白血病细胞多药耐药基因表达与化疗耐药关系的研究

一、白血病细胞多药耐药基因表达与化疗耐药关系的研究（论文文献综述）

李雅竹^[1]（2021）在《浙贝黄芩汤干预Wip1-p38MAPK-p53通路逆转白血病细胞耐药的机制》文中指出目的观察浙贝黄芩汤对人髓系白血病细胞株Kasumi-1增殖、凋亡及化疗敏感性的影响,分析浙贝黄芩汤对Wip1-p38MAPK-p53通路及细胞自噬的干预作用,探索浙贝黄芩汤抗白血病效应的分子机制。方法1.检测kasumi-1细胞的化疗敏感性。使用不同浓度的化疗药物柔红霉素、阿糖胞苷分别干预白血病细胞系kasumi-1,以对化疗较敏感的HL-60细胞作为对照,MTS法检测各组细胞的OD490吸光值,计算不同药物浓度下细胞抑制率及IC50值,测知kasumi-1的药物敏感性。2.使用不同浓度的浙贝黄芩汤醇提物干预kasumi-1,MTS法检测各组细胞抑制率。3.将kasumi-1细胞分为三组,化疗组、联合组、空白组。化疗组应用阿糖胞苷加柔红霉素处理,联合组应用浙贝黄芩汤醇提物联合阿糖胞苷及柔红霉素处理,空白组无干预,MTS法检测各组细胞增殖抑制率,流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染检验凋亡率。4.Real-time PCR、Western blot 法检测各组 Wip1、p38MAPK、p53 mRNA 表达变化。5.探索性研究浙贝黄芩汤对kasumi-1细胞自噬的影响,Western blot法检测LC3蛋白表达变化情况。结果1.柔红霉素 0.01 ug/ml、0.02 ug/ml、0.05 ug/ml、0.1 ug/ml、0.5 ug/ml、1 ug/ml、2 ug/ml、5 ug/ml 分别作用于 kasumi-1 细胞,抑制率为-7.21±5.5、-6.47±5.84、0.02±4.60、0.97±8.78、47.6±2.04、62.67±1.00、62.52±1.41、56.94±1.12;以髓系白血病 HL-60 作为对照,柔红霉素按上述浓度0.01 ug/ml～1 ug/ml分别作用于HL-60,抑制率为6.46±5.54、23.94±3.26、58.47±1.73、63.07±2.15、73.25±0.3、73.25±0.16。柔红霉素对kasumi-1 的 IC50 为 2.833ug/ml,HL-60 为 0.092 ug/ml,kasumi-1 对柔红霉素的耐药倍数为30.79。选择柔红霉素0.1ug/ml进行后续实验。阿糖胞苷 0.1mg/ml、0.5mg/ml、1 mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml、10 mg/ml、20 mg/ml 分别作用于 kasumi-1,抑制率为 17.65±9.34、22.09±10.16、27.64±6.10、37.13±6.05、46.06±4.61、64.86±1.23、69.55±1.35、77.92±0.52。阿糖胞苷 0.01 mg/ml、0.02 mg/ml、0.05 mg/ml、0.1 mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、5 mg/ml分别作用于 HL-60,抑制率为 28.51±1.92、45.55±5.81、63.36±4.56、68.64±7.03、70.92±2.18、72.99±2.32、64.79±2.32、74.42±1.16。阿糖胞苷对 kasumi-1 的 IC50 为 7.820mg/ml,HL-60为0.070 mg/ml,kasumi-1对阿糖胞苷的耐药倍数为111.71。选择阿糖胞苷2mg/ml进行后续实验。2.浙贝黄芩汤醇提物 25mg/ml、50mg/ml、100 mg/ml、200 mg/ml、400 mg/ml、800 mg/ml、1600 mg/ml 分别作用于 kasumi-1,抑制率分别为 15.17±2.57、17.59±2.62、24.72±1.84、24.99±3.79、23.74±2.25、25.44±1.45、21.27±0.66。选择浙贝黄芩汤醇提物200ug/ml进行后续实验。3.kasumi-1细胞分为三组,化疗组干预药物为柔红霉素0.1ug/ml+阿糖胞苷2mg/ml,联合组干预药物为浙贝黄芩汤200ug/ml+柔红霉素0.1ug/ml+阿糖胞苷2mg/ml,空白组无干预。药物干预48h后,MTS法检测增殖抑制率,化疗组为29.00±2.85,联合组为62.52±2.13,差异具有统计学意义（P<0.05）。药物干预24h后,AnnexinV/PI双染,流式细胞仪检测凋亡率,空白组、化疗组及联合组早期凋亡率分别为4.14%、10.4%、23.5%,晚期凋亡率 1.7%、3.37%、7.48%,总体凋亡率 5.84%、13.77%、30.98%。浙贝黄芩汤醇提物可部分逆转kasumi-1细胞的化疗抗性,促进其凋亡。4.浙贝黄芩汤醇提物可明显降低kasumi-1细胞Wip1、p38、p53 mRNA表达量。Real-time RCR检测,空白组、化疗组、联合组Wip1 mRNA相对表达分别为1、73.52773±1.27401、6.587956±6.5439,p38 mRNA 相对表达分别为 1、26.65348±26.60724、0.005633±0.000147,p53 mRNA 相对表达分别为 1、127.2598±14.27375、10.51457±10.37919,差异均具有统计学意义（P<0.05）。化疗组Wip1、p38、p53 mRNA相对表达量较空白组均明显升高,浙贝黄芩汤与化疗伍用可显着减低上述基因的表达。Western blot结果显示联合组较化疗组p38MAPK蛋白表达明显降低,Wip1及p53蛋白未见条带显影。5.浙贝黄芩汤可促进kasumi-1细胞自噬。Western blot结果显示,单纯使用柔红霉素及阿糖胞苷化疗组,kasumi-1自噬蛋白LC3明显降低,联合组LC3蛋白含量明显增加。结论浙贝黄芩汤通过调控Wip1-p38MAPK-p53通路逆转髓系白血病细胞耐药。

徐阳^[2]（2021）在《基于组学数据探索胰腺癌和结直肠癌耐药及其逆转机制》文中认为胰腺癌和结直肠癌都是常见且恶性程度较高的消化道肿瘤,化疗是其主要的治疗手段。胰腺癌因其发生隐匿,进展迅速,大多数患者诊断时已失去手术的机会只能采取化疗等手段来延缓病情,延长生存期。相对于胰腺癌,结直肠癌可通过肠镜等方法进行早期筛查,然而由于肠镜的普及率较低,大多数患者在确诊时已经存在转移,因此也需要化疗来控制病情、配合手术前后的辅助治疗。接受化疗的患者在治疗初期通常病情会有好转,但是在后续治疗中因为化疗耐药,肿瘤会复发甚至转移。所以找到肿瘤耐药机制、逆转肿瘤的耐药,寻找肿瘤耐药及逆转的靶向基因或通路,对于指导临床治疗、提高化疗疗效具有重要的理论和实际意义。本实验为了研究胰腺癌的5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）耐药机制,采用药物连续诱导的方法自行构建了人胰腺癌5-Fu耐药细胞株Aspc-1/5-Fu和Bx PC-3/5-Fu。同时,我们从国家实验细胞资源共享平台购买了人结直肠癌耐长春新碱（Vincristine,Oncovin,VCR）细胞株HCT-8/VCR及其亲本细胞系HCT-8。随后,应用药物重定位策略（老药新用）,使用五种“老药”（阿司匹林、褪黑素、二甲双胍、叶酸和地西他宾）来处理HCT-8/VCR和As PC-1/5-Fu和Bx PC-3/5-Fu耐药细胞株,发现褪黑素和阿司匹林对于逆转HCT-8/VCR细胞系长春新碱耐药和As PC-1/5-Fu和Bx PC-3//5-Fu细胞株对于5-Fu耐药具有很好作用。采用本课题组设计的药物处理方法,来探索获得性耐药细胞在转录组和表观遗传组之间可能存在的联系。以As PC-1和As PC-1/5-Fu为例,先将这两种细胞在无5-Fu的培养基中培养48小时以消除可能存在的药物残留影响,再使用5-Fu处理,对取处理0h、24h和48h的As PC-1和As PC-1/5-Fu细胞系样本进行RNA-seq测序检测基因表达谱;取处理0h和48h的样本进行甲基化检测。再分别取经阿司匹林和褪黑素处理的这两类细胞系样本同时进行RNA-seq测序和甲基化检测。对于得到的基因表达谱数据,本研究采用本课题组设计的专为小样本细胞系开发的差异表达基因识别算法Cell Comp以识别胰腺癌和结直肠癌相关耐药基因并进行通路富集分析以识别药物作用相关基因和通路。对于结直肠癌,阿司匹林和褪黑素逆转HCT-8/VCR细胞系长春新碱耐药相关基因同时富集到Cell cycle和Cellular senescence通路,这两个通路也被在阿司匹林逆转5-Fu耐药过程中同时发生表达和甲基化改变的基因所富集到。所以这两个通路可能是在HCT-8/VCR长春新碱耐药及阿司匹林和褪黑素逆转其耐药过程中发挥关键作用的通路。对于胰腺癌,其5-Fu耐药细胞系As PC-1/5-Fu和BXPC-3/5-Fu的5-Fu耐药相关基因同时富集到TNF signaling pathway和Epstein-Barr virus infection这两个通路。阿司匹林和褪黑素逆转As PC-1/5-Fu细胞系5-Fu耐药基因同时富集到Epstein-Barr virus infection通路,暗示该通路可能在阿司匹林和褪黑素逆转胰腺癌5-Fu耐药中发挥重要作用。通过对Epstein-Barr virus infection通路进一步研究发现其中的HDAC2基因是经过阿司匹林和褪黑素处理后发生逆转的耐药基因,并且该基因与接受5-Fu-based化疗方案的胰腺癌患者的生存显着相关,提示HDAC2基因可能在胰腺癌5-Fu耐药中有重要作用。通过整合STRING数据库的蛋白质互作网络和胰腺癌细胞系的共表达关系,本课题发现阿司匹林可以通过HDAC2/TP53/TYMS通路达到一定程度逆转As PC-1/5-Fu细胞对5-Fu的耐药性。本课题首先构建了2株胰腺癌耐药细胞株,并利用基因测序找出肿瘤（胰腺癌和结直肠癌）耐药细胞株与亲本细胞株之间差异表达的基因和差异甲基化基因,丰富了肿瘤耐药相关机制。然后采用5种“老药”进行逆转耐药实验,同时运用本课题组设计的专为小样本细胞系开发的差异表达基因识别算法Cell Comp识别胰腺癌和结直肠癌相关耐药基因,并进行通路富集分析以识别药物作用相关基因和通路。本课题为胰腺癌和结直肠癌的防治提出了开放性的临床治疗思路,具有广泛的理论与应用价值。

刘萍^[3]（2021）在《Nrf2过表达通过抑制MSH2促进急性髓系白血病耐药的机制研究》文中研究说明背景:核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2）是一种关键的转录因子,能够减轻机体氧化损伤。近年来,Nrf2已被证明可能促进肿瘤的发展,导致肿瘤细胞对化疗耐药,这给临床治疗带来巨大挑战。急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种髓系原始幼稚细胞异常分化的恶性造血干细胞疾病,其中复发难治性AML的治疗至今仍然是一个挑战。急性白血病细胞对多种化疗药物产生原发或继发耐药是复发难治的重要原因,且基因突变与AML预后不良、复发难治密切相关。然而,Nrf2是否通过影响基因不稳定性导致AML化疗耐药的机制尚不清楚。目的:本课题旨在验证Nrf2表达对基因突变频率的影响,并探明其在AML中介导基因不稳定型耐药的分子机制。方法:1.临床样本收集:按照《成人急性髓系白血病（非APL）中国诊疗指南（2018年版）》、《复发难治性急性髓系白血病中国诊疗指南（2017年版）》纳入初诊及复发难治的AML患者为研究对象,收集初诊或复发未用药的骨髓血样本,Ficoll分离液分离骨髓单个核细胞,Trizol提取RNA,逆转为cDNA,以备检测转录组表达水平;DNA提取试剂盒提取骨髓AML干祖细胞的DNA,以备检测AML常见基因突变。2.分析Nrf2表达与AML化疗耐药、基因突变频率的相关性:real-time-PCR检测完全缓解、复发耐药AML患者初诊样本中Nrf2表达,按2-ΔΔCT计算Nrf2表达量,并分为高低两组,全外显子测序检测各样本单个核细胞的基因突变情况。通过western blot和real-time PCR,对AML样本进行检测基因突变组和未突变组中Nrf2的表达情况。同时,采用Oncomine数据库分析其他中心AML临床样本中热点突变患者的Nrf2转录表达水平。3.转录组测序检测临床样本,分析Nrf2基因表达不同的两组间差异信号通路:本研究对来自7个AML患者样本的单个核细胞（包括3个Nrf2高表达与4个Nrf2低表达）进行转录组测序,并进行热图、京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）相关信号通路分析。在AML临床样本上分别通过western blot、real-time PCR和免疫细胞化学检测Nrf2与DNA错配修复基因的关系。4.体外细胞株实验验证转录组测序检测结果:10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养2种人源AML细胞株——Kasumi-1和THP1。通过构建上调/沉默Nrf2表达的慢病毒,按照操作说明对Kasumi-1和THP1进行慢病毒转染。相应的空载体（empty vector,EV）作为Nrf2过表达和沉默组的对照细胞组。用2μM阿糖胞苷（cytarabine,Ara-C）处理细胞24h,利用Hoechst33342染色、Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡变化,DCFH-DA检测胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生。5.选择18-25g的NOD/SCID/IL2Rγc-deficient雌性小鼠构建AML模型。通过在小鼠左前腋下进行皮下注射稳定转染Nrf2慢病毒的THP-1细胞,实验分为4组:Nrf2-THP1组、EV-THP1组、Nrf2-THP1+Ara-C组和EV-THP1+Ara-C组。通过腹腔注射荧光素酶底物D-Luciferin,活体成像仪观察肿瘤负荷情况。每周3次监测肿瘤大小,记录小鼠生存时间。小鼠牺牲后收集肿瘤包块进行石蜡包埋病理切片观察。6.通过Gene MANIA数据库结合western blot检测分析Nrf2介导基因不稳定性耐药的相关信号通路与JNK有关。并用JNK通路抑制剂SP600125（10μM）预处理细胞24h,western blot检测通路蛋白表达变化,使用ImageJ软件分析每个蛋白条带的灰度值。7.数据统计分析:采用SPSS20.0、Graph Pad Prism 7.0、ImageJ软件进行数据统计分析,数据均以均数±标准差（（?）±s）表示,数据符合正态分布,且通过方差齐性检验,两组间分析采用独立样本t检验,多组间分析采用单因素方差分析,P<0.05差异有统计学意义。结果:1.研究首先发现Nrf2基因在复发耐药的AML样本中表达显着升高,且Nrf2高表达的AML具有较高的肿瘤突变负荷;Nrf2的基因和蛋白表达在AML基因突变组中均表达升高。2.Nrf2表达与DNA错配修复通路相关。在Nrf2高表达和低表达组的AML临床样本中检测DNA错配修复基因（MSH2、MLH1、POLD2、RFC4、PMS2和MSH6）的基因表达量,结果发现Nrf2高表达组的MSH2表达显着降低。在蛋白表达水平中,Nrf2高表达组的AML样本中MSH2蛋白表达降低。3.Nrf2过表达在体外保护AML细胞免受Ara-C诱导的凋亡,同时抑制MSH2蛋白的表达,而沉默AML细胞系中的Nrf2,则增加肿瘤细胞对Ara-C的敏感性,且MSH2蛋白表达升高。进一步研究发现Nrf2过表达组胞内ROS降低,H2O2处理Nrf2过表达组细胞后并不增加MSH2蛋白的表达。然而,在Nrf2沉默组中,ROS清除剂N-乙酰基-L半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）预处理细胞清除ROS后,MSH2蛋白表达降低。4.在AML小鼠模型中,Nrf2过表达组的AML细胞肿瘤较对照组增长较快,且对Ara-C不敏感,生存期明显缩短。同时Nrf2过表达的肿瘤组织中MSH2表达显着减少。5.Nrf2过表达的细胞中JNK/c-Jun信号通路被激活,并抑制了MSH2蛋白的表达。当用JNK抑制剂SP600125阻断该信号通路后Nrf2过表达组的MSH2蛋白较前表达升高。结论:1.Nrf2高表达增加了AML患者的基因突变风险,与AML复发耐药密切相关。2.Nrf2通过影响AML的DNA错配修复途径导致基因不稳定型耐药。3.高表达的Nrf2通过抑制MSH2蛋白的表达增加基因不稳定型耐药的风险。4.Nrf2以不完全依赖于ROS的方式抑制MSH2蛋白的表达。5.Nrf2过表达通过激活JNK/c-Jun信号通路介导化疗耐药。

牛亚娜^[4]（2021）在《红景天苷增强急性淋巴细胞白血病CEM-C1耐药细胞对地塞米松敏感性的研究》文中研究表明目的:急性淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）是儿童最常见的恶性肿瘤,几乎占儿童恶性肿瘤的三分之一。糖皮质激素(（Glucocorticoid,GC）耐药仍然是ALL患儿面临的挑战。传统中药具有抗肿瘤细胞增殖、促凋亡的作用,可以作为化疗中的辅助药物。红景天苷（Salidroside,SAL）具有抗肿瘤及增强肿瘤化疗敏感性等作用,但未见SAL抗白血病作用的报道。因此本实验旨在探讨SAL对人T-ALL细胞系CEM-C7和CEM-C1细胞增值、凋亡和自噬的影响及其是否可以增强GC耐药CEM-C1细胞对地塞米松（Dexamethasone,DEX）的敏感性,为克服白血病细胞耐药提供新的治疗策略。方法:1.细胞培养:通过体外细胞培养人T-ALL细胞系CEM-C7和CEM-C1细胞。2.实验分组:（1）根据SAL的干预浓度（5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、10.0mg/ml、12.5 mg/ml和15.0 mg/ml）将CEM-C7和CEM-C1细胞分别分为5组;（2）根据DEX的干预浓度（25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml和200μg/ml）将CEM-C7、CEM-C1细胞分别分为5组;以及DEX不同浓度（25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml和200μg/ml）联合SAL（1.5 mg/ml）将CEM-C7和CEM-C1细胞分别分为5组;（3）根据T-ALL细胞系CEM-C7与耐药细胞系CEM-C1是否经SAL优化浓度（0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5mg/ml、10.0 mg/ml）处理分别分为4组;（4）CEM-C1细胞根据SAL是否联合DEX分为对照组、SAL组（1.5 mg/ml）、DEX组（100μg/ml）、联合组（DEX 100μg/ml+SAL 1.5mg/ml）。3.CCK-8（Cell counting kit-8）:（1）检测不同浓度的SAL处理24h、48h、72h后CEM-C7、CEM-C1细胞的增殖活性影响;（2）检测不同浓度的DEX干预以及不同浓度的DEX联合SAL作用后,各组细胞的增殖活性影响;（3）同时确定SAL对CEM-C7、CEM-C1细胞的IC50,并计算出耐药倍数、逆转耐药倍数和相对逆转率。4.细胞凋亡:通过流式细胞仪检测不同浓度（0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5mg/ml、10.0 mg/ml）SAL干预48h后CEM-C1和CEM-C7细胞凋亡情况;以及SAL是否联合DEX处理CEM-C1细胞后各组细胞凋亡情况。5.细胞周期:通过流式检测不同浓度（0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、10.0 mg/ml）SAL干预CEM-C7和CEM-C1细胞48h后周期的改变。6.实时荧光定量PCR:检测不同浓度（0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、10.0 mg/ml）SAL干预CEM-C7和CEM-C1细胞48h后后C-MYC和LC3m RNA的表达情况。7.吖啶橙染色:检测不同浓度（0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、10.0 mg/ml）SAL干预48h后CEM-C7和CEM-C1细胞自噬的情况。8.Western Blot:（1）检测CEM-C7和CEM-C1细胞中C-MYC蛋白的表达变化;（2）检测不同浓度（0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、10.0 mg/ml）SAL处理CEM-C7和CEM-C1细胞48h后,自噬蛋白、凋亡蛋白和C-MYC蛋白表达变化;（3）检测SAL是否联合DEX处理CEM-C1细胞后,各组细胞自噬蛋白、凋亡蛋白和C-MYC蛋白表达情况。结果:1.SAL抑制T-ALL细胞增殖:（1）SAL呈剂量依赖方式抑制CEM-C7、CEM-C1细胞增殖;（2）SAL对CEM-C7和CEM-C1细胞的48h IC50分别是8.03mg/ml和6.69 mg/ml。2.SAL促进T-ALL细胞的凋亡:（1）流式细胞仪检测发现随着SAL浓度的增加,凋亡率显着增加（P<0.001）;（2）SAL能诱导细胞凋亡,同时伴有BCL-2蛋白的下调以及Cleaved-PARP蛋白和Bax蛋白的上调（P<0.01）;（3）与单用DEX组比较,联合组（SAL+DEX）能够更显着地诱导GC耐药CEM-C1细胞凋亡（P<0.01）。3.SAL将CEM-C7细胞阻滞于S期（P<0.01）,而对CEM-C1细胞周期无影响（P>0.05）。4.SAL促进T-ALL细胞的自噬:（1）吖啶橙染色检测到SAL促进ALL细胞自噬;（2）SAL可促进CEM-C7和CEM-C1细胞自噬,同时伴有LC3基因与蛋白水平升高（P<0.001）;（3）与单用DEX组比较,联合组（SAL+DEX）能够更显着地诱导GC耐药CEM-C1细胞自噬（P<0.001）。5.SAL对CEM-C1细胞耐药的逆转作用:（1）不同浓度的DEX干预48h后,CEM-C1细胞的IC50为（111.83±2.87）μg/ml,CEM-C7细胞的IC50为（0.67±0.02）μg/ml,耐药倍数为166.92倍;（2）SAL联合DEX后,CEM-C1细胞对DEX的IC50下降到（35.59±3.73）μg/ml,逆转耐药倍数为3.14（t=16.21,P=0.000）,相对逆转率为0.69,表明SAL（1.5mg/ml）对CEM-C1的耐药逆转为部分逆转作用;（3）与单用DEX组相比,联合组（SAL+DEX）对CEM-C1细胞的抑制率明显增加（P<0.001）,且两药相互作用指数（Coefficientofdrug interaction,CDI）均<l。6.SAL下调CEM-C1耐药细胞C-MYC m RNA及蛋白表达:（1）与CEM-C7细胞相比,CEM-C1细胞中C-MYC蛋白表达显着增加（t=12.75,P=0.000）;（2）SAL呈剂量依赖性下调C-MYC基因与蛋白表达水平（P=0.000）;（3）与单用DEX组比较,联合组（SAL+DEX）够更显着地下调GC耐药CEM-C1细胞中C-MYC的表达（P<0.01）。结论:1.SAL可显着抑制CEM-C7和CEM-C1细胞的增殖,促进白血病细胞凋亡、诱导细胞自噬。2.SAL能增强CEM-C1细胞对DEX的敏感性,部分逆转CEM-C1细胞对GC的耐药性,其机制可能与C-MYC下调有关。

程国荣^[5]（2021）在《中药逆转肿瘤多药耐药及侵袭转移作用机制研究》文中提出恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病,肿瘤细胞多药耐药（Multidrug resistance,MDR）和侵袭转移的发生是临床上肿瘤治疗失败的主要原因。针对MDR和侵袭转移机制从中药中寻找高效、低毒的活性成分是目前抗肿瘤研究的重要课题之一。本论文从分子水平和细胞水平两方面出发,利用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）筛选潜在的抗肿瘤活性成分,并基于代谢组学和细胞生物学相结合的研究策略对活性成分的逆转机制及抑制肿瘤侵袭转移作用机制进行深入研究。针对糖酵解过程中的关键限速酶-乳酸脱氢酶（LDH）在许多肿瘤细胞中高表达,被认为是浸润性癌重要靶点的特性,以LDH为靶分子,从中药中筛选其抑制剂。同时基于MDCK-MDR1细胞模型,进行P-糖蛋白（P-gp）介导的MDR逆转剂的筛选。1、中药中LDH抑制剂筛选建立固定化LDH方法,从大黄和虎杖中筛选潜在抑制剂。首先,以磁纳米粒子（MNPs）为载体,经氨基化修饰后,将LDH以共价键合的方式固定在MNPs表面,得到固定化LDH。为了获得最大的酶活力,采用单因素与响应面相结合的方法对固定化条件进行了优化,包括pH值、固定化时间和LDH浓度。在pH值为5.85、反应时间为3.14h、LDH浓度为0.37 mg/mL时,固定化LDH酶活性最佳,此时,LDH固定在MNPs上的量约为49μg/mg。随后,以galloflavin（阳性对照）、绿原酸和毛蕊花糖苷（阴性对照）为模型混合物,进行配体垂钓实验,对固定化LDH的特异性和选择性进行验证。最后,将固定化LDH方法与UPLC-MS/MS相结合,从两种富含蒽醌类化合物的天然产物（大黄和虎杖）中筛选潜在LDH抑制剂。从大黄和虎杖提取物中分别筛选并鉴定出9个和6个化合物,其中有3个化合物为二者所共有,这进一步证实了该方法的可行性。2、基于MDCK-MDR1细胞的P-gp抑制剂筛选利用P-gp过表达的MDCK-MDR1细胞,通过细胞毒性、罗丹明-123（Rh-123）蓄积与外排、Western blot实验和转运实验,对虎杖和白屈菜两种中药提取物及其主要成分进行P-gp抑制剂筛选研究。通过细胞毒性实验确定各个药物的IC20值,蒽醌类和多酚类化合物选择40、20、10 μM进行后续研究。Rh-123蓄积与外排实验显示虎杖提取物比白屈菜提取物对P-gp的抑制作用更强。对三类单体化合物比较,蒽醌类化合物对P-gp抑制作用最强,尤其是芦荟大黄素和大黄酚,其次是多酚类和3个毒性较大的生物碱。另外,通过不同药物处理时间对Rh-123蓄积的影响可以初步推测除虎杖苷、白藜芦醇三甲醚和白屈菜红碱外,其余化合物既能抑制P-gp的功能,又能抑制P-gp的表达。Western blot实验结果表明除虎杖苷和白屈菜红碱外,其余化合物均能抑制P-gp表达。选择效果最强的蕙醌类化合物芦荟大黄素、大黄酚和文献报道较多的白藜芦醇进行转运研究,结果表明芦荟大黄素和白藜芦醇能显着抑制P-gp底物地高辛的外排,而大黄酚没有这种抑制作用。此外,我们还补充了 5个结构相近且毒性较小的生物碱进行研究,发现苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱、氧化槐果碱对P-gp均有较好抑制作用,有望成为MDR逆转剂。3、芦荟大黄素（AE）逆转MDR机制研究基于乳腺癌MCF-7/ADR细胞耐药模型,研究AE的逆转效果及机制。AE能显着逆转MCF-7/ADR细胞对阿霉素（ADR）的耐药性,其逆转指数为4.86。20μMAE与ADR联用对P-gp的表达没有抑制作用,但能显着促进ADR在耐药细胞中的蓄积。通过荧光显微镜观察,显示AE能使ADR更多的进入细胞核中,细胞核是ADR发挥抗肿瘤作用的场所。P-gp对ADR的外排需要ATP水解提供能量,而AE能降低细胞内ATP水平,因而推测AE通过抑制P-gp的外排功能来发挥逆转作用。能量代谢途径的研究结果表明,AE与ADR联用可抑制糖酵解、TCA循环、谷氨酰胺代谢及相关氨基酸合成途径。此外,我们还发现AE不仅可以逆转ADR诱导的耐药,还可以诱导自噬作为防御机制,抑制这一过程可增强AE的逆转活性。此外,AE与ADR联合用药还可以导致MCF-7/ADR细胞G2/M期阻滞并通过DNA损伤、ROS生成、caspase-3激活诱导细胞凋亡。4、芦荟大黄素（AE）和大黄素（EMD）抑制乳腺癌侵袭转移作用机制研究采用基于UPLC-Q-TOF/MS技术的代谢组学方法对乳腺癌MCF-7细胞与人脐血静脉内皮细胞HUVEC共培养模型进行了考察,筛选并鉴定出25个生物标志物,涉及谷胱甘肽代谢、甲硫氨酸循环、嘌呤代谢和TCA循环等代谢通路,这些代谢通路均与肿瘤的恶性表型有关。采用共培养模型研究AE和EMD这两个同分异构体对MCF-7细胞侵袭转移的抑制作用。结果表明AE可以抑制MCF-7细胞的黏附、侵袭及血管生成,而EMD主要是抑制黏附。通过代谢组学的方法研究AE和EMD抑制MCF-7细胞侵袭转移的作用机制。AE和EMD组分别筛选出27个和13个生物标志物,涉及多胺代谢、维生素B6代谢、甲硫氨酸循环、TCA循环、谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢和天冬氨酸合成等通路。选择这些通路上的典型代谢物进行定量分析,发现AE能显着降低这些代谢物的含量且效果明显强于EMD。

葛宁^[6]（2021）在《KCNMA1的上调促进维拉帕米逆转食管鳞状细胞癌对顺铂的化学耐药》文中研究说明研究背景:食管癌（esophagus cancer,EC）是消化系统常见的恶性肿瘤之一,2018年,全球新增57万例EC患者,且有50万例患者死于EC[1]。全球食管癌新增和死亡病例约有一半发生在中国,其在我国的发病率和死亡率占第六和第四位[2]。食管癌主要包括食管鳞状细胞癌（sophageal squamous cell carcinoma,ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma,EAC）两个亚型,美国和欧洲国家主要以EAC亚型为主,而我国食管癌患者90%以上都是ESCC亚型。目前手术、放疗和化疗是ESCC三大主要治疗手段。手术是早期局限性病灶患者的首要治疗方式,但由于早期食管癌临床症状不明显,很多患者发现即为中晚期而不能手术。放疗做为食管癌局部治疗主要手段之一,对于颈段食管癌及非手术食管癌具有不可替代的作用,但对于病灶长度较长及放疗后复发的患者作用有限。化学治疗和靶向药物治疗可部分延长中晚期或术后食管癌患者生存时间,受肿瘤耐药性的限制,标准化疗方案对晚期食管癌的反应率只有30%左右。探索食管癌细胞对化疗药物的耐药性,对食管癌治疗具有非常重要的临床意义。肿瘤细胞的耐药性有单药耐药和多药耐药两种形式,多药耐药是较为多见的耐药形式。既往研究认为药物耐药性与细胞内药物的浓度与分布改变、抗氧化体系激活、DNA损伤修复系统活化和细胞外基质等各种因素相关。维拉帕米（Verapamil,VER）是一种L-型的钙离子通道抑制剂,主要用于治疗心脑血管系统疾病。随着对其深入研究发现它可逆转肿瘤细胞多药耐药性（multidrugresistance,MDR）,有效逆转肿瘤多药耐药的浓度为6.0-10.0umol/L。传统静脉注射的安全浓度为1.0～2.0umol/L,但此浓度达不到有效逆转耐药浓度,通过动脉灌注药物的方式可使其局部组织浓度达到外周血液浓度的3-10倍。研究表明,通过VER逆转肿瘤的多药耐药,改善了化学药物治疗临床疗效,其中包括肝细胞癌、大肠癌、胃癌、肺癌和恶性腹水等。最初研究表明VER是通过调节P-gp蛋白的表达抗肿瘤MDR,VER能够抑制或下调P-gp的表达,阻止药物外排提高肿瘤化疗药物的杀伤作用。最近研究表明VER逆转肿瘤多药耐药的机制很有可能与P-gp无关。我们通过高通量筛选实验发现 SLIT3、KCNMA1、KLK1、LPAR1、CHRDL1、NID1 这6个候选基因与维拉帕米逆转耐药相关。其中KCNMA1基因在VER逆转ESCC细胞对顺铂（DDP,cisplatin）耐药中表达显着升高。本课题通过细胞实验、动物实验及临床资料层面研究KCNMA1基因表达与VER逆转肿瘤顺铂耐药之间的关系。第一章:KCNMA1的表达在VER逆转ESCC细胞耐药中的作用目的:本研究通过研究KCNMA1基因在ESCC组织和细胞中的表达差异,来研究KCNMA1基因的表达差异与VER逆转ESCC肿瘤耐药可能存在的关系,为肿瘤耐药的ESCC患者靶向治疗提供理论依据。基于这些实验,我们检测了 KCNMA1基因在ESCC中的表达;通过过表达或沉默表达KCNMA1基因,研究肿瘤细胞对顺铂的敏感性差异;通过经增强KCNMA1表达研究对ESCC增殖和凋亡的作用。通过这些实验,我们对VER逆转肿瘤MDR的机制有了更深的认识,为治疗ESCC患者提供临床证据。方法:1.CCK-8实验和集落形成实验验证检测VER联合顺铂对KYSE150、KYSE180和KYSE450三种ESCC细胞活力影响;2.高通量筛选测序,比较KYSE150、KYSE180中DPP组和VER+DPP组中基因表达差异,同时用qRT-PCR验证这种差异;3.WB检测VER组、DPP组、以及VER+DPP组中KCNMA1蛋白的表达;4.免疫组织化学法检测VER联合顺铂治疗的ESCC患者组织样本中KCNMA1的蛋白表达;5.通过沉默或过表达KCNMA1基因的表达,再用CCK-8法检测ESCC细胞对顺铂的细胞活力;6.通过抗增殖实验和凋亡实验,研究KCNMA1基因的表达与ESCC细胞增殖和细胞凋亡关系。结果:1.CCK-8实验和集落形成实验结果显示VER增加了 ESCC细胞对顺铂的敏感性,尤其是对KYSE150细胞,而VER对KYSE180细胞的作用小。因此本实验选择KYSE150细胞作为VER逆转敏感细胞,选择KYSE180细胞作为抗逆转模型细胞进行进一步研究;2.高通量转录测序结果显示,SLIT3、KCNMA1、NID1、KLK1、LPAR1和CHRDL1基因表达均表现出差异,并通过qRT-PCR验证了这种差异。与KYSE150 DDP组相比,KYSE150 DDP+VER组的KCNMA1表达明显上调,且KYSE150细胞中的KCNMA1表达水平高于KYSE180细胞中的表达水平;3.WB结果显示在KYSE180 DDP组和KYSE180 DDP+VER组之间,KCNMA1的蛋白表达没有显着差异,而在KYSE150 DDP+VER组中,KCNMA1显着上调;4.免疫组化结果表明对VER逆转方案呈现阳性患者中,KCNMA1的表达显着升高,而阴性患者中KCNMA1的表达无显着差异;5.通过过表达KCNMA1基因,可以显着增加KYSE150细胞对顺铂的敏感性,而沉默KCNMA1基因的表达后,KYSE150细胞对顺铂的敏感性下降;6.增殖和凋亡实验结果表明,KCNMA1的表达能够增强了 VER对ESCC细胞的抗增殖作用,也可以增强VER对ESCC细胞的促凋亡作用。结论:VER能够促进KCNMA1的表达,增强KYSE150细胞对顺铂的敏感性,其存在的机制可能是KCNMA1的表达能够增强顺铂对KYSE150细胞的抗增殖和促凋亡作用。第二章:KCNMA1的表达促进顺铂对移植瘤裸鼠抑制作用研究目的:本研究旨在分析在食管鳞状细胞移植瘤裸鼠中,KCNMA1的表达与VER逆转肿瘤对顺铂敏感性的相关性,探讨KCNMA1对ESCC治疗中的作用.方法：1.构建过表达和沉默KCNMA1KYSE150细胞模型,2.将ESCC细胞经皮下注射裸鼠.构建食管鳞状细胞癌模型,分为五组包括Control组、DPP组、DPP+VER组、siRNA-KCNMAl组和Over-KCNMAl+DPP组.待肿瘤体积生长至50mm2时,腹膜内注射2.0mg/kg的顺铂和1.Omg/kg的VER,比较各组裸鼠的肿瘤大小、肿瘤抑制率;3.免疫组化实验比较各组裸鼠组织中KCNMA1蛋白表达;4.WB与qRT-PCR实验检测三组裸鼠中KCNMA1的表达;结果:1.通过质粒转染和慢病毒转染制备KCNMA1过表达和表达沉默的KYSE150细胞珠,qRT-PCR和WB结果显示,Over-KCNMAl组中KCNMA1蛋白的表达显着高于vector组,而siRNA-KCNMA1组中KCNMA1蛋白的表达显着低于sh-NC组,表示过表达和沉默表达KCNMA1细胞模型构建成功;2.本实验中所有裸鼠均成瘤,且在治疗期间各组裸鼠肿瘤体积均随着时间推移不断增大,Over-KCNMAl+DPP组和DPP+VER组在14天之后肿瘤体积大小明显小于单独DPP组,而沉默KCNMA1的表达后,肿瘤组织体积显着增加;3.裸鼠肿瘤组织WB和qRT-PCR结果显示,Over-KCNMAl组和DPP+VER组中KCNMA1蛋白表达显着高于Control组和DPP组.结论:过表达的KCNMA1能够提高食管鳞状细胞癌组织对顺铂的敏感性,抑制肿瘤组织体积的生长;而沉默KCNMA1的表达,降低顺铂对裸鼠肿瘤的抑制作用.第三章:临床研究KCNMA1基因在食管鳞状细胞癌患者组织样本中的表达目的：本研究旨在分析经过维拉帕米联合化疗动脉灌注治疗的食管鳞状细胞癌患者数据,通过免疫组化法对不同治疗效果病例KCNMA1基因表达情况检测,探讨KCNMA1在ESCC动脉灌注治疗中的作用。方法：1.所有患者釆用Seldinger技术经股动脉穿刺每月介入治疗1次,每例患者介入治疗2-3次,介人治疗结束后第4周对疗效进行评估。方案为:维拉帕米（25 mg）+化疗药物（顺钻+5-氟尿嘧啶）?方法为:术前常规静脉滴注喘啶（0.25 mg）和地塞米松（5?10mg）;灌注过程中用肝素盐水间断冲洗导管35次,同时静脉滴注昂丹司琼（816 mg）和地塞米松（510 mg）?2.收集经过维拉帕米联合化疗动脉灌注治疗的食管鳞状细胞癌患者临床病例3.根据治疗效果将上述食管鳞状细胞癌患者临床病例分为四组,包括临床治愈或显着改善（CR）、临床治疗改善（PR）、临床治疗疗稳定（SD）和进行性或恶化（PD）.将CR+PR组定义为治疗阳性组,SD+PD组定义为治疗阴性组4.免疫组化实验比较各组食管癌患者中KCNMA1表达;结果:1、在患有ESCC中期或晚期的患者中,11例完全缓解（complete remission,CR）,65例部分缓解（partial remission,PR）,13例未出现改变（SD）,5例进行性疾病（progressive disease,PD）.总缓解率（CR+PR）为80.85%2、通过免疫组织化学测定法测量对VER逆转治疗方案呈阳性（CR或PR）患者的组织样品中KCNMA1表达明显高于阴性（SD和PD）的患者。结论:经靶动脉灌注维拉帕米联合化疗药物治疗中、晚期食管鳞状细胞癌提高了食管鳞状细胞癌治疗的近期疗效,改善了患者的临床获益及临床症状。免疫组化结果显示对本治疗方案呈阳性患者组织中KCNMA1表达显着高于阴性反应组。

李晓飞^[7]（2021）在《MGRN1启动子区异常甲基化在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药和预后中的研究》文中研究表明上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）是女性生殖道肿瘤中常见的恶性肿瘤,在妇科恶性肿瘤中死亡率最高,其中浆液性囊腺癌是最常见的病理类型。大多数上皮性卵巢癌患者的治疗是采用肿瘤减灭术辅以术后铂类药物化疗。这虽然改善了上皮性卵巢癌患者的预后,但是上皮性卵巢癌患者总体生存率无明显改善,5年生存率只有30%左右。原发性或获得性化疗耐药是成功治疗上皮性卵巢癌的主要障碍。因此,攻克化疗耐药是上皮性卵巢癌研究的主要目标。化疗耐药的发生是由多种调控机制共同作用的结果,但是目前仍有很多潜在分子机制尚不明确。越来越多的证据表明异常的DNA甲基化是与化疗耐药相关的最常见的分子机制之一。本课题组在前期实验中通过简化甲基化测序（reduced representation bisulfite sequencing,RRBS）技术对卵巢浆液性囊腺癌化疗敏感患者癌组织及卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药患者癌组织进行全基因组甲基化水平测序及数据分析。结果显示卵巢浆液性囊腺癌化疗敏感患者和化疗耐药患者之间存在明显的基因甲基化差异,其中化疗耐药组中 MGRN1（Mahogunin Ring Finger 1）启动子区甲基化水平明显高于化疗敏感组。因此,本研究选取MGRN1进行深入研究,探索MGRN1基因启动子区异常甲基化参与卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药发生的可能机制。第一部分 MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药的关系目的:为进一步明确前期RRBS测序结果,探讨MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药的关系。方法:1.采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF Sequenom Mass ARRAY）检测卵巢浆液性囊腺癌患者癌组织MGRN1启动子区甲基化水平,分析MGRN1甲基化水平与化疗耐药之间的关系;采用RT-qPCR及免疫组织化学染色方法检测卵巢浆液性囊腺癌癌组织MGRN1 mRNA及蛋白表达水平,分析MGRN1 mRNA及蛋白表达水平与化疗耐药之间的关系;2.Spearman分析明确MGRN1异常甲基化与mRNA表达的相关性。结果:1.卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药组MGRN1启动子区甲基化水平明显高于化疗敏感组;2.卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药组中MGRN1 mRNA表达水平明显低于化疗敏感组;3.卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药组中MGRN1蛋白表达水平明显低于化疗敏感组;4.Spearman分析显示:MGRN1启动子区甲基化水平与mRNA表达水平呈负相关关系。结论:MGRN1启动子区甲基化水平与MGRN1表达呈负性调控关系,MGRN1启动子区高甲基化通过下调MGRN1表达参与了卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药的发生。第二部分 MGRN1基因在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药过程中的作用及机制目的:为了明确MGRN1在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药中的作用及机制,本研究将探讨MGRN1表达下调对浆液性卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨敲低MGRN1表达引起卵巢癌细胞化疗耐药的机制。方法:1.通过稳定转染技术在SKOV3细胞株中敲低MGRN1的表达,用RT-qPCR和Western Bolt方法检测MGRN1表达水平;2.采用CCK-8实验和细胞凋亡实验观察MGRN1表达下调对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响;3.采用RT-qPCR及免疫组织化学染色方法检测卵巢浆液性囊腺癌癌组织HSP70 mRNA及蛋白表达水平,分析HSP70 mRNA及蛋白表达水平与化疗耐药之间的关系;采用Spearman分析MGRN1 mRNA表达与HSP70 mRNA表达的相关性,并利用TCGA数据库对卵巢浆液性囊腺癌组织中MGRN1 mRNA表达及HSP70mRNA表达水平的相关性分析进行验证。结果:1.敲低MGRN1表达后,顺铂诱导SKOV3细胞株的细胞活力明显升高（P<0.05）,顺铂诱导SKOV3细胞株的细胞凋亡率明显下降（P<0.05）;2.卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药组中HSP70 mRNA及蛋白表达水平明显高于化疗敏感组;Spearman分析显示:MGRN1 mRNA表达水平与HSP70 mRNA表达水平呈负相关关系。联合TCGA数据库信息明确了 MGRN1与 HSP70的 mRNA水平存在显着相关性（r=-0.5,P=1E-13）。结论:下调MGRN1表达后会引起SKOV3卵巢癌细胞系顺铂敏感性下调;MGRN1可能通过调控HSP70的表达进而调节卵巢癌细胞的化疗耐药。第三部分 MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系目的:依据患者临床资料以及随访资料分析MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系。方法:1.运用Kaplan-Meier方法以及Cox回归模型方法分析MGRN1基因甲基化水平和mRNA表达水平与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系;2.运用Kaplan-Meier方法分析HSP70基因mRNA表达水平与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系。利用Kaplan-Meier plotter数据库对卵巢浆液性囊腺癌组织中HSP70 mRNA表达及卵巢浆液性囊腺癌患者的总生存期的相关性进行验证。结果:1.MGRN1基因启动子区高甲基化和MGRN1 mRNA低表达与卵巢浆液性囊腺癌患者预后不良有关（P<0.05）;2.MGRN1 mRNA低表达是预测患者无疾病进展生存期和总生存期的独立危险因素（HR=2.18,95%CI:1.07-4.11,P=0.028;HR=1.92,95%CI:0.99-3.79,P=0.045）;3.HSP70 mRNA低表达与卵巢浆液性囊腺癌患者预后不良有关（P<0.05）;利用Kaplan-Meier plotter数据库对卵巢浆液性囊腺癌组织中HSP70 mRNA表达及1207例卵巢浆液性囊腺癌患者的总生存期的相关性进行分析,结果发现HSP70 mRNA高表达组患者总生存期明显低于低表达组患者（P=0.013）。结论:MGRN1基因高甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者不良预后相关;MGRN1 mRNA低表达是预测卵巢浆液性囊腺癌患者无疾病进展生存期和总生存期的独立危险因素;MGRN1启动子区高甲基化可能是通过下调HSP70基因表达参与了卵巢浆液性囊腺癌患者不良预后的发生。综上所述,本研究首次探讨了 MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药的关系,为DNA甲基化调控基因表达参与卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药和不良预后提供了新的实验依据。MGRN1研究表明:1)卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药患者癌组织中MGRN1启动子区甲基化水平明显低于化疗敏感组;2)MGRN1基因甲基化升高导致的mRNA水平下调与卵巢浆液性囊腺癌患者不良预后相关;3)敲低MGRN1表达可下调卵巢癌细胞株对顺铂敏感性;4)下调卵巢癌细胞MGRN1表达HSP70 mRNA表达水平明显降低;5)卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药患者癌组织中HSP70 mRNA表达水平明显高于化疗敏感组;MGRN1启动子区高甲基化可能是通过上调HSP70基因表达参与了卵巢浆液性囊腺癌的不良预后和化疗耐药的发生。

许远^[8]（2021）在《miR-27b-3p靶向PPAR-γ调节人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药性的机制研究》文中进行了进一步梳理甲状腺未分化癌（anaplastic thyroid caner,ATC）是所有甲状腺肿瘤中恶性程度最高且预后极差的一种病理类型,临床确诊时往往已是晚期。由于其缺乏分化不能聚碘,所以无法以放射碘进行治疗。阿霉素（doxorubicin,DOX）目前是治疗ATC的一线化疗药物,但是在治疗后期ATC对阿霉素的耐药性是导致最终化疗失败的主要原因。然而目前ATC阿霉素耐药的机制研究进展缓慢,耐药逆转剂的开发更是滞后。阿霉素化疗的耐药机制尚不十分清楚,近年的研究表明,异常表达的多种微小RNA（microRNAs,miRNAs）参与了肿瘤多药耐药的形成。miRNAs是一类高度保守的内源性、非编码、单链RNA分子,参与了多种肿瘤的发生发展。我们通过GEO、TCGA等数据库检索、生物信息学分析以及大量文献复习,确定microRNA-27b-3p（miR-27b-3p）及过氧化物酶体增殖物受体 γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γ）作为进一步的研究目标。之前的研究发现,miR-27b-3p以及PPAR-γ的异常表达与胃癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌等多种肿瘤耐药性相关,但两者在ATC中的表达情况以及对阿霉素治疗敏感性的影响等尚未见报道。为了阐明miR-27b-3p与PPAR-γ是否参与ATC细胞耐药形成、以及如何逆转ATC细胞对阿霉素的耐药性,我们探讨了在ATC阿霉素耐药细胞系SW1736/DOX 和 8305C/DOX 中 miR-27b-3p 与 PPAR-γ 靶向调控关系、miR-27b-3p与PPAR-γ的动态表达对ATC细胞阿霉素耐药性的影响、以及可能同时参与调控的miR-27b-3p/PPAR-γ轴上游及下游基因,为逆转ATC阿霉素耐药提供理论依据。第一部分 人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药株的构建目的建立人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药株,描述其生物学特性;并在mRNA水平及蛋白水平检测耐药相关基因P-gp在耐药株与敏感株中的表达差异以验证耐药株的成功建立,为下一步开展肿瘤耐药性的机制研究提供科研模型。方法1.以人甲状腺癌未分化癌细胞SW1736、8305C为亲代细胞,以阿霉素为筛选药物,采用逐步递增阿霉素浓度,间歇作用体外诱导构建SW1736/DOX、8305C/DOX耐药细胞株模型。2.采用CCK-8法检测经不同浓度阿霉素作用后耐药株细胞及其亲代细胞的抑制情况,以便筛选出最合适的干预浓度和作用时间。3.通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹印迹法检测耐药相关蛋白P-gp在耐药株和敏感株细胞中的表达差异。4.利用腺病毒转染技术,构建稳定表达荧光LUC细胞株SW1736-LUC/DOX、8305C-LUC/DOX,用于后期动物实验。结果1.采用低浓度加药持续诱导法,逐步递增培养液中阿霉素的浓度,间歇作用体外诱导筛选,历时3个月获得了在阿霉素作用下生长良好的耐药细胞株,分别命名为SW1736/DOX和8305C/DOX。通过实验我们发现,在逐渐升高的阿霉素浓度作用下,耐药株SW1736/DOX、8305C/DOX细胞抑制比率上升幅度明显低于亲本细胞株。2.用CCK-8法测得SW1736细胞对阿霉素的IC50为0.82 μM,SW1736/DOX细胞对阿霉素的IC50为8.83 μM,其耐药系数RI为10.73;8305C细胞对阿霉素的IC50为1.77 μM,8305C/DOX细胞对阿霉素的IC50为9.22 μM,其耐药系数RI为5.41。根据RI常规分级,SW1736/DOX、8305C/DOX细胞较亲本SW1736、8305C细胞对阿霉素为中度耐药,具有明显的耐药性。并筛选出1 μM的最适阿霉素作用浓度和48小时的作用时间。3.qRT-PCR 结果显示,在耐药细胞株 SW1736/DOX、8305C/DOX 中 P-gp mRNA表达较其亲代细胞株SW1736、8305C明显上调,存在显着性差异（p<0.01）;Western Blot结果显示,耐药细胞株SW1736/DOX、8305C/DOX中P-gp蛋白表达量明显升高,存在显着性差异,提示ATC耐药株模型构建成功。4.利用腺病毒（pHBLV-CMV-MCS-EF1-fLUC-T2A-PURO）转染技术,我们获得了稳定表达LUC基因的细胞株SW1736-LUC/DOX和8305C-LUC/DOX,用于后期动物实验。结论两种ATC细胞获得耐药性的过程是逐渐改变的,有明显的剂量依赖关系,耐药株细胞较其亲代细胞对阿霉素药物更为耐受,而且耐药株中耐药相关蛋白P-gp的mRNA和蛋白高表达也验证了耐药细胞株的成功构建。利用SW1736/DOX、8305C/DOX模型,我们可以在后续的microRNAs及其靶基因调控水平上研究其耐药性的改变,并以此为基础进一步开展逆转耐药的研究。第二部分 miR-27b-3p的表达水平与人甲状腺未分化癌细胞对阿霉素敏感性的关系目的通过生物信息学分析结合文献复习,找出可能与ATC阿霉素耐药性相关的差异表达miRNAs,进一步筛选出在ATC阿霉素耐药株细胞中异常表达的miRNA,通过体外和体内实验检测其表达水平与ATC细胞阿霉素药物敏感性的关系。方法1.通过NCBI网站上的GEO数据库、TCGA数据库等检索并下载与甲状腺癌化疗耐药相关的数据集,分析差异表达的miRNAs。筛选出可能与甲状腺未分化癌阿霉素化疗耐药相关的差异miRNAs作为主要研究对象。2.在多种相关miRNAs中,采用qRT-PCR技术,进一步筛选出ATC耐药株细胞和亲代细胞中存在显着差异表达的miRNA。3.体外实验:通过控制miRNA表达（miRNA inhibitor）,观察转染组与非转染组耐药细胞株对阿霉素敏感性的变化。4.体内实验:构建裸鼠异种体内ATC耐药细胞株移植瘤模型,通过敲低目标miRNA（miRNA antagomir）,观察实验组与对照组荷瘤小鼠移植瘤的生长曲线,qRT-PCR分析移植瘤中目标miRNA的表达改变。结果1.我们使用 TCGAbiolinks R 包下载 TCGA-THCA miRNA-seq readcount 数据与临床样本数据,使用ggplot2R包绘制火山图。共找到差异miRNA394个,其中上调miRNA264个,下调miRNA 130个。通过查阅大量文献综述,我们在差异miRNA中筛选出与甲状腺未分化癌密切相关,且参与多种不同恶性肿瘤化疗耐药性调控的 miRNA:miR-200 家族（包括 miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141）、miR-205 和 miR-27b 作为下一步研究的目标 miRNAs。2.通过RT-PCR实验对上述miRNAs在ATC细胞株SW1736、8305C及其耐药株SW1736/DOX、8305C/DOX中的表达水平进行了筛选检测,结果显示,miR-27b-3p在耐药株细胞中的表达水平明显升高,与其亲代细胞相比,具有显着性差异（p<0.01）。因此,我们选择miR-27b-3p作为研究ATC阿霉素耐药机制的目标miRNA。3.为了明确miR-27b-3p表达水平的高低是否对ATC细胞的耐药性产生影响,我们在耐药细胞株中转染miR-27-3p inhibitor及scramble miRNA,采用CCK-8法检测耐药细胞株中转染组和对照组细胞对化疗药物阿霉素敏感性的变化。结果显示,与对照组相比,转染miR-27-3p inhibitor组随着药物浓度增加,细胞抑制比率逐渐上升,IC50值明显降低,差异具有统计学意义（p<0.01）,提示抑制miR-27b-3p表达可显着提高ATC细胞对阿霉素的敏感性。4.为了进一步验证miR-27b-3p在体内对ATC阿霉素耐药性的调控作用,我们构建了裸鼠异种体内皮下移植瘤模型。实验组在瘤体内注射了 miR-27b antagomir之后,移植瘤生长明显减缓;取出瘤体后检测瘤重变化与体积变化一致。两组荷瘤小鼠移植瘤大体照片对比进一步表明,注射miR-27b antagomir增强了阿霉素的抗肿瘤效应。与体外细胞实验结果一致,miR-27b antagomir干扰后,移植瘤组织中miR-27b-3p的表达显着降低。以上体内实验结果证实,敲低miR-27b-3p可以增强ATC耐药细胞对阿霉素药物的化疗敏感性。结论miR-27b-3p在甲状腺未分化癌阿霉素耐药细胞株SW1736/DOX、8305C/DOX中显着高表达,抑制miR-27b-3p表达可以增强甲状腺未分化癌细胞对阿霉素化疗敏感性。第三部分 miR-27b-3p通过靶向PPAR-γ调节人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药性目的探讨miR-27b-3p通过靶向PPAR-γ对ATC细胞阿霉素耐药性的调控及其分子机制,并对miR-27b-3p/PPAR-γ调控轴的上游及下游信号分子进行初步的拓展研究。方法1.通过多个数据库预测miR-27b-3p下游的靶基因并进行Venn分析,采用clusterProfiler R包对靶基因集进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,同时结合TCGA-THCA mRNA-seq readcount数据与临床样本数据,选取与甲状腺癌相关的靶基因作为下一步的研究对象。2.通过生物信息学分析明确miR-27b-3p与靶基因的结合位点。3.通过双荧光素酶报告实验验证该基因是否miR-27b-3p的直接靶标。4.在SW1736和8305C细胞转染miR-27b-3p模拟物,通过qRT-PCR和WB实验观察靶基因mRNA以及蛋白水平的改变,以明确两者表达相关性。5.通过qRT-PCR和WB实验明确该靶基因在耐药细胞株与亲代细胞株中mRNA和蛋白的表达差异。6.构建并转染该基因的过表达质粒,观察耐药细胞株对阿霉素敏感性的变化。7.在SW1736和8305C细胞转染miR-27b-3p模拟物,qRT-PCR检测转染组和非转染组下游转录因子的mRNA表达水平,筛选出显着性差异表达的下游基因,ELISA实验检测其在耐药株与敏感株中的表达情况,并通过挽救实验验证其是否参与miR-27b-3p对ATC细胞阿霉素耐药性的调节。8.WB法分别检测耐药株细胞胞浆以及细胞核内磷酸化NF-κB p65的含量变化;在耐药细胞株SW1736/DOX和8305C/DOX中分别转染NF-κBp65的抑制剂BAY 11-7082,通过qRT-PCR检测miR-27b-3p及其靶基因的mRNA表达改变,以验证NF-κB p65是否通过影响miR-27b-3p对其靶基因的调控进而影响ATC细胞阿霉素耐药性。结果1.通过TargetScan数据库、miRDB数据库和miRTarBase数据库预测miR-27b-3p的靶基因,进行Venn分析,同时能在3个数据库可预测到的靶mRNA共17个。针对miR-27b-3p筛选到的mRNA基因进行功能富集分析,GO分析发现显着差异表达的基因在生物过程方面主要参与生殖系统发育、对制动应激反应、动物器官的再生、胚胎上皮形态的发生以及胎盘发育等;在细胞成分上主要集中在细胞质膜和膜的外源性组分、泛素配体复合物、非对称性突触、内质网腔等;在分子功能方面主要影响蛋白C末端结合、VEGF受体结合等。KEGG富集分析发现差异表达的基因主要集中在miRNA对恶性肿瘤的调控作用、MAPK信号通路、p53相关通路、甲状腺癌调控等方面。从KEGG信号通路分析我们可以看出,PPAR-γ与甲状腺癌密切相关,我们将筛选出的差异基因通过Gepia在线工具检索,发现PPAR-γ基因在甲状腺癌症组中相对于癌旁组显着低表达。前期的研究提示PPAR-γ基因高表达能提高甲状腺癌放射性碘治疗疗效,我们使用 TCGAbiolinks R 包下载 TCGA-THCA mRNA-seq readcount数据与临床样本数据,经分析发现PPAR-γ在甲状腺癌放疗组的表达较非放疗组明显下调。此外我们通过查阅文献,发现PPAR-γ还参与乳腺癌、卵巢癌、肺癌等化疗耐药性的形成。因此我们假设PPAR-γ是miR-27b-3p调控ATC化疗耐药性的一个重要靶标,故而选择miR-27b-3p/PPAR-γ来作为我们下一步研究的对象。2.采用TarScan4.0软件分析miR-27b-3p对PPAR-y的靶向作用,结果显示miR-27b-3p靶向作用于PPAR-γ的可能PCT值达到73,且context score的百分概率达到67。我们也采用miRanda数据库分析miR-27b-3p的作用靶点,结果显示miR-27b-3p的5’种子区有7个核苷酸与PPAR-y的3’-UTR完全互补,位于82-88碱基之间。3.在ATC细胞株转染miR-27b-3p mimics,qRT-PCR及WB实验结果显示:与对照组相比,转染组PPAR-γ的mRNA和蛋白水平均显着降低,差异有统计学意义（p<0.01）,表明过表达miR-27b-3p可以有效调控PPAR-y在甲状腺未分化癌细胞株中mRNA和蛋白的表达,两者呈显着负相关。4.在转染野生型pmirGLO-PPARG-3’UTR-wt报告基因质粒的两组细胞中,共转染miR-27b-3p mimics组的荧光素酶活性为空白对照组的45.2%,存在显着的统计学差异（p<0.01）;而在转染突变型pmirGLO-PPARG-3’UTR-mut质粒的两组细胞中,共转染miR-27b-3p mimics组和对照组的荧光酶素活性无显着差异,提示miR-27b-3p可以明显抑制含有PPAR-y 3’UTR的荧光素酶报告基因的表达,而这种抑制作用可以被结合位点5个核苷酸的突变所逆转。由此可见,miR-27b-3p对PPAR-γ存在靶向调控,表明PPAR-γ的确是miR-27b-3p的直接靶基因。5.RT-PCR及WB实验结果提示PPAR-γ在耐药株中的mRNA及蛋白水平显着低于亲代细胞株,差异具有统计学意义（p<0.01）。6.构建过表达PPAR-γ质粒并转染耐药细胞株SW1736/DOX及8305C/DOX,结果显示耐药株对阿霉素的IC50明显下降,提示过表达PPAR-γ可显着提高ATC细胞对阿霉素的敏感性。7.在ATC细胞株中转染miR-27b-3p mimics后,下游基因bFGF的mRNA表达明显降低,而c-Myc、Bcl2、VEGF的表达无显着差异,通过ELISA法测定转染组培养基中bFGF的浓度,得到了相同的结果。ELISA法检测耐药细胞株的bFGF表达显着低于亲本细胞株。提示miR-27b-3p水平上调对bFGF的表达有抑制作用,挽救实验证实过表达PPAR-γ可以逆转这种抑制作用。以上结果均提示bFGF受PPAR-γ正向调节,并可能参与miR-27b-3p/PPAR-γ轴对ATC细胞阿霉素敏感性的调控。8.耐药细胞株SW1736/DOX、8305C/DOX中NF-κB p65的总蛋白和核蛋白水平均显着上升,提示耐药株细胞中NF-κB p65呈现活化状态。NF-κB p65受到抑制后,miR-27b-3p的表达也随着显着下调,而PPAR-γ的表达较对照组显着上调。以上结果提示,ATC耐药细胞中miR-27b-3p水平上调与NF-κB p65活化有关,NF-κB p65可能作为miR-27b-3p/PPAR-γ调控轴的上游调控基因对ATC耐药性产生影响。结论过表达PPAR-γ可以增加甲状腺未分化癌耐药细胞株SW1736/DOX、8305C/DOX对阿霉素的敏感性;PPAR-γ是miR-27b-3p的直接靶基因,miR-27b-3p可能通过靶向PPAR-γ参与调控ATC细胞阿霉素耐药性;NF-κB p65与bFGF分别作为miR-27b-3p/PPAR-γ轴的上游及下游信号分子,参与调控ATC细胞对阿霉素的耐药性。

龙思利^[9]（2021）在《MicroRNA-145逆转急性淋巴细胞白血病细胞对糖皮质激素耐药性的研究》文中指出目的:急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）是儿童最常见的恶性肿瘤。儿童ALL的无事件生存率（event free survival,EFS）达到81%,但仍有15%-20%的复发率,且一旦复发,治愈率不足40%。糖皮质激素（Glucocorticoids,GCs）耐药是ALL复发的主要原因之一。Micro RNAs（MiRNA）是约22个核苷酸的小非编码单链RNA,可以通过多种机制参与GCs敏感性的调控,与ALL细胞对GCs耐药密切相关。本研究首先通过数据库分析miR-145在ALL患儿中的表达情况及其对ALL预后的影响,进而探讨miR-145对人T-ALL细胞系CEM-C7和CEM-C1细胞增殖、凋亡和自噬的影响,及其是否可以逆转GCs耐药CEM-C1细胞对地塞米松（Dexamethasone,DEX）的耐药性,为探索儿童ALL耐药性的靶点提供新的思路。方法:1.生物信息学:应用GEO数据库数据集分析miR-145在ALL儿童中的表达水平,通过TARGET数据库数据揭示miR-145和儿童ALL预后之间的联系。2.细胞培养:运用体外细胞培养技术孵育对DEX具有耐药性的人AL L细胞株CEM-C1细胞株及亲本细胞株CEM-C7。3.脂质体转染:在CEM-C1细胞中应用lipo-2000介导脂质体转染技术转入miR-145模拟物mimic及其NC阴性对照,miR-145抑制剂inhibito r及其NC阴性对照,调控miR-145在细胞中表达,并分别将其分为MM、MMN、MI、MIN四个组。4.细胞增殖抑制实验:采用CCK-8试剂盒检测检测不同浓度DEX（20、40、80、160和320 mg/ml）对四组细胞增殖的抑制情况,从而揭示miR-145在CEM-C1对GCs反应性中发挥的作用。5.吖啶橙染色:探索miR-145对CEM-C1细胞凋亡的影响。6.流式细胞术:分析miR-145对CEM-C1细胞凋亡的影响。7.实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）:检测miR-145在CEM-C1细胞和CEM-C7细胞中的表达,以及miR-145、促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2、自噬相关基因LC3及Beclin-1、多药耐药基因MDR1在四组细胞中的表达情况。8.细胞免疫印迹实验（Western Blot,WB）:检测MDR1蛋白在CE M-C1细胞和CEM-C7细胞中的表达,以及转染后四组细胞中miR-145、凋亡基因Bax和抵抗凋亡基因Bcl-2、自噬相关蛋白LC3及Beclin-1、多药耐药蛋白MDR1的表达情况。9.3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）干预对照MMN组和miR-145高表达的MM组细胞,将其分为MMN、MMN+3-MA、MM、MM+3-MA四组细胞,作用24h后检测自噬相关蛋白LC3及Beclin-1、耐药蛋白MDR1的表达,进一步研究自噬与ALL细胞GCs抗性的关系。结果:1.数据库结果显示miR-145在ALL患儿中的表达水平显着降低（P<0.001）。2.miR-145高表达组ALL儿童的生存时间高于低表达组（P<0.001）。3.耐药蛋白MDR1在CEM-C1细胞中的表达水平显着高于CEM-C7细胞。4.miR-145在CEM-C1细胞中的表达显着低于CEM-C7细胞。5.miR-145高表达后增加了GCs对CEM-C1细胞的增殖抑制作用。6.促凋亡基因/蛋白Bax的表达在miR-145高表达组中增加,而抗凋亡基因/蛋白Bcl-2及耐药基因/蛋白MDR1则表达减少。7.同时,miR-145增加自噬基因/蛋白Beclin 1和LC3-Ⅱ的表达诱导自噬,从而降低耐药基因/蛋白MDR1的表达。8.3-甲基腺嘌呤（3-MA）干预后,MIN+3-MA组,耐药蛋白MDR1的表达增加,且MM+3-MA组,Beclin l的表达较MIN+3-MA增加,而MDR1的表达降低。结论:1.miR-145在ALL儿童中低表达,提示患儿预后不良;2.miR-145可以通过诱导CEM-C1细胞的凋亡和自噬来逆转糖皮质激素的耐药性。

刘倩^[10]（2020）在《PRKD2在急性髓性白血病中的临床意义及其作用机制研究》文中研究指明第一部分基于TCGA分析的AML患者中Notch1相关基因的筛选研究背景:急性髓性白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种在分子表型上高度异质性的疾病,其特点是造血干/祖细胞的恶性转化。在白血病前期和疾病发展的过程中,受影响的造血细胞逐渐积累了一系列分子变化,包括细胞的体细胞突变、基因组遗传学异常、表观遗传学变化和转录组学变化。通过新一代测序手段,已在AML中鉴定出多种基因水平改变、表观遗传学变化和细胞遗传学异常,并在AML的临床诊断治疗中发挥重要的指导作用。近年来,基于公共数据库以及生物信息学分析,发现更多AML相关的分子生物学指标成为该领域研究的热点,将有助于提高对AML发生发展机理的认识,并为临床提供新的诊断治疗及预后检测的生物标志物及靶点。癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）项目是由美国国立卫生研究院（National Institute of Health）支持的多中心研究,旨在通过大规模的高通量测序和生物信息学分析,挖掘30多种人类肿瘤中的主要致癌基因。目前该数据库包含约20,000例肿瘤患者的样本及临床病理信息,其中AML病例203例,均可提供公开的肿瘤基因组数据,用以协助改进肿瘤的诊断方法、治疗标准,最终达到早期诊断及治疗的目的。TCGA数据库的建立,为肿瘤的分子生物学研究提供了一个蕴藏丰富的宝藏,将有助于提高对肿瘤机理的认识。Notch信号通路是一种在物种间高度保守的信号通路,对于细胞正常功能的维持具有重要意义。其由Nocth受体（Nocth1-4）,Nocth配体（DSL）和CSL（一类DNA结合蛋白）等组成,通过细胞与细胞间的信号传递参与了生物体内的多种病理生理学过程,如细胞干性的维持、细胞凋亡的调节和免疫反应等。其中,Notch1受体可被配体结合并激活,进而引起Notch1细胞内结构域（NICD）的释放,NICD会转移到该细胞的细胞核中并与DNA及转录因子结合,进而引起下游基因表达的变化。研究报道,骨髓基质细胞（BMSC）与造血干细胞（HSC）间的Notch1受体-配体结合会影响HSC的自我再生能力,阻碍细胞的成熟;恶性程度较高的骨肉瘤细胞具有较高的Notch1水平;Notch1的下调可以抑制宫颈癌组织的浸润、转移。在小鼠模型中,Notch1的激活可以诱发T-ALL,证明了其在白血病发病中的重要作用;同时研究表明Notch1可以调节趋化因子受体CCR7的表达,并促进T-ALL的中枢神经系统浸润。此外,我们先前曾报道Notch1/D114途径在AML细胞中被激活,并可能促进AML的疾病进展。我们还发现Notch1通路的激活可能预示着AML的不良预后。由此可见,Nocth1信号通路在多种实体肿瘤及血液系统恶性肿瘤中均发挥重要的调节功能,利用新兴的公共数据库及生物信息学分析进一步探讨Nocth1信号通路的调控网络对于理解AML的发病机理,发现新的诊断治疗靶标具有重要的临床意义。研究目的:通过下载并分析TCGA数据库中AML患者的表达谱信息及临床病理学信息,筛选出与Notch1表达相关的基因,同时筛选与AML患者危险度分层及预后相关的基因,通过交叉比对初步确定AML中与Notch1表达相关且具有临床意义的潜在分子标记物及靶点,为后期相关的功能机制研究奠定基础。研究方法:1.利用 cBioportal 工具（http://www.cbioportal.org）,下载 TCGA 数据库中 AML（非APL）相关的基因表达谱数据及临床病理学信息。2.应用R X64 3.4.1软件对数据进行批量分析,并通过Spearman检验筛选与Notch1基因表达具有相关性的基因（相关系数>0.5,P<0.05）。3.基于TCGA数据库中AML患者的危险度分层信息,利用RX64 3.4.1软件批量分析各基因与患者危险度分层的相关性,筛选与AML患者危险度分层相关的基因。4.基于基因的表达量信息,选取基因表达量的平均值,并依此将患者分为高表达、低表达两组,同时结合患者预后信息,绘制两组患者的Kaplan-Meier生存曲线。单变量COX回归分析各基因的表达与AML患者预后的相关性,筛选能够提示患者预后的基因。5.将上述2,3,4三种方法筛选出的基因进行交叉比对取交集,筛选出既与Notch1表达相关、又与患者危险度分层及预后相关的基因。研究结果:1.通过筛选TCGA AML数据库中与Notch1相关的基因,发现共有172个基因满足相关系数>0.5,P<0.05的入选条件。其中,148个基因表达与Notch1呈正相关,24个基因表达与Notch1呈负相关。2.基于TCGA数据库提供的AML患者危险度分层信息,分析发现共有17例（12.69%）处于低危组,91例（67.91%）处于中危组,26例（19.40%）处于高危组。分析各基因与危险度分层的相关性,共筛选出5,931个与AML患者危险度分层相关的基因。3.基于TCGA数据库提供的AML患者预后信息,分析各基因与患者预后的相关性,共筛选出1,584个与预后相关的基因。4.将上述三种方法筛选出的基因交叉比对并取交集,共筛选出19个与Notch1表达相关、与患者危险度分层相关、与AML患者生存总体时间相关的基因。5.进一步通过文献检索,发现共有6个基因（PACS2,PRKD2,BCL9L,SIPA1,PPM1F,RAPGEF3）可能在AML的发生发展中发挥作用,作为我们后续研究的对象。结论:通过下载TCGA数据库中AML患者基因表达谱数据及临床病理学信息数据,并利用专业软件进行批量生物信息学分析,共筛选出19个与Notch1表达相关、与AML患者危险度分层相关、与AML患者预后相关的基因。后期通过文献检索,进一步筛选出6个在AML中具有潜在功能的基因,其可能在AML的发生发展中发挥重要的调节功能,并可作为潜在的AML诊断指标和治疗靶点。第二部分PRKD2在急性髓性白血病中的功能及机制分析研究背景:急性髓性白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种在遗传学和表观遗传学上高度异质性的起源于造血干/祖细胞的血液系统恶性肿瘤,其特点是骨髓造血干/祖细胞的增殖不受控制,导致未成熟的前体细胞异常积累,以及正常成熟血细胞生成不足。AML可广泛浸润肝、脾、淋巴结等多种人体重要的器官,其对机体正常造血功能的抑制将导致贫血、感染、中性粒细胞减少和血小板减少等症状,疾病进展迅速且难以控制。AML是成年人中最常见的急性白血病,近年来发病率不断上升,每100,000名成人就中有38例患病,其中位发病年龄约为66岁。根据美国国家癌症研究所（National Cancer Institute）报道,2018年AML新病例数为19,520例,其中10,670人死于这种疾病。近年来,针对AML的治疗取得了一定的进展,患者的生存率得到了改善,但是目前临床广泛使用的抗白血病药物在AML的治疗方面仍令人不甚满意。年轻患者（年龄<60岁）的5年生存率仅为30-40%,而>60岁患者的5年生存率则更低,尚且不到10%。目前,AML的发病机制仍不完全明确,影响其进展的外部环境因素及内部遗传因素仍有待于进一步的探索,化疗耐药及完全缓解（complete remission,CR）后疾病复发是临床上亟待解决的重要科学问题。因此,阐明AML的发生、进展、化疗耐药及复发的机制,发现新的治疗手段,研发更为有效的抗AML药物,对于改善患者预后具有重要的价值。蛋白激酶D（protein kinase D,PRKD）家族隶属于钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶超家族,包括PRDK1,PRKD2及PRKD3,其可以被活性氧、受体酪氨酸激酶和乏氧所激活,从而调节细胞内的病理生理学过程。有研究表明PRKD2的表达可以在胃肠道间质肿瘤-内皮细胞的通信过程中充当一种重要的介质。此外,其可以在慢性粒细胞性白血病（chronic myeloid leukemia,CML）中发挥重要的功能。PRKD2的表达水平及活性与淋巴瘤的分化水平相关,其可以通过激活NF-κB行使重要的调节功能。在胰腺癌及胶质瘤中,PRKD2的高表达则可以促进肿瘤细胞的生长及浸润转移能力。PRKD2参与了多种肿瘤的调控过程,然而其在AML中的作用及机制尚不明确。本课题旨在明确PRKD2在AML患者中的表达情况及其与临床病理学特征的相关性,同时在AML细胞系中验证其对AML细胞增殖及耐药的影响,以及具体的分子调节通路。本课题将为AML的基础及临床研究提供新的思路,给临床诊疗工作提供更多可参考利用的生物学靶点。研究目的:检测PRKD2基因在AML耐药及敏感细胞系中的表达水平差异,并通过体外实验验证PRKD2对AML细胞增殖、耐药的作用及分子机制。研究方法:1.利用实时定量PCR（qRT-PCR）技术检测第一部分筛选出的6个基因在AML耐药及敏感细胞系中的表达差异,进一步筛选在AML进展及化疗耐药过程中可能发挥重要功能的基因。2.在AML细胞系中感染携带有PRKD2表达载体及阴性对照载体的慢病毒,加入puromycin进行筛选,建立PRKD2稳定过表达的细胞及阴性对照细胞。3.合成针对PRKD2的siRNAs及无义对照siRNAs,转染AML细胞系,下调PRKD2在细胞中的表达。4.利用qRT-PCR技术及Western blot技术检测过表达及干扰PRKD2后AML细胞中PRKD2在mRNA及蛋白水平上的表达变化。5.细胞增殖及药物敏感性检测:将过表达PRKD2的AML细胞铺于培养板中,加入CCK8检测细胞增殖速度;将过表达及干扰PRKD2的AML细胞铺于培养板中,并加入化疗药物,CCK8法检测细胞药物敏感性的改变。6.细胞凋亡的检测:利用化疗药物处理过表达及干扰PRKD2的AML细胞,采用Annexin V/PI双重染色,流式细胞术检测化疗药物诱导的细胞凋亡率的改变。7.利用实时定量PCR技术及Western blot技术,检测在AML细胞系中干扰及过表达PRKD2后,Notch1通路相关基因表达的改变。8.提取TCGA数据库中AML患者的mRNA数据信息,获得PRKD2表达量的均值,并依此将AML患者分为高表达组及低表达组,分析两组间患者临床病理学特征的差异。9.基于TCGA数据库,分析PRKD2表达联合AML常见突变对AML患者总体生存时间的影响。研究结果:1.在AML多药耐药细胞系K562/A02及亲本细胞系K562中检测第一部分筛选出的 6 个基因（PACS2,PRKD2,BCL9L,SIPA1,PPM1F,RAPGEF3）的相对表达量,发现PACS2,PRKD2,BCL9L,SIPA1,RAPGEF3这5个基因具有显着变化。其中PRKD2变化幅度最大,与药物敏感细胞系K562相比,其在耐药细胞系K562/A02中表达水平显着提高。2.应用siRNA及慢病毒转染AML细胞,qRT-PCR及Western blot检测干扰及过表达PRKD2的效率,结果表明其在mRNA水平及蛋白水平均有显着的改变。3.过表达PRKD2后细胞功能的改变:在AML细胞系KASUMI及U937中过表达PRKD2后,CCK8实验显示AML细胞的增殖速率显着提升。同时,过表达PRKD2可以降低AML细胞对化疗药物的敏感性。流式细胞术显示PRKD2表达升高后,可以显着抑制阿霉素（ADM）诱导的细胞凋亡。4.干扰PRKD2后细胞功能的改变:在AML细胞系KASUMI、U937及K562/A02中干扰PRKD2的表达,CCK8实验显示干扰PRKD2后AML细胞对化疗药物的敏感性显着增加。同时,流式细胞术显示PRKD2表达下调后ADM诱导的AML细胞的凋亡率明显升高。5.过表达及干扰PRKD2后Notch1通路相关基因的改变:实时定量PCR及Wetsern blot显示,过表达及干扰PRKD2后Notch1通路相关基因（NICD,Notch1,HES1）的表达发生相应改变,其与PRKD2的表达呈显着正相关。6.PRKD2表达量与AML患者临床病理学特征的相关性:根据AML患者PRKD2表达量的均值,共有47例患者被纳入PRKD2高表达组,87例被纳入PRKD2低表达组。分析显示,PRKD2高表达与AML患者的年龄及危险度分层情况密切相关。同时PRKD2高表达与AML常见突变（FLT3,NPMc）的发生密切相关。7.PRKD2表达联合AML常见突变对患者总体生存时间的影响:基于TCGA数据库,分析PRKD2高表达及低表达对有无AML常见突变（FLT3,IDH1,RAS,NPMc）患者预后评估的意义。结果表明,无论AML患者是否存在FLT3及NPMc突变,PRKD2高表达均提示AML患者预后不良;而对于IDH1及RAS突变,PRKD2高表达仅在不伴有该突变的AML患者中提示预后不良,具有预后判断价值。结论:我们的结果表明,PRKD2可能通过调节Notch1信号通路来促进AML细胞的增殖及化疗耐药,且分析发现PRKD2表达与患者年龄、危险度分层、基因突变等临床特征密切相关,具有良好的预后提示价值。该研究有助于我们更好的了解AML化疗耐药和增殖的具体机制,并为AML患者的临床诊疗提供新的生物学靶标。

二、白血病细胞多药耐药基因表达与化疗耐药关系的研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、白血病细胞多药耐药基因表达与化疗耐药关系的研究（论文提纲范文）

（1）浙贝黄芩汤干预Wip1-p38MAPK-p53通路逆转白血病细胞耐药的机制（论文提纲范文）

（2）基于组学数据探索胰腺癌和结直肠癌耐药及其逆转机制（论文提纲范文）

（3）Nrf2过表达通过抑制MSH2促进急性髓系白血病耐药的机制研究（论文提纲范文）

（4）红景天苷增强急性淋巴细胞白血病CEM-C1耐药细胞对地塞米松敏感性的研究（论文提纲范文）

（5）中药逆转肿瘤多药耐药及侵袭转移作用机制研究（论文提纲范文）

（6）KCNMA1的上调促进维拉帕米逆转食管鳞状细胞癌对顺铂的化学耐药（论文提纲范文）

（7）MGRN1启动子区异常甲基化在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药和预后中的研究（论文提纲范文）

（8）miR-27b-3p靶向PPAR-γ调节人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药性的机制研究（论文提纲范文）

（9）MicroRNA-145逆转急性淋巴细胞白血病细胞对糖皮质激素耐药性的研究（论文提纲范文）

（10）PRKD2在急性髓性白血病中的临床意义及其作用机制研究（论文提纲范文）

四、白血病细胞多药耐药基因表达与化疗耐药关系的研究（论文参考文献）

• [1]浙贝黄芩汤干预Wip1-p38MAPK-p53通路逆转白血病细胞耐药的机制[D]. 李雅竹. 北京中医药大学, 2021(08)
• [2]基于组学数据探索胰腺癌和结直肠癌耐药及其逆转机制[D]. 徐阳. 福建医科大学, 2021(02)
• [3]Nrf2过表达通过抑制MSH2促进急性髓系白血病耐药的机制研究[D]. 刘萍. 贵州医科大学, 2021(02)
• [4]红景天苷增强急性淋巴细胞白血病CEM-C1耐药细胞对地塞米松敏感性的研究[D]. 牛亚娜. 西南医科大学, 2021(01)
• [5]中药逆转肿瘤多药耐药及侵袭转移作用机制研究[D]. 程国荣. 中国科学技术大学, 2021(09)
• [6]KCNMA1的上调促进维拉帕米逆转食管鳞状细胞癌对顺铂的化学耐药[D]. 葛宁. 山东大学, 2021(11)
• [7]MGRN1启动子区异常甲基化在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药和预后中的研究[D]. 李晓飞. 河北医科大学, 2021(02)
• [8]miR-27b-3p靶向PPAR-γ调节人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药性的机制研究[D]. 许远. 山东大学, 2021(11)
• [9]MicroRNA-145逆转急性淋巴细胞白血病细胞对糖皮质激素耐药性的研究[D]. 龙思利. 西南医科大学, 2021(01)
• [10]PRKD2在急性髓性白血病中的临床意义及其作用机制研究[D]. 刘倩. 山东大学, 2020(04)

标签：急性淋巴细胞性白血病论文;  化疗药物论文;  放化疗论文;  基因合成论文;  白血病论文;