一、人内皮抑素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达（论文文献综述）
李梦婷[1]（2020）在《长效稳定表达的杆状病毒基因传递载体系统的构建及其在肿瘤抗血管生成基因治疗中的应用》文中研究指明随着分子生物学的发展,基因治疗已成为继手术、放疗、化疗后治疗肿瘤最具潜力的方法之一。由于原发肿瘤的发展及转移关键依靠新生血管的生成,因此抗血管生成基因治疗成为非常吸引人的一种抗癌策略。基因治疗要想成功实施,除了找到合适的基因外,基因传递载体的选择或开发也至关重要。近年来,杆状病毒作为基因传递载体吸引了众多研究者的关注,但杆状病毒在哺乳动物体内易被血清补体系统灭活和瞬时表达,限制了其作为基因传递载体的进一步应用。本研究为了克服杆状病毒基因传递载体的不足,拟借助SB转座子系统和表面展示技术,构建长效稳定表达的杆状病毒基因传递载体系统,以绿色荧光蛋白基因eGFP作为目标基因,同时在病毒表面展示衰亡加速因子（DAF）,采用流式细胞术、Western blot、激光共聚焦和免疫荧光等方法,观察杆状病毒介导的绿色荧光蛋白在哺乳动物体内外的表达效率。进一步构建表达人内皮抑素（Endostatin）和血管抑素（angiostatin）组成的融合蛋白（hEA）的重组杆状病毒,通过ELISA、MTT、划痕、成管实验以及小鼠肝癌模型对其在哺乳动物细胞中的表达效率、抗血管生成功能以及抗肿瘤活性进行研究。为了进一步提高hEA抗肿瘤效果,将表达hEA的重组杆状病毒与化疗药吉西他滨联合使用,考察联合用药的协同效应。取得的研究结果如下:1.杆状病毒介导的eGFP在哺乳动物体内外的表达效率（1）体外长效表达研究:将重组杆状病毒转导HUVEC细胞,通过倒置荧光显微镜观察到长效稳定表达杆状病毒（BacSC-DAF-SB-T2CE）可以显着延长绿色荧光蛋白的表达时间（>90 d）,而瞬时表达杆状病毒（BacSC-DAF-CE）组的荧光细胞数在15 d内逐渐下降至完全消失;通过流式细胞术检测人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）细胞总荧光强度（TFI）,结果表明BacSC-DAF-SB-T2CE组在90 d内可以连续检测到信号(从3 d 6.7×1010 a.u.到90 d 5×109 a.u.),而BacSC-DAF-CE组数值在15 d后不能检测到荧光（低于检测限,TFI为106107 a.u.）。（2）DAF蛋白的表达:Western Blot结果表明,重组病毒BacSC-DAF-CE和BacSC-DAF-SB-T2CE感染的Sf-9细胞和纯化的病毒约在70 kDa处表达融合蛋白。激光共聚焦显微结果表明,DAF蛋白成功表达在病毒感染的Sf-9细胞表面。（3）体外转导效率研究:通过血清补体灭活实验验证重组病毒的转导效率。随着血清浓度的增加,eGFP阳性细胞百分比逐渐降低。无论是人血清还是小鼠血清,在血清浓度是20%,40%,60%和80%时,BacSC-DAF-CE和BacSC-DAF-SB-T2CE与BacSC-CE均有显着性差异（P<0.05）,但是BacSC-DAF-CE和BacSC-DAF-SB-T2CE之间没有显着差异（P>0.05）。表明表面展示DAF蛋白的重组病毒能够有效抵抗血清补体灭活。（4）体内转导效率研究:免疫荧光结果显示,瘤内注射重组病毒后1 d,与阴性对照BacSC-CE组相比,BacSC-DAF-CE组和BacSC-DAF-SB-T2CE组绿色荧光明显更强。在注射后5 d,BacSC-DAF-CE组基本看不到绿色荧光,而BacSC-DAF-SB-T2CE组持续表达至少15 d。这一结果表明新型重组杆状病毒能够提高在哺乳动物体内的表达量并有效延长eGFP表达时间。2.杆状病毒介导的hEA蛋白的抗肿瘤研究（1）hEA表达效率研究:ELISA结果显示,随着时间的增加,BacSC-DAF-ChEA组表达含量迅速下降,在9 d时其表达量下降接近于0,而BacSC-DAF-SB-T2ChEA组介导的hEA的表达量在最初同样迅速下降,但从9 d开始稳定表达,大约保持在100 pg/ml。（2）抗血管生成能力研究:MTT,划痕和成管实验结果显示,与对照组相比,长效稳定表达杆状病毒BacSC-DAF-SB-T2ChEA和瞬时表达杆状病毒BacSC-DAF-ChEA都能抑制血管生成活性（P<0.05）;与BacSC-DAF-ChEA组相比,BacSC-DAF-SB-T2ChEA组的抗血管生成能力更强（P<0.05）。（3）抗肿瘤活性:在皮下移植瘤模型中,与对照组（24 d）相比,两种重组病毒均能明显延长小鼠存活时间（42 d）。实验结束时,BacSC-DAF-ChEA组存活率为40%,BacSC-DAF-SB-T2ChEA组小鼠存活率更高,为80%。3.重组杆状病毒介导的联合化疗药吉西他滨的协同抗肿瘤研究（1）与对照组相比,单独使用BacSC-DAF-SB-T2ChEA或者吉西他滨均对小鼠皮下肝癌有良好的治疗效果（P<0.05）,两组单药之间效果无差异（P>0.05）,联合用药组效果比单药组更强（P<0.05）。（2）对照组中有肉眼可见的转移性病灶,而其他三组没有转移性病灶。（3）为了证明不同组对肿瘤增殖的影响,通过免疫组化实验用Ki67抗体标志肿瘤细胞增殖,结果表明对照组中Ki67的表达量最高,重组病毒组和吉西他滨组其次,联合用药组表达量最低。（4）为了证明不同组对肿瘤微血管密度的影响,通过免疫组化实验用CD31抗体标志肿瘤内血管生成,结果表明对照组中CD31的表达量最高,吉西他滨组其次,重组病毒组和联合用药组表达量最低。综上所述,本研究构建的新型重组杆状病毒基因传递系统能够抵抗补体的灭活并且能够长效稳定在哺乳动物体内外表达。相比于瞬时表达的杆状病毒（BacSC-DAF-ChEA）,长效稳定表达hEA的杆状病毒（BacSC-DAF-SB-T2ChEA）在小鼠皮下肝癌模型中,具有更强的抗血管生成能力和在体内的抗肿瘤能力。将长效稳定表达hEA的杆状病毒与临床常用的吉西他滨联合应用于小鼠皮下肝癌模型治疗时,显示出与吉西他滨协同增效的抗肿瘤效果。
杨益金,陆俊佳,覃霞,畅荣妮,赖青鸟,华荣,方玲,吴华裕,侯伟,吴飞翔,谢彤,袁志刚,舒伟[2]（2014）在《人与鼠源内皮抑制素不同标签重组蛋白的表达纯化及活性分析》文中认为根据文献报道和NCBI数据库确定人源内皮抑制素（HE）和鼠源内皮抑制素（ME）DNA序列,以DNA合成法分别获得长度为554 bp的人源内和长度为565 bp的鼠源内皮抑素基因;分别构建携带谷胱甘肽巯基转移酶（GST）表达标签的原核表达质粒pGEX-4T1-HE和携带硫氧还蛋白A（TrxA）表达标签的原核表达质粒pET-32a-ME,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,获得不同表达标签的HE、ME重组蛋白.最后通过鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）试验验证重组蛋白的抗血管生成活性.结果表明,构建了人与鼠源内皮抑制素基因不同标签表达载体,在大肠杆菌中成功诱导表达.获得具有活性的人与鼠源ES重组蛋白.纯化复性后的重组蛋白能明显抑制新生血管的生长.GST和TrxA标签对增进重组ES可溶表达没有显着差异,两组标签的重组蛋白都主要存在于包涵体内.
陆俊佳[3]（2013）在《TIE2基因启动子及内皮抑素基因表达载体的构建》文中研究指明目的：克隆小鼠TIE2基因的启动子并分析其转录活性。方法：设计并合成引物,以小鼠肝脏组织DNA为模板,巢式PCR扩增小鼠TIE2基因启动子区。将扩增获得的系列截短片段克隆入荧光素酶（Luc）报告基因表达载体pGL3-Basic中,构建系列启动子区转录活性报告质粒pGL3-TIE2-Luco报告质粒与内参质粒共转染SVEC4-10、NIH3T3、 HUVEC及NIT-1细胞系,48小时后收获细胞检测双荧光素酶的表达情况。结果：构建的pGL3-TIE2-Luc系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA测序分析都显示正确；转染四种细胞系后进行双荧光素酶活性检测的结果表明,TIE2基因启动子区域（-2056～+1）具有较强的转录活性。结论：成功构建小鼠TIE2基因启动子报告质粒,证实TIE2基因上游区域（-2056～+1）具有较强的启动子活性。目的：构建小鼠及人类的内皮抑素基因的原核表达载体pet41b（+）一endostat in.方法：设计并合成引物,以重组质粒pUC57-endostatin为模板,PCR扩增获得小鼠及人类的内皮抑素基因。将扩增获得小鼠及人类的内皮抑素基因分别插入原核表达载体pet41b（+）中,构建小鼠及人类的内皮抑素基因的原核表达载体pet41b（+）-endostatin.通过转化大肠杆菌BL21（DE3）获得小鼠及人类的内皮抑素基因的原核表达载体pet4lb（+）一endostatin的大量扩增,进行菌落PCR,挑选阳性菌液提取质粒进行酶切检测,并进行测序分析。结果：构建的小鼠及人类的内皮抑素基因的原核表达载体pet4lb（+）一endostat in经酶切鉴定及测序分析都显示正确。结论：成功的构建了小鼠及人类的内皮抑素基因的原核表达载体pet4lb （+）-endostatin.
王友同,吴文俊,李谦,高美风[4]（2013）在《近年来我国生物技术药物研究进展和趋势》文中认为生物技术是21世纪世界各国竞相发展的经济、技术的制高点,作者站在世界生物技术药物发展总趋势的高度上,具体而微地调查和总结了我国近5年来生物技术药物研究所取得的成果,内容包括:细胞因子、其它蛋白质和多肽药物、融合蛋白、穿膜肽、酶、基因治疗、干细胞、单克隆抗体、治疗性疫苗及多糖药物等。调查发现,在攻克人类顽疾、保障人民身体健康、提高生活质量和发展我国生物技术药物产业方面,由于国内成批有创见的研究成果持续涌现,发展前景一片光明。该文可为有关部门科研规划、确定研究项目、企业锁定发展目标及生物制药人员选择专业发展方向提供参考。
张新科[5]（2012）在《穿膜肽Tat PTD介导的内皮抑素穿透眼球屏障及对眼部血管增生抑制作用的研究》文中研究表明糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等疾病会引起眼底部位的血管增生,使视功能受到严重损害,甚至失明。目前,临床上大都采用眼内注射或激光光凝法治疗眼底血管增生,而这些方式往往会造成视网膜严重不可逆损伤。因此,寻找能够防治眼内血管生成且副作用小的药物具有重大的社会和经济意义。内皮抑素（endostatin, Es）是一种内源性血管内皮细胞增殖的强效抑制剂,我国已将重组人血管内皮抑素研制成具有自主知识产权的国家一类新药（Endostar,即恩度、YH16）用以治疗非小细胞肺癌。与传统化疗药物相比,Es具有毒副作用小、不易产生耐药性等优点。Es不仅在治疗肿瘤方面有其独特的优势,在防治眼部新生血管性疾病方面也取得一些可喜的成就。研究证明,通过球结膜下注射、玻璃体腔注射,Es及Es基因均可抑制眼部新生血管的形成。但是,由于Es是生物大分子,不能透过眼球屏障,必须通过眼内注射方式才能发挥疗效,而这种操作方式难度大,容易损伤眼球内组织,甚至会对病人造成不可逆的损伤,所以寻找简便、安全、有效的给药途径具有重要的临床意义。能够穿透细胞膜的HIV-1反式转录因子的蛋白转导域（protein transduction domain of the transacting activator of transcription, Tat PTD）能够携带穿透能力差的药物进入细胞,且具有携带药物透穿透眼球屏障的可能性。故本课题拟利用穿膜肽Tat PTD的穿膜作用和内皮抑素的抑制新生血管生成的作用,将二者通过基因工程的手段融合在一起,以期获得能够穿透眼球屏障的内皮抑素,达到通过简单的局部滴眼给药预防视网膜或脉络膜血管增生的目标。本课题的研究内容及取得的主要成果有以下几个方面。1Tat PTD-endostatin （Tat PTD-Es）在毕赤酵母中的表达及纯化本课题构建了Tat PTD-Es融合基因及酵母分泌型表达载体pGAPZαA/Tat PTD-Es（pG/TE）及pGAPZaA/Es（pG/E）。采用电转化法将重组质粒转入毕赤酵母菌（GS115）,筛选阳性菌落,SDS-PAGE检测目的蛋白。利用镍离子亲和层析对表达产物进行初步纯化。结果表明Tat PTD-Es的毕赤酵母表达体系构建成功,但表达量低。2Tat PTD-Es在大肠杆菌中的表达、复性及纯化采用大肠杆菌表达系统对Tat PTD-Es及Es进行了融合表达。选用pET28a作为表达载体,构建重组质粒pET28a/Tat PTD-Es （pET28a/TE）和pET28a/Es （pET28a/E）,转入E.coli Rosetta（DE3）中诱导表达目的蛋白。选用温度37℃,诱导时间4h的条件对工程菌株进行诱导,SDS-PAGE检测目的蛋白。摸索了包涵体的洗涤条件,采用直接稀释法对包涵体蛋白Tat PTD-Es及Es进行复性,采用Hi strap预装柱对复性后的蛋白进行了纯化,得到了高纯度的目的蛋白,SDS-PAGE结果显示Tat PTD-Es的分子量为22kD, Western blot结果显示目的蛋白可以与6xHis抗体结合,表明目的蛋白含有6xHis标签。3Tat PTD-Es的体内外活性及入胞机制研究采用CCK-8法测定了Tat PTD-Es及Es对人脐静脉内皮细胞EAHY926增殖的抑制作用,结果表明：Tat PTD-Es及Es均能显着地抑制内皮细胞的增殖,且抑制率呈现明显的剂量依赖性,即随着浓度的增加对细胞生长的抑制率也增加;Tat PTD-Es在低浓度时（0.2μmol/L,0.8μmol/L）活性要高于Es,当浓度大于4μmol/L时,Tat PTD-Es及Es抑制率均大于80%。建立鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型,评价复性纯化后的Tat PTD-Es及Es对CAM血管生成的影响,以生理盐水作为空白对照,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作为阴性对照,观察了Tat PTD-Es及Es对bFGF诱导的CAM血管生成的抑制作用。与bFGF组（12.18±4.72）比较,Tat PTD-Es及Es组的CAM血管数分别减少至（30.74±6.47）及（14.56±6.21）（p<0.05）,结果表明,Tat PTD-Es及Es均能够明显抑制bFGF诱导的CAM血管的生成。采用荧光显微镜和流式细胞术对Tat PTD-Es与Es的入胞能力进行了比较。结果表明FITC标记的Tat PTD-Es与Es与人脐静脉内皮细胞EAHY926共孵育4h后,Es组的荧光信号很弱,细胞阳性率仅为33.61%；而Tat PTD-Es组的荧光信号与Es相比有很明显的增强,细胞阳性率高达99.28%,提示Tat PTD与Es融合表达后有利于蛋白质穿透细胞膜进入细胞,而使进入细胞的蛋白质大大增加,可能有利于其在胞内更好地发挥作用。考察了蛋白Tat PTD-Es浓度、孵育时间对人脐静脉内皮细胞EAHY926摄取蛋白质的影响及各种胞吞途径抑制剂对Tat PTD-Es进入人脐静脉内皮细胞EAHY926的影响。结果表明,蛋白质浓度在1μmol/L～10μmol/L范围内,EAHY926细胞对Tat PTD-Es的摄取有剂量依赖性,相对荧光强度从20.72AU增加到305.23AU。随着Tat PTD-Es与细胞孵育时间的延长,EAHY926对Tat PTD-Es的摄取也逐渐增加。5min-2h内荧光强度增加较为迅速,荧光强度从17.16增加到221.37,之后增加较为平缓,4h时的荧光强度增加至249.18。考察了各种胞吞途径抑制剂对Tat PTD-Es进入人脐静脉内皮细胞EAHY926的影响。细胞经4℃和NaN3（ATP抑制剂）处理后,与对照组相比,荧光信号大大减弱,荧光强度分别降低了92.49%、94.91%,说明温度、ATP在EAHY926细胞摄取Tat PTD-Es的过程中起到非常重要的作用,其入胞过程是温度、能量依赖的。而经蔗糖（网格蛋白clathrin途径抑制剂）、氯丙嗪（clathrin途径抑制剂）、木黄酮（小窝途径caveolae抑制剂）、细胞松弛素D（巨胞饮途径抑制剂）等不同摄取途径抑制剂处理后的EAHY926细胞对蛋白质的摄取均有所减弱,但是减弱的程度不尽相同。蔗糖及氯丙嗪处理后,荧光强度分别为原来的36.71%及36.86%,均减少了60%左右,提示clathrin途径也可能是Tat PTD-Es入胞机制之一。木黄酮处理后的细胞,荧光强度为原来的66.57%,降低了33%,表明Tat PTD-Es的入胞可能也与caveolae有关。细胞松弛素D处理后的细胞,荧光强度为原来的27.52%,降低了72%,提示巨胞饮也是Tat PTD-Es入胞的潜在途径。由这些结果我们推测,Tat PTD-Es入胞可能不只遵循一种途径,而是几种途径同时存在。4Tat PTD-Es穿透眼球屏障的能力与体内药效学研究小鼠分组后,分别玻璃体注射和滴眼Tat PTD-Es与Es组,生理盐水滴眼组作为空白对照。取小鼠眼球,切片,用小鼠6×His抗体作为一抗做免疫组化,检测视网膜层是否有目的蛋白。结果显示,玻璃体注射Tat PTD-Es与Es后,视网膜细胞层均有目的蛋白,表明经玻璃体注射后药物能够较快到达视网膜。滴眼给药时,Es组小鼠视网膜细胞层没有目的蛋白的分布,表明通过滴眼给药Es不能到达视网膜,而Tat PTD-Es组小鼠视网膜细胞层出现了目的蛋白,证明通过滴眼给药Tat PTD能够携带Es穿透眼球屏障到达视网膜,达到了我们的预期目的。通过激光烧伤法建立小鼠脉络膜新生血管（CNV）模型,滴眼或玻璃体注射Tat PTD-Es及Es,生理盐水滴眼组作为阴性对照,玻璃体注射Avastin作为阳性对照。实验结果表明,玻璃体注射Tat PTD-Es、Es组的小鼠眼部的CNV血管生成面积分别为（961.2±86.9）μm2和（944.6±88.3）μm2,与阴性药物组（2623.6±240.9）μm2相比CNV面积明显减少（p<0.01）,且与阳性药物Avastin组（863.5±50.1）μm2相比没有显着性差异。Es滴眼给药时,CNV面积为（2514.7±260.7）μm2,与生理盐水组相比没有显着性差异,表明Es滴眼后Es不能到达眼底,不能抑制CNV的生成。而Tat PTD-Es滴眼给药组的CNV面积（1378.4±154.3）μm2,与阴性药物组相比CNV面积明显减少（p<0.01）。滴眼给药Tat PTD-Es能够抑制CNV血管的生成,此结果进一步证明了通过局部滴眼给药后Tat PTD-Es能够穿透眼球屏障到达视网膜脉络膜发挥其作用。本研究取得的成果和结论：（1）首次构建了Tat PTD-Es的毕赤酵母工程表达菌株。（2）首次构建了表达Tat PTD-Es的大肠杆菌表达系统,对蛋白质成功进行了表达,并对其包涵体进行了复性、纯化,得到了高纯度的目的蛋白。（3）复性纯化的Tat PTD-Es及Es能够明显抑制EAHY926细胞的增殖、CAM血管生成,表明其具有较好的体外活性。（4） Tat PTD-Es比Es具有更好的入胞能力,且其进入EAHY926细胞时遵循多种入胞机制。（5） Tat PTD-Es局部滴眼给药后能够穿透眼球屏障到达眼底视网膜脉络膜组织,且在体内表现出了较好的抑制脉络膜血管生成的活性。
杜翠红,戴飞红[6]（2010）在《乳糖诱导重组人内皮抑素在大肠杆菌中的表达》文中研究表明使用乳糖作为诱导剂,摇瓶培养大肠杆菌Origami（pET-hES）发酵生产重组人内皮抑素,优化了诱导温度、诱导时机、诱导时间及诱导剂浓度四因素。利用SDS-PAGE电泳检测并分析上述各因素的优化效果。结果表明,25℃,在菌株对数生长初期（培养6 h,D600≈0.8）加入乳糖至终浓度为8 g/L,诱导14 h,可溶性目的蛋白表达量占其总表达量的82%;总目的蛋白表达量占全菌总蛋白的35%,优于以异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）为诱导剂的诱导效果（25%）。
徐春晓[7]（2010）在《肿瘤抑素基因表达与肾癌关系以及鸟氨酸脱羧酶基因表达对肿瘤抑素表达调控作用的研究》文中研究说明肿瘤是一类常见病、多发病,其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。在我国,随着人口老龄化,肿瘤的发病率和死亡率呈上升趋势。近年来,虽然肿瘤治疗已取得一些突破性进展,但由于肿瘤发病因素的多样性和肿瘤细胞的复杂性,肿瘤治疗仍是全球面临的一项难题。1971年Folkman提出“肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的形成”,随后肿瘤抗血管生成疗法成为研究热点。肿瘤抑素（tumstatin）是继血管抑素（angiostatin）和内皮抑素（endostatin）之后新发现的基底膜来源的肿瘤血管生成抑制因子；来源于Ⅳ型胶原α3链的C末端,由244个氨基酸组成,分子量为28kD。肿瘤抑素不但能够抑制血管内皮细胞增殖,诱导内皮细胞凋亡,进而抑制血管生成,从而抑制肿瘤生长；而且能够直接抑制肿瘤细胞增生,促进肿瘤细胞凋亡。在几种内源性血管生成抑制剂（angiostatin,endostatin,canstatin,restin,tumstatin）中,肿瘤抑素具有最强的抗血管生成效应,呈现良好的应用前景。肾癌是最常见的一种肾实质肿瘤,其发病率在泌尿系肿瘤中占第二位,病因尚不清楚。目前肾癌的根治首选手术治疗,术后五年存活率为40%：而放疗和化疗只能作为辅助治疗方法,不能使肿瘤彻底控制。这些传统的治疗方法在治疗肿瘤的同时也损害机体正常的组织细胞,而肿瘤抗血管生成疗法只抑制病理性的肿瘤血管生成,不影响机体正常的血管生成,有望成为治疗肿瘤的有力武器之一。肿瘤抑素主要分布于肾小球基底膜,肺泡血管基底膜等,其与肾癌的关系尚未见报道。本文从组织和细胞水平研究了肿瘤抑素基因表达与肾癌的关系,并构建了肿瘤抑素真核表达载体以探讨其用于基因治疗的可行性。鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase, ODC）能催化鸟氨酸脱羧生成腐胺,是多胺合成途径中的第一个限速酶。现已发现在多种人类癌细胞和组织中ODC含量及活性明显升高,其与细胞转化、肿瘤侵袭和血管生成有关。为验证ODC过表达是否通过影响肿瘤抑素的表达来调控血管生成,本文首先检测了ODC和肿瘤抑素在肾组织和细胞中表达的相关性,然后筛选出含ODC过表达载体的HEK293细胞株,从mRNA、蛋白质、细胞增殖、启动子水平检测了ODC对肿瘤抑素表达的调控作用。研究结果表明ODC过表达能够抑制肿瘤抑素的表达,提示肿瘤组织中ODC过表达抑制肿瘤抑素的表达,是其促进血管生成的机制之本研究过程中需要肿瘤抑素抗体,但课题开始时肿瘤抑素抗体尚未商品化,故本文首先构建了肿瘤抑素原核表达载体,在大肠杆菌中进行了高效表达,表达的包涵体蛋白经变性、纯化、复性后免疫小鼠,制备鼠抗人肿瘤抑素多克隆抗体,经ELISA和western blot验证其能够与肿瘤抑素特异性结合。这为本文的完成提供了实验材料,为后续研究奠定了基础。第一部分人肿瘤抑素原核表达载体的构建、表达、纯化及其多克隆抗体的制备[目的]构建人肿瘤抑素基因原核表达载体,诱导表达后纯化获得重组人肿瘤抑素融合蛋白,制备鼠抗人肿瘤抑素抗体,为后续研究奠定基础。[方法]1.RT-PCR扩增肿瘤抑素的编码序列,TA克隆后NcoI、XhoI双酶切回收目的片段,插入到原核表达载体pTriEx-4中,构建重组表达质粒pTriEx-tumstatin。2.将pTriEx-tumstatin表达质粒转化大肠杆菌E.coli JM109（DE3）, IPTG诱导肿瘤抑素融合蛋白表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。3.根据亲和层析原理,采用Ni SepharoseTM 6 Fast Flow纯化出重组人肿瘤抑素蛋白,透析复性,PEG8000浓缩,SDS-PAGE及western blot鉴定纯化产物。4.纯化的肿瘤抑素融合蛋白与免疫佐剂混合,作为免疫原,免疫小鼠,取血清制备鼠抗人肿瘤抑素多抗；ELISA及western blot测定抗血清的效价及特异性。[结果]1.RT-PCR扩增出肿瘤抑素编码序列（735bp）。2.重组表达质粒pTriEx-tumstatin构建成功,酶切鉴定及DNA序列分析证明该质粒含有肿瘤抑素全部编码序列,开放阅读框架正确。3. pTriEx-tumstatin转化入JM109（DE3）诱导表达,表达产物经纯化、复性、浓缩,SDS-PAGE及western blot鉴定,分子量约为30kD,与预期结果相符。4.制备出鼠抗人肿瘤抑素多克隆抗体,并测定了其效价及特异性。[结论]成功构建了含有人肿瘤抑素基因编码序列的原核表达载体pTriEx-tumstatin,并在E.coli JM109（DE3）中高效表达,经Ni SepharoseTM 6 Fast Flow纯化得到肿瘤抑素融合蛋白；以其为免疫原制备鼠抗人肿瘤抑素多抗,为后续的研究工作奠定了基础。第二部分肿瘤抑素基因表达与肾癌关系的研究[目的]检测肿瘤抑素在肾癌组织和细胞中的表达水平；构建人肿瘤抑素基因真核表达载体,观察其对血管内皮细胞及肾癌细胞增殖的作用。[方法]1.半定量RT-PCR和western blot分别检测肾癌标本中肿瘤抑素mRNA和蛋白的表达情况。2.半定量RT-PCR和western blot检测肾癌细胞（ACHN）和正常肾细胞（HEK293）中肿瘤抑素mRNA和蛋白的表达差异。3.构建含肿瘤抑素基因的真核表达质粒（pcDNA-tumstatin）,酶切鉴定并测序分析。4.以脂质体LipofectamineTM 2000介导重组质粒pcDNA-tumstatin转染血管内皮细胞ECV304和人肾癌细胞ACHN,RT-PCR及western blot鉴定其在这两种细胞中的表达情况。5.用CCK-8细胞活性检测法检测pcDNA-tumstatin转染后对ECV304和ACHN细胞增殖的影响。6.流式细胞术检测pcDNA-tumstatin转染ECV304细胞后对细胞周期分布的影响,western blot检测肿瘤抑素基因表达对细胞周期调节蛋白cyclin D1表达的影响。[结果]1.肾组织标本中肿瘤抑素mRNA和蛋白的表达丰度以均数±标准差表示,结果显示：肾癌组织中肿瘤抑素mRNA和蛋白的表达量明显低于正常肾组织中的表达量（P<0.05）。2.RT-PCR和western blot结果显示：肾癌细胞ACHN中肿瘤抑素mRNA和蛋白的表达量明显低于胚肾HEK293细胞中的表达量（P<0.05）。3.经限制性内切酶酶切鉴定,pcDNA-tumstatin中肿瘤抑素基因片段大小符合；DNA测序显示序列及插入方向正确。4.RT-PCR及western blot结果显示pcDNA-tumstatin能够在血管内皮细胞ECV304和肾癌细胞ACHN中表达。5. pcDNA-tumstatin转染后可明显抑制血管内皮细胞ECV304的增殖,而对肾癌细胞ACHN的增殖无影响。6.流式细胞术结果显示pcDNA-tumstatin转染的ECV304细胞周期阻滞在G1期；western blot结果显示肿瘤抑素基因表达抑制G1期主要的细胞周期蛋白cyclin D1的表达。[结论]肾癌组织和细胞中肿瘤抑素mRNA和蛋白表达下调,表明肿瘤抑素的表达变化可能与肾癌的进展有关。真核表达载体pcDNA3.1（+）介导的肿瘤抑素过表达可特异性抑制血管内皮细胞增殖,诱导其细胞周期阻滞于G1期,并且该阻滞作用与细胞周期蛋白cyclin D1表达下调有关,初步证实肿瘤抑素可作为肾癌治疗的治疗剂,并通过基因治疗手段来持续给药。第三部分鸟氨酸脱羧酶基因表达对肿瘤抑素表达调控作用的研究[目的]构建鸟氨酸脱羧酶过表达载体pcDNA-ODC;建立ODC过表达的HEK293细胞株；研究ODC基因表达对肿瘤抑素表达的调控作用。[方法]1.半定量RT-PCR检测肾癌组织中ODC和肿瘤抑素的表达情况。2.半定量RT-PCR和western blot检测癌细胞（肾癌细胞ACHN和肺癌细胞A549）中ODC和肿瘤抑素的表达情况。3.构建含ODC基因的过表达质粒pcDNA-ODC,酶切鉴定并测序分析。4.重新转化与ODC基因翻译起始位点互补的ODC反义真核表达质粒pcDNA-ODCr,酶切鉴定并测序分析。5.以脂质体LipofectamineTM 2000介导pcDNA3.1质粒和pcDNA-ODC重组质粒分别转染人胚肾细胞HEK293,利用G418进行筛选,3-4周后,挑取单克隆、消化接种后继续培养建立稳转细胞株,并以western blot鉴定。6.实验分为5组,分别为：PBS组、pcDNA3.1空载体稳转组、pcDNA-ODC稳转组、pcDNA-ODC与pcDNA-ODCr共转染组和腐胺处理组。分别提取各组HEK293细胞总蛋白,western blot检测ODC和肿瘤抑素蛋白的表达情况。7.分别提取上述五组细胞总RNA,半定量RT-PCR检测ODC和肿瘤抑素mRNA的表达情况。8.构建肿瘤抑素启动子的荧光素酶报告基因质粒（pGL-tumstatin2.2kb和pGL-tumstatin0.5kb）,利用脂质体将pGL-tumstatin2.2kb质粒与内参照质粒pRL-TK共转染上述五组细胞,荧光素酶报告基因分析检测启动子活性。9.获取上述五组细胞的条件培养基,作用于血管内皮细胞ECV304,CCK-8检测其对血管内皮细胞增殖的影响。[结果]1.半定量RT-PCR结果显示：38例肾癌标本中,有32例ODC mRNA是过表达的；在这32例ODC过表达的标本中有24例肿瘤抑素mRNA的表达量低于正常组织中的表达量。统计学分析ODC过表达与肿瘤抑素表达下调有关。2.半定量RT-PCR和western blot结果显示：肾癌细胞ACHN、肺癌细胞A549中ODC mRNA和蛋白的表达量明显高于相应的正常细胞（人胚肾细胞HEK293和人胚肺细胞HELF）,而肿瘤抑素mRNA和蛋白的表达量明显低于相应的正常细胞。统计学分析二者存在相关性。3.经限制性内切酶和DNA测序鉴定,pcDNA-ODC质粒中,ODC基因片段大小符合,插入方向和序列正确。4.经酶切鉴定和测序分析,所转化的pcDNA-ODCr质粒,目的片段基因序列及插入方向正确,说明所转化的pcDNA-ODCr质粒是携带与ODC翻译起始位点互补的基因序列的ODC反义真核表达质粒。5.RT-PCR和western blot结果显示：筛选到的含pcDNA-ODC质粒的细胞能够高水平表达ODC。6.RT-PCR和western blot结果显示：相对于空白对照组和空载体组,pcDNA-ODC稳转组中ODC mRNA和蛋白的表达量明显升高,在转染pcDNA-ODCr的pcDNA-ODC稳转细胞组中ODC mRNA和蛋白的表达量接近空白对照组,腐胺处理组中ODC表达无明显变化；而肿瘤抑素mRNA和蛋白的表达量在pcDNA-ODC稳转组和腐胺处理组中明显下降,转染pcDNA-ODCr的pcDNA-ODC稳转细胞组中肿瘤抑素mRNA和蛋白的表达量恢复至正常水平。RT-PCR结果显示：各处理组中血管内皮生长因子VEGF mRNA的表达量保持不变。7.构建了肿瘤抑素基本启动子（2149bp）和已报道的共用启动子（530bp）的荧光素酶报告质粒（pGL-tumstatin2.2kb和pGL-tumstatin0.5kb）,荧光素酶报告基因分析结果显示两者都具有启动子活性,其中pGL-tumstatin2.2kb活性明显,故选择该报告质粒进行下一步实验。结果显示ODC过表达和外源性腐胺的给予可抑制肿瘤抑素启动子活性,抑制率分别为45.8%、45.2%。8.培养的血管内皮细胞ECV304中加入从各处理组获得的条件培养基继续培养18h后用CCK-8检测,结果显示：与PBS处理组相比,来自pcDNA-ODC稳转组和腐胺处理组的条件培养基能够诱导1.41±0.07、146±0.07倍的血管内皮细胞增殖；而来自空载体稳转组和pcDNA-ODCr转染的pcDNA-ODC稳转细胞组的条件培养基对血管内皮细胞增殖无明显影响。[结论]成功构建了ODC过表达的真核表达质粒pcDNA-ODC,并筛选出能够高表达ODC的人胚肾HEK293细胞株；ODC基因过表达和外源性腐胺的增加能够抑制肿瘤抑素基因的表达,从而使血管内皮细胞增殖加快,提示ODC过表达可能通过抑制肿瘤抑素表达而促进血管生成。全文摘要总结本课题成功构建了肿瘤抑素的原核表达载体pTriEx-tumstatin,并在大肠杆菌E.coli JM109（DE3）中高效表达了带有His.tag的融合蛋白,其纯化后作为免疫原,制备出鼠抗人肿瘤抑素多抗；利用该抗体研究发现肾癌组织和细胞中肿瘤抑素的表达量明显低于其在正常肾组织和细胞中的表达量,提示肿瘤抑素基因表达下调与肾癌的进展有关。利用表达肿瘤抑素的真核表达载体pcDNA-tumstatin,体外证明其能够特异性抑制血管内皮细胞增殖,从而抑制肿瘤生长。进一步分子机理研究证明,肿瘤抑素过表达可能是通过抑制细胞周期蛋白cyclin D1基因表达而使血管内皮细胞增殖停滞于G1期,为肾癌基因治疗研究提供了理论依据。鸟氨酸脱羧酶（ODC）是多胺合成途径中的第一个限速酶。ODC过表达能够促进血管生成。肾癌组织和细胞中ODC的表达升高,而肿瘤抑素的表达下降,者有相关性。利用含ODC过表达载体的稳转细胞,进一步研究证明ODC基因过表达和腐胺水平增加能够抑制肿瘤抑素表达,从而使血管内皮细胞增殖加快,提示ODC过表达可能通过抑制肿瘤抑素表达而调控血管生成。
杜翠红,曹敏杰,游品升,高体琪[8]（2009）在《人内皮抑素基因的定点突变及其在大肠杆菌中的表达》文中研究表明目的对人内皮抑素（hES）基因进行定点突变,提高其在大肠杆菌中的可溶性表达量。方法根据Internet网站提供的关于hES的结构信息及其结构与功能方面的研究文献,设计突变位点;利用生物信息学的相关网站,对hES突变体进行结构预测,验证突变位点设计的合理性;采用重叠延伸PCR方法进行hES基因的定点突变,并将突变基因和未突变基因分别亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,在大肠杆菌中进行融合表达,比较突变前后目的蛋白的可溶性表达量。结果三级结构预测结果表明突变位点设计合理,序列分析结果表明实现了hES基因的定点突变。突变基因的表达产物中,可溶性部分约占总表达量的40%,而未突变基因的表达产物几乎全部为包涵体。结论已成功对hES基因进行了定点突变,突变后的hES可溶性表达量得到了提高。
杨健,张晓萍[9]（2007）在《人分泌型内皮抑素基因的克隆及表达》文中研究说明目的获得人分泌型内皮抑素（endostatin）基因并在大肠杆菌中进行表达,为其应用于肿瘤的治疗奠定基础。方法合成含信号肽的上游引物,用聚合酶链反应技术克隆人分泌型内皮抑素基因,10 g.L-1琼脂糖凝胶电泳后回收将其重组入T载体,双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列。定向克隆重组人pBV220表达载体,转化大肠杆菌DH5α,42℃热诱导表达。结果经Gen-bank分析证实,所获得的645 bp基因片段序列正确。经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,与人内皮抑素蛋白大小相符合,表达量为14.5%。结论获得了人内皮抑素非融合重组蛋白。
姚站馨[10]（2007）在《融合蛋白Append的原核表达及活性测定》文中进行了进一步梳理细胞的无限制增长和肿瘤血管的形成是肿瘤生长过程中的两个关键因素，如果抗肿瘤药物能够同时瞄准一个以上的目标，采取“多个靶点”方式攻击癌细胞，就可能获得更好的临床效果。凋亡素（apoptin）是一种来源于鸡贫血病病毒（chicken anemia virus，CAV）的小蛋白质（VP3），由121个氨基酸组成，分子量为13.6kDa，它能够特异性地诱导人转化细胞和肿瘤细胞的凋亡。一系列的研究结果已证实apoptin作为一种抗肿瘤制剂是安全有效的。血管内皮抑素（endostatin）是近年来发现的最有效血管生成抑制因子之一。Endostatin为胶原蛋白ⅩⅧ的C末端片段，编码184个氨基酸，分子量为20kDa。在本研究中，我们构建了一种新的融合基因，命名为Append，其表达产物的结构为以柔性多肽—甘氨酸接头（Gly4Ser）3将apoptin与endostatin连接起来的融合蛋白；之后利用原核表达系统表达该融合蛋白并对其生物功能进行评价。我们针对内皮抑素cDNA序列设计引物，用反转录聚合酶链反应从人胎肝总RNA中钓取内皮抑素cDNA；根据apoptin基因序列设计引物，用聚合酶链反应从质粒pUC-Apoptin中扩增凋亡素基因；采用重叠引物延伸法，使凋亡素基因和内皮抑素基因通过一个（Gly4Ser）3的连接肽基因相连接，构成融合基因Append；将融合基因Append克隆入pGEM-T easy载体中，通过酶切、PCR及序列测定；将测序正确的Append融合基因分别克隆进3种原核表达载体pLLP-OmpA、pET-His和pET-DsbA中，并将鉴定正确的原核表达载体分别命名为：pLLP-OmpA-Append、pET-His-Append和pET-DsbA-Append；之后优化原核表达条件；采用镍琼脂糖亲和层析法对表达的蛋白进行纯化；纯化的蛋白进行SDS-PAGE及Western Blot检测，并进行活性测定。实验结果表明，采用重叠引物延伸法获得了融合基因Append，全长为960bp，与预期相符；共构建了3个重组原核表达质粒，经过优化原核表达条件确定pLLP-OmpA-Append最适于表达Append融合蛋白，可溶性蛋白的表达量为1.43mg/L，纯度为91.7％。纯化的Append融合蛋白进行SDS-PAGE，获得的目的蛋白大小与预期相符，约为33.6kDa，Western blot鉴定结果为阳性；活性测定结果表明Append融合蛋白在体外可以抑制脐静脉内皮细胞的增殖并可诱导人神经胶质瘤细胞凋亡，在体内可以抑制血管的新生。本研究成功地构建了融合基因Append，并实现了Append融合蛋白在大肠杆菌中的表达，为开发具有多靶点效应的肿瘤治疗药物奠定了基础。
二、人内皮抑素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人内皮抑素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达（论文提纲范文）
（1）长效稳定表达的杆状病毒基因传递载体系统的构建及其在肿瘤抗血管生成基因治疗中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 长效稳定表达的杆状病毒基因传递载体系统的构建及其在哺乳动物体内外表达效率研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 杆状病毒介导的hEA蛋白的抗肿瘤研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三章 重组杆状病毒介导的联合化疗药吉西他滨的协同抗肿瘤研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间本人的科研成果 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（2）人与鼠源内皮抑制素不同标签重组蛋白的表达纯化及活性分析（论文提纲范文）
| 1 前言 |
| 2 实验 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 内皮抑素基因的合成与表达载体的构建 |
| 2.3.2 内皮抑素在大肠杆菌中的表达 |
| 2.3.3 内皮抑素重组蛋白包涵体的复性 |
| 2.3.4 鸡胚绒毛尿囊膜试验 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 人与鼠源内皮抑素基因的合成与表达质粒构建 |
| 3.2 人与鼠源内皮抑素基因在大肠杆菌中的表达 |
| 3.3 不同标签重组内皮抑素蛋白在包涵体和上清裂解液中的分布 |
| 3.4 人与源内皮抑制素的表达纯化 |
| 3.5 重组内皮抑素蛋白的抗血管生成活性 |
| 4 结论 |
（3）TIE2基因启动子及内皮抑素基因表达载体的构建（论文提纲范文）
| 中英文对照表 |
| 第一节 小鼠TIE2基因启动子的克隆及转录活性分析 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二节 小鼠及人内皮抑素基因的克隆 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）近年来我国生物技术药物研究进展和趋势（论文提纲范文）
| 1 细胞因子[3-9] |
| 1.1 白细胞介素 (IL) |
| 1.1.1 h IL-10 |
| 1.1.2 h IL-31 |
| 1.1.3 h IL-32 |
| 1.2 干扰素 (IFN) |
| 1.2.1 新型人复合IFNα |
| 1.2.2 集成IFNα突变体Ⅱ (IFN2-Con-m2) |
| 1.2.3 人共同IFNα (IFN-Con1) |
| 1.3 人干细胞生长因子-α (rhSCGF-α) |
| 1.4 人胰岛素样生长因子1 (hIGF-1) |
| 1.5 人血管内皮生长因子 (h VEGF165) |
| 1.6 人内皮抑素 (rhEndostatin) |
| 1.7 人血管能抑素 (canstatin) |
| 2 蛋白质、多肽[10-12] |
| 2.1 水蛭素Ⅲ (HVⅢ) |
| 2.2 人胰高血糖素样肽-2类似物[ (PP-h|Gly 2|GLP-2 (1-35) ] |
| 2.3 人β-2 glycoprotein I |
| 2.4 MAP30蛋白 |
| 2.5 Exendin-4类似物 |
| 2.6 新型Ⅱa类细菌素 |
| 2.7 截短肠毒素C2 |
| 2.8 胰生定多肽 (EXf) |
| 2.9 CKLF-C19 |
| 2.10 人胰岛新生相关蛋白 (INGAP) |
| 2.11 人源肝星状激活相关蛋白 (STAP) |
| 2.12 人凋亡素α-配体 (rh-Apoα) |
| 2.13 人胸腺素β16 |
| 2.14 神经保护肽 ([Gly-14]-Humanin) |
| 2.15 鲨肝活性蛋白 (rSHAP) |
| 2.16 抗癌多肽A38 |
| 2.17 抗纤维化小肽AcSDKP |
| 2.18 血管紧张素1-7改构体 |
| 2.19 抗肿瘤多肽AP25 |
| 2.20 酪丝亮肽 |
| 3 融合蛋白[13-17] |
| 3.1 双 (多) 功能融合蛋白 |
| 3.2 HSA修饰的融合蛋白 |
| 3.3 穿膜肽修饰的融合蛋白[18] |
| 3.4 蛋白质分子PEG后修饰[19] |
| 4 穿膜肽 (CPPs) |
| 5 酶 |
| 5.1 重组蛇毒纤溶酶 (ralfimeprase, ALF) |
| 5.2 蛇毒类凝血酶 (ancrod) |
| 5.3 蚯蚓纤溶酶 (EFE) |
| 5.4 嗜血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂 (Bat-PA) |
| 5.5 人过氧化氢酶 (CAT) |
| 5.6 海刺参i型溶菌酶 (rSjLys) |
| 5.7 人纤溶酶原 |
| 5.8 含精-甘-天冬酰胺三肽人纤溶酶原K区缺失突变体 (RGD-hPLG-K) |
| 5.9 人溶菌酶 (hLYZ) |
| 5.10 尿酸氧化酶 (Uricase) [21] |
| 5.11 人源基质蛋白酶-2 (MMP-2) 的C端类血红素结合域片段 (PEX) |
| 5.12 β-内酰胺酶[22] |
| 6 基因治疗 |
| 6.1 siRNA[23-27] |
| 6.2 反义核酸 |
| 6.3 治疗基因 |
| (1) 抑瘤素M (OSM) 重组腺病毒载体 (Ad-OSM) |
| (2) miR29C重组腺病毒 (Ad5F11p-miR29C) |
| (3) 人肝细胞生长因子重组质粒 (pUDK-HGF) [30] |
| (4) 腺病毒Ela基因-P1b抑癌基因 (AdCMV-P16) |
| (5) 新型增殖型腺病毒 (CNHK500-hγ) [31] |
| 7 干细胞 |
| 7.1 国家SFDA批准临床的干细胞项目 |
| 7.2 干细胞治疗是一种医疗技术还是细胞药物 |
| 7.3 用于临床的干细胞 |
| 7.4 我国近期干细胞临床和药理学药效学研究 |
| 7.4.1 临床研究[32-35] |
| 7.4.2 药理药效学研究 |
| 8 单克隆抗体 |
| 8.1 我国批准的单抗 |
| 8.2 正在临床研究的单抗 |
| 8.3 正在进行临床前研究的单抗 |
| 8.4 单抗阶段性研究[36-38] |
| 9 治疗性疫苗 |
| 9.1 10个世界上正在开发的热点治疗性疫苗 |
| 9.2 我国治疗性疫苗的进展 |
| 9.2.1 口服幽门螺旋杆菌疫苗 |
| 9.2.2 乙肝治疗性疫苗 |
| 9.2.3 子宫颈癌治疗疫苗 |
| 9.2.4 艾滋病疫苗 |
| 9.2.5 疟原虫感染与肺癌DNA疫苗联用 |
| 9.2.6 其它的基因疫苗的研究成果[39-42] |
| 9.2.7 细胞疫苗 |
| 10 多糖 |
| 10.1 毛细管电泳法分析肝素 |
| 10.2 低分子硫酸皮肤素 (LMWDS) [44] |
| 10.3 羧甲基壳聚糖钙 |
| 10.4 低分子壳聚糖衍生物 |
| 10.5 海参岩藻聚糖硫酸酯 (SC-FUC) |
| 10.6 海洋硫酸多糖 |
| 10.7 岩藻硫酸酯 |
（5）穿膜肽Tat PTD介导的内皮抑素穿透眼球屏障及对眼部血管增生抑制作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 内皮抑素 |
| 1.1 内皮抑素的起源与发展 |
| 1.2 内皮抑素的表达 |
| 1.3 内皮抑素的应用 |
| 1.4 内皮抑素存在的问题及改进方法 |
| 2 Tat蛋白转导域(Tat prtotein transduction domain,Tat PTD) |
| 2.1 Tat PTD起源与结构 |
| 2.2 Tat PTD的入胞机制 |
| 2.3 Tat PTD的应用 |
| 3 本课题的设计思路及拟解决的问题 |
| 第二章 Tat PTD-endostatin的制备 |
| 第一节 Tat PTD-endostatin在毕赤酵母中的表达纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及质粒 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 常用溶液配制方法 |
| 1.4 试剂与材料 |
| 1.5 实验中所用的仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 毕赤酵母表达载体pGAPZαA-Tat PTD-endostatin(pG/TE)的构建 |
| 2.2 目的基因的构建 |
| 2.3 目的基因的克隆 |
| 2.4 表达Tat PTD-Es的毕赤酵母工程菌株的构建 |
| 2.5 重组Tat PTD-Es蛋白的表达与鉴定 |
| 2.6 重组Tat PTD-Es的分离纯化 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 目的基因的获得 |
| 3.2 表达载体的构建与验证 |
| 3.3 表达Tat PTD-Es毕赤酵母工程菌株的构建及验证 |
| 3.4 重组Tat PTD-endostatin蛋白的表达与鉴定 |
| 3.5 重组Tat PTD-Es蛋白的分离纯化 |
| 4. 讨论 |
| 第二节 Tat PTD-endostatin在大肠杆菌中的表达、复性及纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及质粒 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 常用溶液配制方法 |
| 1.4 试剂与材料 |
| 1.5 实验中所用的仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 大肠杆菌表达质粒pET28a/Tat PTD-endostatin(pET28a/TE)的构建 |
| 2.2 目的基因的构建 |
| 2.3 目的基因的克隆 |
| 2.4 表达Tat PTD-Es的大肠杆菌菌株构建 |
| 2.5 Tat PTD-Es在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.6 Tat PTD-Es包涵体复性及纯化 |
| 2.7 纯化样品Tat PTD-Es的鉴定 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 大肠杆菌表达质粒pET28a/TE的测序 |
| 3.2 阳性Rossetta菌株的鉴定 |
| 3.3 包涵体洗涤条件的摸索 |
| 3.4 蛋白浓度标准曲线 |
| 3.5 纯化后样品的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 Tat PTD-Es的体外活性及入胞机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞株及种蛋 |
| 1.2 常用溶液配制方法 |
| 1.3 试剂与材料 |
| 1.4 实验中所用的仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 Tat PTD-Es及Es对内皮细胞的作用 |
| 2.2 Tat PTD-Es及Es对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的作用 |
| 2.3 Tat PTD-Es的入胞机制考察 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Tat PTD-Es及Es对内皮细胞的作用 |
| 3.2 Tat PTD-Es及Es对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的作用 |
| 3.3 Tat PTD-Es与Es入胞能力的比较 |
| 3.4 Tat PTD-Es的入胞机制研究 |
| 4 讨论 |
| 第四章 Tat PTD-Es穿透眼球屏障的能力与体内药效学研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 常用溶液配制方法 |
| 1.3 试剂与材料 |
| 1.4 实验中所用的仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 Tat PTD-Es穿透眼球屏障的研究 |
| 2.2 Tat PTD-Es对脉络膜新生血管(CNV)的作用 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Tat PTD-Es穿透眼球屏障的研究 |
| 3.2 Tat PTD-Es对CNV的作用 |
| 4 讨论 |
| 总结与展望 |
| 1 全文结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）乳糖诱导重组人内皮抑素在大肠杆菌中的表达（论文提纲范文）
| 1 仪器与试药 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 SDS-PAGE检测及目的蛋白定量 |
| 2.2 菌株生长曲线的测定 |
| 2.3 乳糖诱导条件的优化 |
| 2.4 最佳诱导表达条件下乳糖和IPTG诱导效果比较 |
| 3 讨论 |
（7）肿瘤抑素基因表达与肾癌关系以及鸟氨酸脱羧酶基因表达对肿瘤抑素表达调控作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 人肿瘤抑素原核表达载体的构建、表达、纯化及其多克隆抗体的制备 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 肿瘤抑素基因表达与肾癌关系的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 鸟氨酸脱羧酶基因表达对肿瘤抑素表达调控作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
（8）人内皮抑素基因的定点突变及其在大肠杆菌中的表达（论文提纲范文）
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 质粒及菌株 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 突变位点的设计 |
| 1.4 重叠延伸PCR法引入突变 |
| 1.5 重组克隆质粒的构建及测序 |
| 1.6 重组表达质粒的构建 |
| 1.7 人内皮抑素突变基因的诱导表达 |
| 2. 结果 |
| 2.1 突变蛋白结构预测 |
| 2.2 重叠延伸PCR结果 |
| 2.3 重组克隆质粒的鉴定 |
| 2.4 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.5 表达产物的鉴定 |
| 3. 讨论 |
（10）融合蛋白Append的原核表达及活性测定（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 文献综述 |
| 发表的论着 |
| 附录 |
四、人内皮抑素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达（论文参考文献）
- [1]长效稳定表达的杆状病毒基因传递载体系统的构建及其在肿瘤抗血管生成基因治疗中的应用[D]. 李梦婷. 宁夏医科大学, 2020(08)
- [2]人与鼠源内皮抑制素不同标签重组蛋白的表达纯化及活性分析[J]. 杨益金,陆俊佳,覃霞,畅荣妮,赖青鸟,华荣,方玲,吴华裕,侯伟,吴飞翔,谢彤,袁志刚,舒伟. 过程工程学报, 2014(04)
- [3]TIE2基因启动子及内皮抑素基因表达载体的构建[D]. 陆俊佳. 广西医科大学, 2013(S1)
- [4]近年来我国生物技术药物研究进展和趋势[J]. 王友同,吴文俊,李谦,高美风. 药物生物技术, 2013(01)
- [5]穿膜肽Tat PTD介导的内皮抑素穿透眼球屏障及对眼部血管增生抑制作用的研究[D]. 张新科. 山东大学, 2012(12)
- [6]乳糖诱导重组人内皮抑素在大肠杆菌中的表达[J]. 杜翠红,戴飞红. 中国医药工业杂志, 2010(11)
- [7]肿瘤抑素基因表达与肾癌关系以及鸟氨酸脱羧酶基因表达对肿瘤抑素表达调控作用的研究[D]. 徐春晓. 山东大学, 2010(09)
- [8]人内皮抑素基因的定点突变及其在大肠杆菌中的表达[J]. 杜翠红,曹敏杰,游品升,高体琪. 中国生物制品学杂志, 2009(05)
- [9]人分泌型内皮抑素基因的克隆及表达[J]. 杨健,张晓萍. 解放军预防医学杂志, 2007(04)
- [10]融合蛋白Append的原核表达及活性测定[D]. 姚站馨. 中国人民解放军军事医学科学院, 2007(04)