVAX1/SjRPS4·CB多价疫苗免疫对小鼠肝脏虫卵肉芽肿形成的影响[J]. 彭微,汪世平,郑长黎,宋海鹏,刘怀. 中国人兽共患病学报, 2012(12)