一、猪、犬旋毛虫成虫免疫原性试验（论文文献综述）
杨莹[1]（2021）在《旋毛虫雌虫生殖力的影响因素及新生幼虫免疫保护作用评价》文中指出旋毛虫病（Trichinellosis）是由旋毛虫引起的一种世界范围内的,食源性人兽共患寄生虫病,可通过食用生肉或未熟的含有旋毛虫包囊的肉感染,具有较高的感染率,可严重威胁到人类的身体健康。随着旋毛虫病在全球再度肆虐,该病的免疫诊断和免疫预防等研究工作已成为热点。为了明确旋毛虫雌虫生殖力的影响因素,建立雌虫体外产新生幼虫的常规方法,为免疫学及免疫化学研究奠定基础,开展了本项研究。研究内容包括:感染后第7d雌虫在小鼠肠道内的分布;雌虫在小鼠肠道内持续时间;宿主不同感染天数的雌虫的生殖力;培养液种类、培养温度、时间、密度等对雌虫生殖力的影响;宿主的感染强度,年龄、性别、身体状态等对雌虫生殖力的影响;新生幼虫的免疫保护作用等。研究结果表明:旋毛虫感染后第7d,雌虫主要分布于小鼠回肠中,空肠次之,十二指肠最少。雌虫在小鼠肠期最长持续时间为37d。宿主不同感染天数对旋毛虫雌虫的生殖力有明显影响,感染后第7d获得的雌虫的生殖力最强;感染后5d、14d的雌虫新生幼虫数量与感染后第7d比显着降低（P<0.01）;感染后11d的雌虫新生幼虫数量与感染后第7d比显着降低（P<0.05）;感染后21d的雌虫新生幼虫数量与感染后第7d比显着降低（P<0.001）感染后第28d的雌虫不再产新生幼虫。在体外培养条件的影响因素中,RPMI-1640+20%胎牛血清培养液培养的雌虫生殖力最强,M199培养液培养的雌虫平均产新生幼虫数量与RPMI-1640+20%胎牛血清培养液培养的雌虫比显着降低（P<0.01）;MEM培养液培养的雌虫平均产新生幼虫数量与RPMI-1640+20%胎牛血清培养液培养的雌虫比显着降低（P<0.001）。培养雌虫的最适温度为37℃,此时产新生幼虫的能力最强,培养温度为27℃、30℃、42℃的平均产新生幼虫数量与37℃比显着降低（P<0.001）;35℃的平均产新生幼虫数量与37℃比显着降低（P<0.05）。培养时间与雌虫产新生幼虫数量成正比,培养72h的雌虫生殖力最强,培养12h、24h、36h的平均产新生幼虫数量与培养72h比显着降低（P<0.001）;培养48h的平均产新生幼虫数量与培养72h比显着降低（P<0.01）。雌虫的培养密度、培养液中有无雄虫以及雌虫的寄生部位对雌虫的生殖力均没有明显的影响。在宿主的影响因素中,感染200条肌幼虫小鼠体内获得的雌虫生殖力最强,与感染500条肌幼虫小鼠体内获得的雌虫比无显着差异;感染1000条肌幼虫小鼠体内获得的雌虫平均产新生幼虫数量与感染200条肌幼虫小鼠体内获得的雌虫比显着降低（P<0.05）。两周龄小鼠（幼年组）肠道内获得的雌虫生殖力最强;两月龄（青年组）、五月龄（老年组）与两周龄（幼年组）小鼠比,肠道内雌虫平均产新生幼虫数量均显着降低（P<0.05）。雄性小鼠体内获得的雌虫平均产新生幼虫数与雌性小鼠比显着升高（P<0.05）。饥饿小鼠体内获得的雌虫平均产新生幼虫数与身体状态良好的小鼠体内获得的雌虫比显着升高（P<0.01）。在新生幼虫诱导小鼠免疫保护作用实验中,通过体外培养所收集到的新生幼虫经尾静脉注入小鼠体内,结果显示,注射活的新生幼虫组减虫率为88.12%;注射冻融新生幼虫组的减虫率为5.11%。试验结果表明,活的新生幼虫能有效的诱导小鼠产生免疫保护作用。
伊娜娜[2]（2020）在《旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在旋毛虫入侵及免疫调节过程中功能的研究》文中研究说明旋毛虫是一种食源性寄生虫。在旋毛虫寄生期间,宿主需要尽可能的排出病原生物,而寄生虫需要在宿主体内成功繁殖和生存,因此在寄生过程中逐渐进化出一种复杂的宿主-寄生虫相互作用关系,而旋毛虫serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂（TsSPI）在这一过程中可能发挥重要作用。TsSPI在旋毛虫ML、AW、NBL中都有表达,其中在ML期表达水平最高。本研究旨在通过RNAi研究TsSPI在旋毛虫入侵以及调节宿主免疫方面的功能,同时探讨重组蛋白TsSPI在体外对巨噬细胞极化的影响。本研究利用RNA干扰技术来探索TsSPI基因在旋毛虫生命周期中的功能。设计合成三条特异性siRNA（siRNA-153、siRNA-479、siRNA-986）,同时体外合成特异性dsRNA-TsSPI,利用脂质体辅助浸泡的方法将特异性siRNA和dsRNA传递到旋毛虫肌幼虫体内,结果发现RNAi可以有效地传递到旋毛虫肌幼虫体内;利用qPCR和Western-blot检测TsSPI基因转录水平和蛋白表达水平,结果发现siRNA和dsRNA-TsSPI的沉默效果为剂量依赖性,且2μM siRNA或60ng/μl dsRNA为最佳的作用浓度;三组特异性siRNA和dsRNA-TsSPI均可有效的降低TsSPI基因转录水平和蛋白表达水平,其中siRNA-986和dsRNA-TsSPI效果最佳,考虑到成本,后续实验均利用60ng/μl dsRNA-TsSPI进行;利用dsRNA-TsSPI浸泡处理旋毛虫2 d后开始有很好的沉默效果,3 d后沉默效果最佳,而且持续到7 d依旧有显着的沉默效果,可见在后续感染实验中,整个肠期感染阶段（感染后3-7 d）内经过dsRNA-TsSPI浸泡处理的旋毛虫都处于TsSPI基因沉默状态;利用检测dsRNA-TsSPI处理后的旋毛虫中Ts Ka SPI的基因转录水平及蛋白水平的方法验证dsRNA-TsSPI干扰的特异性,结果显示dsRNA-TsSPI特异性良好。在本研究中,dsRNA介导的TsSPI基因沉默不影响幼虫在体外的蜕皮和存活率,但降低旋毛虫体外入侵肠上皮细胞的能力。将各组旋毛虫肌幼虫感染小鼠,结果发现与对照感染组相比,TsSPI基因沉默组小鼠肠道成虫荷和肌肉中肌幼虫数量均显着降低,但两组之间相同数量的成虫产出的新生幼虫数量没有差异。dsRNA干扰遗传性分析结果显示,旋毛虫成虫的TsSPI基因依旧受到抑制,而P 1代肌幼虫中TsSPI基因已经基本恢复到正常水平。因此我们推测肌肉中P 1代肌幼虫数量降低可能是肠道成虫荷降低导致的。将dsRNA-TsSPI介导的TsSPI基因沉默的旋毛虫感染小鼠,小鼠感染后4 d、7 d取腹腔巨噬细胞,用ELISA检测试剂盒检测小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中炎性细胞因子含量,结果显示,与对照组相比,感染旋毛虫后,小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12和抗炎性细胞因子TGF-β、IL-10含量均有不同程度的升高,而这种促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子形成的混合体内环境有利于旋毛虫的寄生;与感染后4 d相比,感染后7 d,促炎性细胞因子含量均有不同程度的降低,而抗炎性细胞因子含量没有显着变化。与感染未经过处理的旋毛虫的小鼠相比,感染TsSPI基因沉默的旋毛虫小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中炎性细胞因子含量均有不同程度的升高。可见TsSPI基因沉默后,旋毛虫引起的宿主炎性反应显着加剧,说明TsSPI可能通过影响宿主炎症因子之间的平衡缓解旋毛虫引起的宿主炎性反应。利用Western blot检测各组小鼠巨噬细胞P65磷酸化水平变化,结果显示,与对照组相比,感染旋毛虫的小鼠腹腔巨噬细胞P65磷酸化水平显着升高;和感染后4 d相比,感染后7 d小鼠腹腔巨噬细胞P65磷酸化显着降低,间接证明了随着感染时间的推移,旋毛虫引起的宿主免疫反应从Th1/Th2混合型反应转变为Th2型免疫反应为主。而与感染未经处理的旋毛虫的小鼠相比,感染TsSPI基因沉默的旋毛虫小鼠腹腔巨噬细胞P65磷酸化水平显着升高,说明TsSPI可以缓解旋毛虫感染引起的巨噬细胞NF-κB的磷酸化,进而抑制宿主炎症反应。利用qPCR检测旋毛虫感染后腹腔巨噬细胞中效应因子CAM标志物i NOs和AAM标志物Arg-1的m RNA表达量,结果显示,与对照组,感染旋毛虫的小鼠腹腔巨噬细胞效应因子i NOs以及Arg-1的表达量均显着升高;和感染后4 d相比,感染后7 d小鼠腹腔巨噬细胞i NOs表达量显着降低,而Arg-1表达量则显着升高,说明旋毛虫感染可以调节宿主巨噬细胞极化。与感染未经处理的旋毛虫的小鼠相比,感染TsSPI基因沉默的旋毛虫的小鼠腹腔巨噬细胞中效应因子i NOs的相对表达量显着升高,而效应因子Arg-1的相对表达量显着降低,说明TsSPI在旋毛虫调节宿主巨噬细胞极化过程中发挥重要作用。诱导表达重组蛋白TsSPI和mu TsSPI,其中mu TsSPI为丝氨酸蛋白酶抑制剂活性降低的突变体TsSPI。qPCR检测各CAM相关因子转录水平变化,结果显示,TsSPI可以抑制LPS介导巨噬细胞分泌CAM相关促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12和效应因子i NOs的转录表达,同时利用Western blot检测巨噬细胞P65磷酸化水平和IRAK、IκB的蛋白表达情况,结果显示,TsSPI可以抑制LPS介导的IRAK、IκB降解以及P65磷酸化,并且如果改用突变体刺激,以上调节功能均明显减弱。可见TsSPI可以依赖丝氨酸蛋白酶抑制活性抑制LPS介导的NF-κB通路活性,并进一步抑制促炎性细胞因子和效应因子i NOs的释放,阻止巨噬细胞向CAM极化。利用重组蛋白TsSPI和mu TsSPI直接刺激巨噬细胞。qPCR检测各AAM相关因子转录水平变化,结果显示,TsSPI可以有效的促进AAM相关抗炎性细胞因子TGF-β、IL-10和效应因子Arg-1的转录表达。同时利用Western blot检测巨噬细胞JAK2和STAT3磷酸化水平,结果显示,TsSPI可以刺激激活JAK2和STAT3发生磷酸化,改用突变体刺激并不影响这种调节功能。可见TsSPI可以刺激激活JAK2/STAT3信号通路,同时促进抗炎性细胞因子TGF-β、IL-10和AAM标志效应因子效应因子Arg-1的分泌,促进巨噬细胞向AAM极化。综上所述,dsRNA-TsSPI可以特异而有效的抑制TsSPI的基因转录水平及蛋白水平。TsSPI可能不直接参与寄生虫自身的生长和繁殖,但在一定程度上参与调节旋毛虫与宿主的相互作用。TsSPI基因沉默可以增强巨噬细胞NF-κB的磷酸化水平,促进巨噬细胞分泌炎性细胞因子,调节巨噬细胞极化。重组蛋白TsSPI可以依赖丝氨酸蛋白酶抑制活性抑制LPS介导的NF-κB通路活性,同时刺激激活JAK2/STAT3信号通路,并调节相应细胞因子和效应因子的表达。TsSPI可能通过调节巨噬细胞极化,进而影响宿主炎症因子之间的平衡,从而调节宿主免疫反应,为旋毛虫在宿主中的定殖创造有利环境。
姜鹏[3]（2020）在《旋毛虫烯醇酶激活宿主纤溶系统促进幼虫侵入肠黏膜机制的研究》文中认为旋毛虫（Trichinella spiralis）是重要的食源性寄生线虫,其成虫寄生于宿主小肠黏膜内。幼虫能否侵入宿主肠黏膜,是旋毛虫感染宿主与致病的关键;然而,幼虫侵入肠黏膜的机制仍不清楚。形态学研究发现,侵入期幼虫的口孔并无齿（矛）状结构,因而,幼虫侵入肠黏膜并非单纯机械力作用,极可能是幼虫的蛋白酶介导了侵入过程。烯醇酶（enolase）是糖酵解过程的关键酶,也是一个多功能蛋白,在纤溶系统激活、肌肉再生、细胞应激、癌细胞转移及感染等过程中发挥重要功能。研究表明,烯醇酶参与了病原生物感染宿主的过程并发挥了重要作用。我们的前期研究发现,幼虫在与宿主小肠上皮细胞（IECs）共孵育后,旋毛虫烯醇酶基因（Ts-eno）的相对转录水平显着升高,旋毛虫烯醇酶（Ts ENO）的表达量明显增加;此外,在旋毛虫肠道感染性幼虫（IIL）的表面蛋白中也鉴定出了高丰度的Ts ENO;提示,Ts ENO参与了幼虫侵入宿主肠黏膜的过程,但尚不清楚Ts ENO在幼虫侵入过程中发挥作用的具体方式和分子机制。截至目前,已在多种病原体（细菌、原虫、蠕虫和昆虫）侵入宿主的过程中观察到烯醇酶结合宿主纤溶酶原（PLG）,促进纤溶系统激活,加速病原体入侵的现象。纤溶系统不仅在血管内发挥作用,在组织液中也广泛分布。生理状态下,由于纤溶酶原激活物（PAs）与纤溶抑制物（PAI-1和α2-AP）相互制约,机体内纤溶系统维持凝血与纤溶之间的动态平衡,避免出现纤溶亢进（出血倾向）或血栓形成。研究提示,烯醇酶在感染过程中可作为PLG的受体,打破纤溶系统的动态平衡,促进纤溶系统激活,利用纤溶酶（PLM）靶向降解细胞外基质（ECM）的作用,协助幼虫侵入,但分子机制尚不明确。Ts ENO能否作为宿主PLG的受体?能否结合宿主组织液中的PLG并与之发生相互作用?Ts ENO打破平衡态纤溶系统、促进纤溶系统激活的分子机制是什么?Ts ENO是否具有促进幼虫侵入宿主的功能?是本研究关注的科学问题。本研究应用生物信息学技术,深入分析了Ts ENO的分子生物学特征,构建了Ts ENO的3D分子模型,并与已解析晶体结构的人PLG分子进行对接,明确了Ts ENO结合宿主PLG并发生相互作用的方式和分子机制;在对Ts ENO进行系统的生物信息学研究基础上,体外表达、纯化出重组的Ts ENO（r Ts ENO）和定点突变的重组Ts ENO（M-r Ts ENO）,分别制备对应的抗血清;分析了Ts-eno在旋毛虫不同发育期的转录表达水平及Ts ENO的虫体组织定位;对r Ts ENO与宿主肠黏膜、PLG的结合能力进行了鉴定;分析r Ts ENO的酶活性,通过竞争性结合实验和PLG激活试验,验证了Ts ENO与PLG相互作用的分子机制;通过旋毛虫体外侵入细胞模型、动物试验和RNA干扰技术（RNAi）,从多个层次和不同角度,正、反向反复验证了Ts ENO通过激活宿主纤溶系统协助幼虫入侵肠黏膜的科学假设。材料与方法1.旋毛虫种株、实验动物、表达质粒、菌株及细胞旋毛虫河南猪源分离株（T.spiralis,T1）,昆明小鼠保种传代。实验动物为SPF级、雌性6周龄BALB/c小鼠,购自河南省实验动物中心。表达载体p QE-80L及大肠杆菌BL21均为本实验室-80℃冷冻保存。细胞为本实验室分离、原代培养的胎鼠小肠上皮细胞（IECs）。2.Ts ENO的分子生物学特征及与PLG结合能力的分析和实验验证应用生物信息学技术,对Ts ENO（XP＿003371233）的分子生物学特征进行了系统分析;应用Signal P预测信号肽,使用I-TASSER构建Ts ENO的3D分子模型,采用SAVES及Super Pose评估和验证Ts ENO 3D分子模型质量,采用ZDOCK将Ts ENO与PLG（PDB ID:4DUR）进行分子对接,VMD、Lig Plot+（DIMPLOT）及PDBe PISA分析对接结果;明确结合关键位点后,使用I-TASSER构建定点突变的M-Ts ENO分子模型,对比分析关键位点突变产生的影响。将重组p QE-80L/Ts ENO、p QE-80L/M-Ts ENO转化入感受态大肠杆菌BL21（DE3）进行原核表达;Far-Western blot和ELISA检测r Ts ENO、M-r Ts ENO与PLG的结合情况;应用?-ACA,采用竞争性结合试验验证关键位点突变对结合的影响。3.Ts ENO促进纤溶系统激活的分子机制及实验验证应用VMD、Lig Plot+（DIMPLOT）及PDBe PISA分别分析Ts ENO、M-Ts ENO与决定PLG活性的关键色氨酸残基（Trp761）之间的相互作用;计算色氨酸残基（Trp761）在与Ts ENO、M-Ts ENO结合前后相互作用面积（2）、相互作用残基的溶液可及表面积(AASA)、溶剂化能（ΔiG）、氢键、二硫键及疏水相互作用的变化,测量并比较Trp761与其相互作用残基间的距离;测定纯化复性后r Ts ENO、M-r Ts ENO的酶比活力;应用PLG激活试验,观察r Ts ENO、M-r Ts ENO结合并激活PLG产生纤溶酶（PLM）的情况,观察PAs存在与否对r Ts ENO、M-r Ts ENO激活PLG产生PLM的影响,验证Ts ENO通过与PLG的活性决定残基（Trp761）发生相互作用促进纤溶系统激活的分子机制。4.Ts ENO在旋毛虫侵入宿主过程中的作用研究Real-time PCR分析Ts-eno在旋毛虫各期的转录水平,IFA检测Ts ENO在虫体的定位;Far-Western blot检测肌幼虫（ML）排泄分泌抗原（ES）与PLG的结合;IFA检测r Ts ENO与小鼠肠黏膜组织特异性结合;应用旋毛虫幼虫-IECs体外侵入模型,观察不同浓度r Ts ENO、不同稀释度的抗r Ts ENO血清对旋毛虫幼虫体外侵入IECs单层的促进及抑制作用;设计、合成特异性靶向Ts-eno的小干扰RNA（si RNA）,使用电穿孔法导入旋毛虫幼虫体内,应用Western blot检测si RNA对Ts ENO表达水平的抑制情况,通过RNAi反向验证Ts ENO在幼虫侵入过程中的功能;应用r Ts ENO免疫60只BABL/c小鼠后,将旋毛虫肌幼虫以300条/鼠的剂量感染BALB/c小鼠,分别于感染后第5 d和42 d,收集肠道成虫和肌幼虫,统计回收虫数、减虫率、肌肉虫荷（LPG）和生殖力指数（RCI）,分析r Ts ENO免疫小鼠后对幼虫侵入的影响,验证Ts ENO在幼虫侵入肠黏膜过程中的功能。5.统计学分析应用IBM SPSS 21.0统计分析软件包对结果数据进行统计学描述、假设检验及图表绘制,检验水准设定为α=0.05。结果1.Ts ENO的分子生物学特征及其与PLG结合的关键位点确定切除信号肽的Ts ENO长473 aa,约51.95 k Da;Ts ENO与常见寄生虫烯醇酶的序列一致性为62.09%～98.91%,具有烯醇酶家族特征性MOTIF,结构域、金属结合位点、激活位点和底物结合口袋呈现高度保守特征。Verify 3D发现Ts ENO分子模型82.24%残基的3D-1D评分≥0.2,ERRAT计算出Ts ENO的全局质量因子为90.753,拉氏图显示Ts ENO在允许区域内分布的残基占比为98.8%。Super Pose三维结构多重比对结果表明,Ts ENO的结构与5种已解析晶体结构的寄生虫相关烯醇酶（3QTP、1OEP、4G7F、3OTR和5WRO）高度一致;在碳骨架和全分子的均方根偏差（RMSD）最大仅分别为2.03和2.18。Ts ENO和PLG具有结构互补性,赖氨酸残基（Lys90、289、291和300）在结合时发挥关键作用,其中Lys90与PLG的Ser383形成氢键。Ts ENO与M-Ts ENO在碳骨架和全分子间的RMSD仅分别为2.63和3.30,但将M-Ts ENO与PLG对接时,M-Ts ENO出现在相互作用面上的赖氨酸残基仅有Lys116。Far-Western blot发现,r Ts ENO、M-r Ts ENO均能特异性结合PLG,但相同条件下M-r Ts ENO的识别条带明显弱于r Ts ENO。ELISA表明,与r Ts ENO相比,M-r Ts ENO的PLG结合能力明显下降,下降幅度最高达45.37%。不同浓度的ε-ACA均能与r Ts ENO或M-r Ts ENO竞争性结合PLG,ε-ACA的竞争性抑制作用具有随浓度升高而增强的线性趋势(Fr Ts ENO=3532.392,FM-r Ts ENO=3499.730,P均<0.01);不同浓度ε-ACA对r Ts ENO的竞争性抑制作用显着高于M-r Ts ENO（t=3.411,P<0.05）。浓度为25 mmol/L时,ε-ACA对r Ts ENO、M-r Ts ENO的竞争性抑制率分别为64.25%和33%。2.Ts ENO促进纤溶系统激活机制的分析与验证对Ts ENO-PLG蛋白复合物的分析发现,Ts ENO的Glu303与决定PLG活性的关键残基Trp761间的平均距离为7.28 1.60,二者可以通过疏水相互作用结合在一起,Glu303与Trp761在结合时的埋入面积(ABSA)分别为33.97 2和29.55 2,ΔiG依次为-0.24 kcal/mol和0.47 kcal/mol。Trp761与M-Ts ENO（Glu303Ala）的Lys90、Ser91,以及与M-Ts ENO（Lys90 Ala、Lys289Ala、Lys291Ala和Lys300Ala）的Phe48、Tyr93之间,均存在疏水相互作用;Trp761与Lys90、Ser91之间的距离分别为5.35 0.43和7.27 1.41,与Phe48、Tyr93之间的距离分别为5.57 0.51和6.76 0.84。单因素方差分析表明,Trp761与不同相互作用残基之间距离的差异具有统计学意义（F=10.546,P<0.01）;根据相互作用残基间的空间几何构型,Trp761（PLG）在与Glu303（Ts ENO）相互作用时产生的空间位移最大（7.28）;互作产生的位移在一定程度上减少了Trp761对PLG底物结合口袋（由催化残基His603、Asp646和Ser741组成）的物理阻挡,有利于PLG的激活。Ts ENO催化糖酵解途径中2-PGA PEP反应的活性位点（Glu246、Lys382）在突变前后均未出现在与PLG的相互作用面上。在37℃、p H=7.5的反应条件下,r Ts ENO和M-r Ts ENO催化正向反应（2-PGA?PEP）时的酶比活力分别为36.77 20.22 U/mg和34.63 16.86 U/mg,逆向反应时依次为16.73 10.70 U/mg和17.20 13.82 U/mg;r Ts ENO和M-r Ts ENO催化正向反应时（2-PGA?PEP）的Km值分别为0.78 mmol/L和0.80 mmol/L,最大反应速率Vmax分别为0.42μmol/min/mg和0.40μmol/min/mg。含有Mg2+的缓冲体系可使r Ts ENO和M-r Ts ENO达到最佳酶催化活力,Zn2+、Mn2+、Fe2+和Cu2+的促进作用不及Mg2+,K+、Ni2+、Al3+、Ca2+和Li+对该酶促反应仅有非常微弱的启动作用,而Cr3+则对r Ts ENO和M-r Ts ENO的酶活性具有完全的抑制作用。PLG或t-PA单独与r Ts ENO、M-r Ts ENO、肌幼虫可溶性抗原或ES抗原相互作用时,各组OD405值之间的差异不具有统计学意义(FPLG=1.355,Ft-PA=1.013,P均>0.05);当PLG与t-PA共同存在时,t-PA可以激活PLG并产生PLM,添加不同的蛋白后,各组OD405值之间的统计学差异具有显着性(FPLG+t-PA=344.875,P<0.05);r Ts ENO、M-r Ts ENO、肌幼虫可溶性抗原和ES抗原均明显地促进PLG的激活、增加PLM的产生量（P<0.05）;其中以肌幼虫可溶性抗原的促进作用最强,随后依次为r Ts ENO、M-r Ts ENO和ES。3.Ts ENO在旋毛虫侵入IECs单层及肠黏膜过程中的作用Real-time PCR结果表明,Ts-eno在旋毛虫肌幼虫（ML）、肠道感染性幼虫（IIL）、3 d成虫（3 d AW）、6 d成虫（6 d AW）和新生幼虫（NBL）均转录,以ML期相对转录水平最高（F=7.878,P<0.05）。IFA检测发现,Ts ENO在ML、6 h IIL、24 h IIL、3 d AW、6 d AW和NBL各发育期均表达,主要定位在杆状体、表皮及胚胎中。Far-Western blot证实,ES抗原中包括特异性结合PLG的52 k Da蛋白;IFA结果表明,r Ts ENO可以与小鼠肠黏膜组织特异性结合。体外侵入实验表明,不同浓度r Ts ENO组幼虫侵入数均高于PBS对照(t2=4.564,t4=7.920,t6=24.588,t8=19.100,t10=30.237,P均<0.05),幼虫侵入率具有随r Ts ENO浓度升高而增加的趋势（F=410.744,P<0.01）;抗r Ts ENO血清对幼虫侵入的抑制率最高达51.26%,抑制率具有随血清稀释倍数增加而降低的趋势（F=557.494,P<0.05）。使用si RNA-97干扰幼虫可使Ts ENO的表达量降低53.56%,对幼虫侵入IECs单层造成的抑制率为49.82%。以r Ts ENO免疫BALB/c鼠后,5 d成虫减虫率为31.79%,42 d肌幼虫减虫率为47.15%;r Ts ENO免疫组的LPG及RCI均低于佐剂组和PBS对照组(FLPG=39.375,FRCI=46.533;P均<0.01)。结论1.旋毛虫烯醇酶（Ts ENO）的4个赖氨酸残基（Lys90、289、291和300）在Ts ENO与宿主纤溶酶原（PLG）结合时发挥重要作用。2.Ts ENO 4个赖氨酸残基的定点突变,导致M-r Ts ENO与PLG的结合能力显着降低;在与t-PA共同存在时,r Ts ENO能明显地促进PLG激活。3.重组Ts ENO具有促进幼虫侵入的功能,可诱导产生特异性免疫保护;Ts ENO是旋毛虫侵入宿主肠黏膜时的重要蛋白,可能是研制新型抗旋毛虫疫苗/药物的候选靶标。
李婷婷[4]（2019）在《旋毛虫三种半胱氨酸蛋白酶抑制因子的功能研究及重组酶聚合酶扩增检测方法的建立》文中认为由于旋毛虫的传播途径复杂,宿主地理分布广泛,旋毛虫病仍未得到有效控制。加强对该病的诊断和通过有效的疫苗阻断旋毛虫的传播是预防人类或者家养动物感染旋毛虫病的有效手段。寄生性线虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cysteine protease inhibitor,CPI或cystatin）不仅具有独特的半胱氨酸蛋白酶抑制活性,而且还可以调节宿主免疫反应,在寄生虫逃避宿主免疫应答,适应寄生生活中起着重要作用。本研究成功克隆了旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2基因,并且在原核表达系统中诱导表达,纯化后的重组蛋白具有蛋白酶抑制活性,可以在不同pH和温度下抑制人组织蛋白酶B的活性。TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2在旋毛虫的肌幼虫、成虫和新生幼虫时期均有转录,主要表达于肌幼虫的表皮和杆状体中。体外研究了重组TsCystatins对IFN-γ激活的巨噬细胞RAW264.7的影响。结果发现,重组TsCystatins和IFN-γ共同作用于RAW264.7细胞明显抑制了NO的产生,并且呈现剂量依赖性。重组TsCystatins能够抑制IFN-γ激活的RAW264.7细胞促炎性细胞因子（IL-6、IL-12和TNF-α）的分泌,而重组TsCystatins单独作用促进了抗炎性细胞因子（IL-10）的分泌。说明TsCystatins是旋毛虫感染宿主的免疫调节分子,通过抑制宿主巨噬细胞的炎症反应逃避宿主的免疫应答,来达到在宿主体内长期寄生的目的。攻击感染试验结果发现,重组的TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2能够刺激机体产生较高水平的抗体,但是不能有效的减少免疫鼠肌肉中旋毛虫的荷虫量。为了进一步确定TsCystatins对旋毛虫感染的免疫保护力,我们以弓形虫弱毒株RHΔGRA17为表达载体,使得TsCystatin2成功表达,且对该弱毒株的体外裂殖、宿主细胞的入侵及在宿主细胞内的增殖不产生影响。小鼠免疫RHΔGRA17::TsCystatin2产生较高水平的抗弓形虫特异性IgG;利用弓形虫裂解抗原刺激免疫之后的脾细胞能够产生较高水平的IL-12及IFN-γ。腹腔感染弓形虫强毒株试验的结果发现,小鼠免疫RHΔGRA17::TsCystatin2能抵抗弓形虫的再次感染。另外,免疫转基因RHΔGRA17::TsCystatin2虫株能够刺激小鼠产生抗旋毛虫特异性的体液免疫应答以及Th1为主的细胞免疫应答（较高水平的IgG2a、IL-12和IFN-γ）。但是,Th2型细胞因子（IL-4和IL-10）在免疫小鼠中并没有显着增加,而这种Th1主导的免疫反应并不能使免疫小鼠在随后的旋毛虫攻击感染中获得有效的免疫,即不能有效的减少免疫鼠肌肉中旋毛虫的荷虫量。以上研究结果说明TsCystatins可能不是理想的疫苗候选蛋白。此外,本研究以旋毛虫属（Trichinella spp.）线粒体小亚单位核糖体RNA（rrnS）基因为靶点,建立了重组酶聚合酶扩增技术和侧流层析试纸条（LF-RPA）联合检测旋毛虫感染的诊断方法。该方法可在25-45℃范围内进行,10-25 min内即可完成,且可检测到低至100 fg的旋毛虫DNA,具有简便、快速、准确、高特异性和敏感性的特点。
孙阁阁[5]（2019）在《旋毛虫丝氨酸蛋白酶的表达与鉴定及用于免疫诊断的研究》文中指出由旋毛虫引起的旋毛虫病是一种呈全球性分布的食源性人兽共患寄生虫病,主要是通过食用含有旋毛虫感染性幼虫的生的或者不熟的肉类所导致的。近年来在我国周边国家如韩国、泰国、老挝、越南等国也已发生了多次人体旋毛虫病暴发,因此,旋毛虫病作为了一种新现和再现的人兽共患疾病,对人体健康、社会、经济均造成了巨大的影响。目前,国内外对旋毛虫病的诊断主要集中在肌肉幼虫阶段的旋毛虫抗原。国际旋毛虫病委员会（ICT）建议旋毛虫肌幼虫ES抗原可作为诊断旋毛虫的金标准。然而,当旋毛虫肌幼虫ES抗原用于检测旋毛虫感染小鼠或猪的血清时,抗旋毛虫抗体IgG直到感染后3-4周才能检测到阳性;并且感染旋毛虫的病人在感染28天以后抗旋毛虫的抗体阳性率才能达到100%。因此,在旋毛虫感染后存在有23周的“窗口期”（window phase）。在旋毛虫的生活史中,肠道感染性幼虫（IIL）和成虫是旋毛虫对宿主肠黏膜的侵入期,其ES蛋白最早与肠黏膜直接接触并相互作用,能够接触宿主的免疫系统首先引起宿主的免疫应答;因此,IIL和成虫的排泄分泌抗原含有刺激宿主产生早期免疫应答的主要成分。在旋毛虫感染后的早期,最早出现的抗旋毛虫抗体也是针对这些抗原的。由于旋毛虫感染宿主后4周才发育为成囊期幼虫（肌幼虫）且被包裹在胶原囊中,肌幼虫接触宿主的免疫系统比较晚,因此宿主产生的抗肌幼虫抗体也比较晚。所以,现在迫切的需要从旋毛虫肠道期虫体中鉴定和筛选特异性的早期诊断抗原。本研究运用血清学诊断的方法检测旋毛虫成虫ES抗原对旋毛虫病的早期诊断价值,从成虫ES蛋白中筛选出旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶（Trichinella spiralis putative serine protease,TsSP）进行克隆表达和功能鉴定,同时检测rTsSP对旋毛虫感染的早期诊断及疫苗靶标的潜在应用价值。材料方法1旋毛虫、实验动物、血清、菌种及细胞系不同种旋毛虫在本实验室传代保种备用。整个实验所用的动物均购买于实验动物中心。血清:旋毛虫不同种属、弓形虫、裂头蚴、日本血吸虫和广州管圆线虫感染小鼠血清,以及其他寄生虫感染病人血清。细胞系:IEC,C2C12,于本实验室液氮中冻存。载体和菌种:克隆载体pGEM-T,表达载体pQE-80L,宿主菌为BL21,为本实验室冻存。2旋毛虫成虫ES抗原的早期诊断价值评估AW ES-ELISA诊断旋毛虫病的敏感性和特异性。准备30只雌性BALB/c小鼠,感染不同剂量的旋毛虫（100条/只和500条/只）。AW ES-ELISA检测旋毛虫早期和轻度感染小鼠血清的敏感性。最后AW ES-ELISA检测旋毛虫感染早期及晚期病人血清及其他寄生虫病人血清,进一步评估AW ES对旋毛虫病早期诊断价值的敏感性和特异性。3旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶（TsSP）生物信息学分析,克隆表达及鉴定将早期感染血清识别的成虫ES蛋白进行质谱分析后,从被鉴定的蛋白中挑选出了具有潜在早期诊断价值的旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶（Trichinella spiralis putative serine protease,TsSP）。应用NCBI,ExPasy,SignalP3.0serve及TMHMM Server v.2.0等在线软件分析预测了TsSP的结构域、理化性质、信号肽与跨膜结构域;在大肠杆菌中克隆表达并纯化,将纯化后的rTsSP皮下接种免疫小鼠,获得rTsSP免疫血清,Western-blot检测rTsSP的免疫原性及抗原性;通过RT-PCR和q-PCR检测TsSP基因在旋毛虫不同发育虫期是否转录及转录水平的高低;通过间接免疫荧光（IFA）检测TsSP在不同发育虫期虫体表面及内部的表达;对不同虫期虫体进行石蜡包埋及冰冻组织切片,通过IFA观察TsSP在不同时期虫体的具体定位;制备不同虫期的可溶性蛋白,通过ELISA和Western blot,检测TsSP蛋白在不同虫期是否表达及表达量的高低。4 TsSP与宿主肠上皮细胞的特异性结合及其功能鉴定通过Far-Western、ELISA及IFT分析了rTsSP与小鼠肠上皮细胞（IEC）的特异性结合作用。将不同稀释度的抗rTsSP血清、感染血清及正常血清分别与肠道感染性幼虫（IIL）混合后,分别接种到IEC单层中体外孵育2h进行幼虫体外侵入实验,镜下观察不同血清对IIL侵入IEC的抑制作用。通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）检测抗rTsSP血清对虫体的杀伤作用,镜下观察幼虫的活性和巨噬细胞粘附情况,并计算幼虫死亡率,并将抗rTsSP抗体依赖的ADCC作用后的ML经口感染小鼠,计算ADCC作用后肌幼虫的感染率。5 rTsSP对旋毛虫病的早期诊断按重度（500条/只）、中度（300条/只）及轻度（100条/只）3个剂量,将不同剂量的旋毛虫感染小鼠,每组各10只,感染后开始隔天采血,rTsSP-ELISA检测rTsSP对旋毛虫早期感染血清的识别、检测rTsSP对旋毛虫感染小鼠血清的敏感性与特异性。同时检测旋毛虫感染猪血清,旋毛虫感染早期及晚期病人血清及其他寄生虫病人血清,进一步评估rTsSP对旋毛虫病的早期诊断的潜在应用价值。6 rTsSP在免疫保护中的应用为了评估rTsSP的免疫保护作用,每只小鼠皮下免疫20μg rTsSP,隔10天免疫1次,共免疫3次,检测免疫后抗rTsSP抗体水平及所诱导的体液免疫应答,并计算成虫和肌幼虫的减虫率;并用霍乱毒素亚单位（CTB）作为佐剂,通过滴鼻途径对小鼠接种rTsSP。间隔10d免疫1次,共免疫3次,分别检测滴鼻免疫后肠道内总的和特异性sIgA水平;肠道分泌sIgA细胞及杯状细胞的数量;检测脾细胞和肠系膜淋巴结诱导的细胞因子水平的变化;计算感染后收集不同天数成虫和肌幼虫的减虫率。7统计学分析用SPSS17.0分析软件和Graphpad Prism对所有结果和数据进行统计学分析及图表绘制,采用单因素方差分析,重复资料方差分析,t检验和卡方检验进行统计分析,检验水平α=0.05。结果1.成虫ES抗原的早期诊断应用成虫ES-ELISA检测感染旋毛虫不同剂量后不同天数的小鼠血清,结果表明,成虫ES抗原与粗抗原和肌幼虫ES在检测感染100条旋毛虫感染血清时,分别在感染后8、12及12天检测到抗旋毛虫抗体IgG,在检测高剂量组（500/条）时分别在10,8,10天检测到抗旋毛虫抗体。用这3种抗原分别检测旋毛虫早期和晚期病人血清结果表明,成虫ES的敏感性和特异性分别是100%和97.48%。2.TsSP生物信息学分析预测TsSP基因（GI:164521948）序列全长为1372bp,编码429个氨基酸残基,其分子质量为47.55kDa,等电点为8.73;不稳定指数为42.25,脂肪指数为71.52,总的平均亲水性是-0.360,认为该蛋白为亲水性蛋白。该蛋白N端具有明显的疏水性区域,无跨膜区。预测TsSP为分泌型蛋白,存在信号肽,切割位点在18-19位氨基酸残基之间,表明成熟的肽段始于第19位氨基酸,具有信号肽SP序列,认为其能够分泌到细胞外。该蛋白在第37-277位之间是个高度保守的结构功能域Tryp-SPC。I-TASSER预测TsSP属于丝氨酸蛋白酶家族。3.TsSP的克隆表达及鉴定设计PCR外引物和具有特异性酶切位点的内引物,通过巢式PCR扩增出大小为1236bp的TsSP基因,将TsSP基因连接到克隆载体pGEM-T中,双酶切后将TsSP基因再连接到表达载体pQE-80L上构建重组表达质粒,转染E.coli BL21感受态细胞。双酶切鉴定重组质粒构建成功。对连接成功的单菌落加入IPTG诱导表达,收集菌体进行SDS-PAGE,发现在45.2kDa处出现一条明显条带,而未经诱导的细菌未见此条带,表明TsSP重组蛋白表达成功。Western blot分析显示,rTsSP蛋白能被旋毛虫感染小鼠血清和抗rTsSP血清识别,表明rTsSP具有良好的免疫原性和抗原性。RT-PCR和qPCR结果表明TsSP基因在旋毛虫不同发育虫期（ML,IIL,3dAW,6dAW和NBL）均转录,并且各个发育期转录水平没有差异（P>0.05）。Western blot和ELISA结果表明TsSP在旋毛虫的各个虫期均表达,并且在IIL和NBL表达水平相对较高;IFA结果显示,TsSP在以上5个虫期均表达,并且主要定位在虫体的表皮,杆状体和胚胎部位。4.TsSP与宿主肠上皮细胞的特异性结合及其功能鉴定4.1 rTsSP与肠上皮细胞结合的特异性分别通过Far-Western、ELISA及IFT分析了rTsSP与小鼠肠上皮细胞（IEC）的特异性结合作用,Far-Western结果显示抗rTsSP免疫血清识别了24条蛋白带,分子量为14.4kDa86.5kDa,而rTsSP不能与C2C12蛋白结合,表明rTsSP能与IEC蛋白特异性结合。ELISA检测亦发现rTsSP能与IEC蛋白结合且具剂量依赖性。IFT发现rTsSP可与IEC和肠粘膜特异性结合;共聚焦显微镜检查结果表明rTsSP与IEC的结合部位是细胞膜与细胞质。4.2抗rTsSP抗体对幼虫侵入IEC的抑制或阻断作用体外侵入实验结果表明,在相同血清稀释度（1:50）时,抗rTsSP血清、感染血清及正常血清组的幼虫侵入率分别为31.48%,15.84%及84.16%（P<0.01）,且抗rTsSP抗体对幼虫的侵入作用具有抗体剂量依赖性,随血清稀释度的增加而降低（P<0.01）,表明抗rTsSP抗体对幼虫侵入IEC具有明显的抑制作用。4.3抗rTsSP抗体依赖的ADCC对旋毛虫幼虫的杀伤作用将抗rTsSP血清、感染血清及正常血清分别与新生幼虫（NBL）和肌幼虫（ML）共孵育,再分别加入小鼠腹腔巨噬细胞孵育不同时间后,镜下观察幼虫的活性和巨噬细胞粘附情况,并计算幼虫死亡率。结果显示当血清稀释度为1:100时,抗rTsSP血清能促进巨噬细胞对NBL和ML的粘附。抗rTsSP血清对NBL和ML的细胞毒性分别为52%与44.67%,明显高于正常血清的21.33%和18%（P<0.01）;细胞毒性具有抗体剂量依赖性,且随孵育时间的延长而增加（P<0.01）。结果表明抗rTsSP抗体依赖的ADCC在体外对NBL和ML具有特异性杀伤作用。将抗rTsSP抗体依赖的ADCC作用后的100条ML经口感染小鼠,与正常血清组相比,感染后3d与42d的成虫与肌幼虫减率分别为89.4%和36.50%,表明抗rTsSP抗体可通过ADCC方式杀伤ML,并可明显降低ML的感染性及其在肠道中的发育。5.rTsSP的诊断价值在旋毛虫重度、中度和轻度感染小鼠,rTsSP-ELISA分别在感染后8、7及7天检测到抗rTsSP抗体,并且在感染后16、10及10天抗体检测阳性率达到100%;rTsSP-ELISA检测旋毛虫感染小鼠的敏感性与特异性均为100%。rTsSP-ELISA诊断早期和晚期旋毛虫病人时的敏感性分别为95.24%和100%,对于早期旋毛虫病人诊断的敏感性明显高于肌幼虫ES诊断的敏感性（75%,P<0.05）;rTsSP-ELISA诊断旋毛虫病人的特异性（99.49%）明显高于ES-ELISA的特异性（91.41%）（P<0.05）。6.rTsSP的免疫保护6.1皮下接种rTsSP诱导的免疫第1次与第2次免疫后血清中rTsSP特异性抗体IgG水平明显升高,末次免疫后10d抗rTsSP抗体IgG效价为1:105;免疫后10、20、30及40d,IgG1水平明显高于IgG2a（P<0.01）,表明rTsSP免疫小鼠诱导了Th2型为主的体液免疫应答。与PBS组相比,rTsSP免疫组和佐剂对照组在攻击感染后5d的成虫减虫率分别是52.70%和10.30%（P<0.05）;感染后42d,rTsSP免疫组和佐剂对照组的肌幼虫减虫率分别是52.1%和3.66%（P<0.05）。结果表明,rTsSP皮下免疫小鼠可诱导明显的免疫保护。6.2经鼻接种rTsSP诱导的免疫保护用rTsSP经鼻免疫小鼠可引起明显的肠道总sIgA及TsSP特异性sIgA水平升高;血清TsSP特异性抗体IgG/IgM/IgA水平亦明显升高;在免疫接种小鼠的十二指肠中能检测到更多的杯状细胞/酸性粘蛋白和IgA分泌细胞。与对照组相比,rTsSP免疫组的IFN-γ,IL-4和IL-10水平显着增加。末次免疫后10d用300条幼虫攻击感染,与PBS对照组相比,感染后3、5、7、9d的成虫减虫率分别是49.95%、61.30%、68.30%及71.10%（P<0.001）;感染42d免疫组和佐剂组的肌幼虫减虫率分别是62.1%及13.9%（P<0.001）。结果表明,rTsSP经鼻免疫小鼠后诱导了明显的肠道sIgA应答及全身的Th1/Th2混合型免疫应答,并对旋毛虫攻击感染产生了明显的保护效果。结论1.旋毛虫成虫ES抗原对旋毛虫病早期诊断具有较高的敏感性和特异性,为旋毛虫病的早期诊断提供一个新的诊断抗原来源;2.克隆表达了旋毛虫TsSP,TsSP在旋毛虫的各个虫期均有转录和表达,主要定位在虫体的表皮,杆状体和胚胎;3.rTsSP蛋白能够与肠上皮细胞特异性结合,抗rTsSP抗体能够抑制旋毛虫体外侵入肠上皮细胞,抗rTsSP抗体能够介导巨噬细胞对NBL和ML的杀伤作用。TsSP可能是旋毛虫对IEC的主要侵入蛋白;4.rTsSP-ELISA诊断旋毛虫病具有较高的敏感性和特异性,可作为旋毛虫病潜在的早期诊断抗原;5.rTsSP蛋白皮下/经鼻免疫小鼠后,诱导了局部粘膜和全身的Th1/Th2混合型免疫应答,并对旋毛虫攻击感染产生了明显的保护效果。
翟铖铖[6]（2018）在《旋毛虫不同发育时期抗原基因的克隆表达与诊断特性研究》文中研究说明旋毛虫病是一种危害严重的食源性人兽共患寄生虫病,呈世界性分布。从发现至今已近200年,但每年在世界各地仍有大量病例并引起多起暴发。由于旋毛虫病的临床症状不具有特异性,所以不易诊断,尤其是早期诊断,至今仍没有一种快速、准确、便捷的诊断方法。本研究旨在找到一种敏感性高、特异性好、又能大量制备的优质抗原,可用于研制旋毛虫病的免疫学诊断制剂。目的:本研究基于以往研究基础所获得的旋毛虫不同发育时期的4个强反应原性抗原基因,进行体外克隆表达,获得大量高纯度的基因重组蛋白,利用ELISA技术对人工感染不同剂量、不同时间的鼠血清中旋毛虫特异性抗体水平进行检测,并利用人体旋毛虫病人血清进行诊断效果的初步鉴定,筛选出可用于旋毛虫免疫学诊断的基因重组抗原,为进一步建立起有效的旋毛虫病免疫学诊断方法奠定研究基础。方法:根据NCBI-Gene注册的不同发育时期的4个基因序列,即感染后6h肠道幼虫期（inML6h）的类半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cysteine proteinase inhibitors-like,CPIL）基因Wn10、成虫Ad3期丝氨酸蛋白酶（serine protease,SP1）基因Zh68、新生幼虫期（NBL）特异性丝氨酸蛋白酶（serine protease,SP2）基因T668、肌幼虫期（ML）丝氨酸蛋白酶抑制因子（Serpin）基因Wm5,利用生物信息学方法预测4个基因编码蛋白的结构功能与抗原表位,并利用原核表达系统进行体外大量表达与纯化,获得纯度较高的基因重组蛋白,分别命名为P1、P2、P3和P4;进一步通过ELISA方法,利用基因重组蛋白对人工感染不同旋毛虫剂量、不同时间的鼠血清中旋毛虫特异性抗体水平进行检测;同时,利用旋毛虫病人血清分别对4个发育时期的ES抗原、基因重组抗原及市面上的旋毛虫诊断试剂盒进行诊断效果的比较;利用SPSS 22.0对所得数据进行统计学分析。结果:根据生物信息学的预测结果,4个基因所编码的蛋白都为亲水性蛋白,SP2有一个跨膜区,CPIL、SP1和SP2都含有信号肽,都具有众多抗原表位,且挑选出优势抗原表位。利用原核表达系统及蛋白纯化技术,成功获得了 4个纯度较高的基因重组蛋白。进一步利用ELISA方法结果表明:1)对鼠血清的检测结果显示,在IgM水平上,4个重组蛋白检测的抗体水平都较低或阴性;在IgG水平上,P1在低剂量和高剂量分别在第10天和第8天检测出阳性,在感染后第11-45天均为阳性且维持较高水平,感染早期低剂量组抗体水平明显高于高剂量组,P2、P3、P4最早分别在第10天、第14天、第16天可检测出阳性,在感染剂量上没有P1差别明显,且整体阳性检测水平低于P1。2)对病人血清诊断结果显示,在IgM抗体水平上,4种ES抗原、P2及P3都能诊断出全部旋毛虫病人的IgM抗体;在IgG抗体水平上,4种ES抗原、P4和IgG诊断试剂盒均能诊断出全部旋毛虫病病人的IgG抗体。结论:利用鼠血清的检测,4个重组蛋白对旋毛虫病IgG抗体都有较好的诊断效果,其中感染6小时肠道幼虫期的类半胱氨酸蛋白酶抑制因子（P1）可作为早期感染诊断的候选抗原,肌幼虫期的丝氨酸蛋白酶抑制因子（P4）可作为中晚期感染诊断的候选抗原,同时发现P1在感染低剂量明显高于高剂量的抗体水平,推测其可能参与旋毛虫感染引起的宿主免疫抑制功能,为研制旋毛虫病的阻断剂和保护剂提供重要的参考价值;利用旋毛虫病人血清对4个基因重组蛋白的诊断特性进行鉴定,P2和P3可作为旋毛虫病IgM抗体检测的候选诊断抗原,P4可作为旋毛虫病IgG抗体检测的候选诊断抗原;P1和P4的诊断特性及应用价值还需要进一步完善和深入研究。
雷帅[7]（2009）在《旋毛虫P53ES基因重组蛋白单克隆抗体的制备和鉴定》文中认为旋毛虫病是由旋毛形线虫（Trichinella spiralis）引起的一种人兽共患寄生虫病,主要寄生于猪、野猪、鼠、熊等150多种动物及人体。人体主要因生食或半生食含有旋毛虫肌幼虫囊包的猪肉或其他动物肉类而感染。由于其病原传播的复杂性,以致该病发现一百多年来,不仅没有得到完全有效的控制,而且发生范围反而逐渐扩大。要迅速、有效地控制和预防旋毛虫病的流行,必须有快速准确的检测技术。本研究选用旋毛虫P53ES基因重组蛋白免疫小鼠制备McAb,为进一步研制旋毛虫病诊断试剂盒提供理想、必备的试验材料。以旋毛虫P53ES基因的重组蛋白免疫BALB/c鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合,经间接ELISA筛选和有限稀释法克隆,筛选分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,制备腹水。Southern Biotechnology Associates,Inc的SBA ClonotypingTMSystem/AP对单克隆抗体进行亚类鉴定;采用ELISA间接法测定杂交瘤细胞上清液和小鼠腹水效价;Western-blot检测单克隆抗体的特异性;测定杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性;间接ELISA检测单克隆抗体与隐孢子虫、猪鞭虫、猪囊尾蚴囊液抗原、多头蚴囊液、日本血吸虫抗原是否存在交叉反应;间接免疫荧光方法检测单克隆抗体与肌幼虫的免疫学反应。结果表明:得到两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2H5和3D2;试剂盒鉴定两株McAb均属IgM亚类,其轻链均为κ链;腹水效价分别为1:24000和1:12000;Western-blot证实两株McAb均能与约53ku处的ES抗原反应,出现特异性条带;杂交瘤细胞株连续传20代,细胞生长良好,效价稳定;所得单抗与隐孢子虫、猪鞭虫、猪囊尾蚴囊液抗原、多头蚴囊液、日本血吸虫抗原均无交叉反应;间接免疫荧光试验结果表明单克隆抗体与肌幼虫发生免疫学反应。本研究成功制备了两株抗旋毛虫P53ES重组蛋白的单克隆抗体,为旋毛虫病的研究和研制旋毛虫病诊断试剂盒奠定了基础。
李文辉[8]（2008）在《伪旋毛虫肌幼虫WR29抗原基因的克隆、表达及鉴定》文中指出旋毛虫可以感染包括人类在内几乎所有的哺乳动物,是宿主范围最为广泛的寄生虫之一,它所引起的旋毛虫病是一种呈全球性分布的、危害严重的人兽共患寄生虫病。由于旋毛虫抗原成分极其复杂,而且不能进行体外大量培养和繁殖,旋毛虫病免疫诊断及预防相对困难,通过构建旋毛虫不用时期的cDNA表达文库,并利用免疫学筛选方法获得了功能性抗原基因,对旋毛虫病的诊断和防治等具有重要意义。本研究利用分子生物学及免疫学技术,分离肌幼虫抗原基因,为旋毛虫病反应原性及特异性诊断抗原基因的筛选及大量制备奠定基础。将阳性克隆pBluescript-WR29进行测序,用分子生物学软件对所得cDNA序列进行分析。利用PCR技术,从筛选得到的pBluescript-WR29重组质粒中扩增到不含信号肽序列的WR29基因片段,克隆到pMD18-T载体,序列测定后重组到原核表达载体pET-28a中。将重组质粒pET-28a-WR29转入克隆菌DH5α和表达菌BL21（DE3）感受态细胞中,提取质粒进行PCR鉴定和测序鉴定。用IPTG诱导培养重组表达菌,对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,经IPTG诱导后重组菌体裂解产物与对照菌相比出现了一条相对分子量约为27.9kDa的新条带,与重组蛋白的理论值相符,薄层扫描结果显示,在诱导4h时,表达量达到高峰,目的蛋白占菌体总蛋白的58.1%。以切胶纯化的WR29重组蛋白为抗原免疫VC獭兔,每二周免疫一次,共免疫5次,末次免疫后二周心脏采血取血清。检测血清效价。Western-blotting检测显示,重组抗原可被旋毛虫感染猪血清识别。设计WR29基因特异引物,利用RT-PCR技术,从提取的伪旋毛虫肌幼虫、新生幼虫、3日龄及5日龄成虫期总RNA中反转录WR29 cDNA,对RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,结果显示,此基因在伪旋毛虫肌幼虫、新生幼虫、3日龄及5日龄成虫期均有表达。本研究为进一步建立敏感、特异的旋毛虫病免疫学检测方法奠定基础。
杨志东[9]（2007）在《旋毛虫、伪旋毛虫肌幼虫cDNA文库的构建及其免疫学筛选》文中研究指明旋毛虫病是一种危害非常严重的食源性人兽共患病,是世界各国屠宰动物首检和强制性必检的人兽共患病病种。在我国其不但被列为三大人重要食源性人兽共患寄生虫病之首（旋毛虫,囊虫及棘球蚴）,同时也是烈性人兽共患病（如SARS、禽流感）流行之后突现出来的可长期和经常制造突发性重大公共卫生事件的典型病种。本研究通过分子生物学技术构建旋毛虫、伪旋毛虫肌幼虫cDNA文库,利用免疫学方法对两个文库进行筛选,分离其特异性基因,从而为旋毛虫的诊断性及保护性抗原的筛选及大量制备奠定基础。本研究从旋毛虫肌幼虫中提取总RNA,并分离mRNA,通过ZAP表达载体成功构建了中国河南猪旋毛虫分离株肌幼虫cDNA文库。鉴定结果表明:库容量为1.92×106,重组率为98. 6 %,文库扩增后的滴度为1.6×109 pfu/mL。然后,以旋毛虫感染猪血清为抗体探针,对本文库进行免疫学筛选,经初筛、复筛,共筛选出15个阳性克隆,得到一个强反应原性高拷贝的旋毛虫肌幼虫cDNA分子（WM5）,其编码丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor）,与日本Nagano注册的cDNA相比同原性很高,仅有3个核苷酸不同,2个氨基酸发生变化。本研究者等人认为这两个核苷酸的变异可能是由旋毛虫不同分离株的单核苷酸多态性（SNP）所致,且该三个核苷酸的变异是我国旋毛虫T. spiralis种分离株该cDNA的特异性和特征性SNP标记。本实验获得了大量丝氨酸蛋白酶抑制剂,有望成为旋毛虫病的诊断抗原基因,并为基因重组诊断抗原的进一步研究奠定基础。同时,对研究国内外物种侵入及肉类进出口具有重要意义。利用上述方法我们又成功构建了罗马尼亚猪伪旋毛虫分离株T4肌幼虫cDNA文库。鉴定结果表明:容量为4.0×106,重组率为95.4 %,文库扩增后的滴度为1.5×109pfu/ mL。应用伪旋毛虫感染猪血清对伪旋毛虫肌幼虫cDNA文库进行免疫筛选,获得44个阳性噬菌斑。选择其中27个反应信号相对较强的阳性克隆噬菌斑进行测序。发现11个克隆编码同一个未曾报道过的新基因;即编码蛋白酶激活因子亚基（Proteasome activator subunit）,根据筛选实验中反应信号强弱情况及序列分析结果推断,强反应原性高拷贝的编码蛋白酶激活因子亚基的cDNA分子,有望成为伪旋毛虫病的诊断抗原基因,为筛选和克隆伪旋毛虫功能性抗原基因的深入研究奠定基础。
路义鑫[10]（2006）在《旋毛虫49ku ES抗原基因核酸疫苗构建及免疫保护作用研究》文中研究表明本研究根据GenBank中已发表的序列（M64242）为参考设计引物,用SDS裂解液配合蛋白酶K的方法提取总RNA,用RT-PCR方法从黑龙江猪、犬、猫旋毛虫,美国猪旋毛虫、旋毛形线虫、本地毛形线虫6个旋毛虫隔离种的成囊前期幼虫及黑龙江猪旋毛虫不同发育时期（成囊前期幼虫、肌幼虫、成虫）虫体中扩增出了带有Kozak序列的49ku ES抗原基因,将目的基因定向克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌TG1。构建了重组质粒pMD18-T-S/EL、pMD18-T-D/EL、pMD18-T-C/EL、pMD18-T-AS/EL、pMD18-T-T1/EL、pMD18-T-T2/EL,pMD18-T-S/ML和pMD18-T-S/AM,经PCR、限制性内切酶EcoRI和BamHI进行单、双酶切鉴定,阳性质粒测序。成功克隆了6个旋毛虫隔离种成囊前期幼虫及猪旋毛虫不同发育时期虫体49ku ES抗原基因。序列分析结果显示:49ku ES抗原基因由起始密码子到终止密码子的核苷酸长为951bp,包含完整的阅读框,编码316个氨基酸残基。所获6个旋毛虫隔离种基因序列经同源性分析表明,6个旋毛虫隔离种与GenBank上发表的序列核苷酸的同源性为97.0%～97.5%,推导氨基酸的同源性为93.4%～94.6%。6个隔离种之间的同源性为99.3%～99.9%,基因的保守性很强,不同隔离种之间的差异很小,其编码蛋白的抗原性也基本相同。所获猪旋毛虫不同发育时期虫体基因序列经同源性分析表明,猪旋毛虫成囊前期期幼虫、肌幼虫和成虫与GenBank中已知序列的同源性分别为,97.5%、97.3%和97.3%;猪旋毛虫不同发育时期虫体之间具有高度同源性,成囊前期幼虫与肌幼虫的核苷酸序列同源性达99.8%,在第535位点上有一个T→C突变,在第665位点上有一个T→C突变;与成虫的同源性同样为99.8%,在第535位点上有一个T→C突变,在848位点上有一个A→G突变;肌幼虫与成虫相比,同源性为99.8%,在第665位C→T、在848位A→G。导致与之相对应的氨基酸序列发生相应的改变。其编码蛋白的抗原性也很稳定,同种不同发育时期虫体之间的差异很小。将真核表达载体pcDNA3.1（+）与pMD18-T-S/EL分别用BamHⅠ和EcoR I双酶切,胶回收纯化后连接。经PCR、酶切鉴定,证明P49-S/EL基因按设计要求已插入表达载体中,构建了真核表达载体pcDNA-P49-S/EL。将家兔随机分为A、B、C组,分别肌肉注射pcDNA3.1（+）、pcDNA3.1-P49-S/EL和pcDNA3.1-P49-S/EL+LipofectamineTM2000。每只家兔100μg/100μl,共免3次,每次间隔1周。首次免疫后第0d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、51d采血分离血清用ELISA法检测抗体动态变化,同时检测外周血CD4+、CD8+T细胞动态变化。A组家兔血清在旋毛虫攻击感染后21d（42d）开始检出阳性抗体,然后迅速升高;B组家兔血清在免疫期间一直没能检出阳性抗体,而是在旋毛虫攻击感染后14d（35d）开始检出阳性抗体,而后迅速升高;C组家兔血清在3免后7d（21d）即可检出阳性抗体,旋毛虫攻击感染后,血清抗体OD值有所下降,而后呈逐渐上升趋势,第51d OD450达到2.128,与A、B两组相比差异极显着（P<0.01）。首次免疫后B组与C组家兔外周血CD4+T细胞减少;2次免疫后B组、C组仍然降低,
二、猪、犬旋毛虫成虫免疫原性试验（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪、犬旋毛虫成虫免疫原性试验（论文提纲范文）
（1）旋毛虫雌虫生殖力的影响因素及新生幼虫免疫保护作用评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 旋毛虫与旋毛虫病 |
| 1.2 旋毛虫体外培养研究进展 |
| 1.2.1 肌幼虫到成虫的培养 |
| 1.2.2 成虫到新生幼虫的体外培养 |
| 1.3 旋毛虫新生幼虫免疫研究进展 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物、虫种 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 旋毛虫肌幼虫的收集 |
| 2.2.2 旋毛虫成虫的收集 |
| 2.2.3 新生幼虫的收集与计数 |
| 2.2.4 成虫的体外培养 |
| 2.2.5 感染第7天的小鼠肠道内雌虫的分布 |
| 2.2.6 旋毛虫雌虫在小鼠肠道内的持续时间 |
| 2.2.7 旋毛虫雌虫生殖力的影响因素 |
| 2.2.8 新生幼虫感染力试验 |
| 2.2.9 新生幼虫诱导的小鼠免疫保护作用 |
| 2.2.10 实验数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 感染第七天小鼠肠道内旋毛虫雌虫的分布 |
| 3.2 旋毛虫雌虫在小鼠肠道内的持续时间 |
| 3.3 旋毛虫雌虫生殖力的影响因素 |
| 3.3.1 宿主感染后不同天数获得的旋毛虫雌虫的生殖力 |
| 3.3.2 培养液对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.3 温度对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.4 培养时间对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.5 不同培养密度对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.6 有无雄虫对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.7 雌虫寄生部位对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.8 宿主感染强度对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.9 宿主年龄对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.10 宿主性别对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.11 宿主身体状态对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.4 旋毛虫新生幼虫的感染力试验 |
| 3.5 旋毛虫新生幼虫诱导小鼠免疫保护作用试验 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（2）旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在旋毛虫入侵及免疫调节过程中功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 旋毛虫病与旋毛虫 |
| 1.1.1 旋毛虫病概述 |
| 1.1.2 旋毛虫生活史 |
| 1.1.3 旋毛虫入侵对宿主的影响 |
| 1.2 RNA干扰技术在寄生虫中的应用 |
| 1.2.1 常见的生物基因功能研究技术 |
| 1.2.2 RNA干扰技术的原理 |
| 1.2.3 RNA干扰在寄生虫中的作用方式和应用 |
| 1.3 旋毛虫与丝氨酸蛋白酶抑制剂 |
| 1.3.1 丝氨酸蛋白酶概述 |
| 1.3.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂概述 |
| 1.3.3 丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类及结构特点 |
| 1.3.4 寄生虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能 |
| 1.4 旋毛虫感染与免疫 |
| 1.4.1 寄生虫感染后宿主免疫策略 |
| 1.4.2 寄生虫感染与宿主T细胞 |
| 1.4.3 寄生虫感染与宿主巨噬细胞 |
| 1.4.4 寄生虫感染与宿主其他重要免疫细胞 |
| 1.4.5 寄生虫与免疫逃避 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 虫株与实验动物 |
| 2.1.2 主要菌株、细胞株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂的配置 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 主要应用软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 TsSPI基因siRNA设计与合成 |
| 2.2.2 TsSPI基因dsRNA设计与合成 |
| 2.2.3 旋毛虫肌幼虫的收集与体外培养 |
| 2.2.4 siRNA/dsRNA导入旋毛虫肌幼虫 |
| 2.2.5 qPCR检测TsSPI基因转染水平变化 |
| 2.2.6 Western blot检测TsSPI蛋白表达水平 |
| 2.2.7 qPCR检测dsRNA干扰效果的时间效应 |
| 2.2.8 检测dsRNA干扰的基因特异性 |
| 2.2.9 检测TsSPI基因沉默后肌幼虫体外存活率以及入侵IECs能力 |
| 2.2.10 检测TsSPI基因沉默后旋毛虫在小鼠体内发育、繁殖、减虫率情况 |
| 2.2.11 qPCR检测TsSPI基因沉默在旋毛虫中的遗传情况 |
| 2.2.12 检测旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞细胞相关因子表达水平变化 |
| 2.2.13 检测TsSPI基因沉默的旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB磷酸化情况 |
| 2.2.14 CCK8 检测小鼠巨噬细胞raw264.7 增值活力 |
| 2.2.15 qPCR检测CAM相关因子基因表达量 |
| 2.2.16 Western blot检测巨噬细胞IRAK通路相关蛋白含量 |
| 2.2.17 qPCR检测AAM相关基因表达量 |
| 2.2.18 Western blot检测巨噬细胞JAK2/STAT3磷酸化水平 |
| 2.2.19 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 利用RNAI沉默TSSPI基因 |
| 3.1.1 siRNA的设计与dsRNA的构建结果 |
| 3.1.2 siRNA导入旋毛虫体内情况分析 |
| 3.1.3 不同浓度RNAi对 TsSPI转录水平的影响 |
| 3.1.4 不同RNAi对 TsSPI转录水平的影响 |
| 3.1.5 dsRNA-TsSPI干扰的时间效应 |
| 3.1.6 dsRNA-TsSPI干扰的特异性 |
| 3.2 TSSPI基因沉默对ML体外存活率与入侵肠上皮细胞影响 |
| 3.2.1 TsSPI基因沉默对ML体外存活率的影响 |
| 3.2.2 TsSPI基因沉默对肌幼虫体外入侵肠上皮细胞的影响 |
| 3.3 TSSPI基因沉默对ML入侵宿主肠道并发育的影响 |
| 3.4 TSSPI基因沉默的遗传性分析 |
| 3.5 TSSPI基因沉默对ML入侵后宿主免疫相关因子的影响 |
| 3.5.1 TsSPI基因沉默对旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞炎性细胞因子含量影响 |
| 3.5.2 TsSPI基因沉默对旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞效应因子含量的影响 |
| 3.5.3 TsSPI基因沉默对旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB磷酸化水平的影响 |
| 3.6 重组蛋白TSSPI对小鼠巨噬细胞极化的影响 |
| 3.6.1 重组蛋白的表达纯化及复性 |
| 3.6.2 重组蛋白对小鼠巨噬细胞raw264.7增值活力的影响 |
| 3.6.3 重组蛋白对CAM相关因子基因表达水平影响 |
| 3.6.4 重组蛋白对巨噬细胞NF-κB通路相关蛋白的影响 |
| 3.6.5 重组蛋白对AAM相关因子基因表达水平影响 |
| 3.6.6 重组蛋白对巨噬细胞JAK2/STAT3 通路相关蛋白的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RNA干扰对旋毛虫TsSPI基因表达的影响 |
| 4.2 旋毛虫TSSPI基因沉默在旋毛虫入侵宿主过程中的功能研究 |
| 4.3 旋毛虫TSSPI基因沉默在旋毛虫入侵过程中免疫调节功能的研究 |
| 4.4 重组蛋白TSSPI调节巨噬细胞极化的研究 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）旋毛虫烯醇酶激活宿主纤溶系统促进幼虫侵入肠黏膜机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词(Abbreviations) |
| 前言 |
| 第一部分 旋毛虫烯醇酶的分子生物学特征及其与纤溶酶原的相互作用机制研究 |
| 1 方法 |
| 1.1 TsENO序列信息的获取 |
| 1.2 TsENO的理化性质分析 |
| 1.3 TsENO的疏水性分析 |
| 1.4 TsENO的亚细胞定位分析 |
| 1.5 TsENO的跨膜区分析 |
| 1.6 TsENO的信号肽预测 |
| 1.7 Ts ENO的模体(MOTIF)分析 |
| 1.8 TsENO的结构域分析 |
| 1.9 TsENO的序列保守性分析及进化树构建 |
| 1.10 TsENO的抗原位点预测 |
| 1.11 TsENO的二级结构分析 |
| 1.12 TsENO蛋白结合位点的预测 |
| 1.13 Ts ENO3D分子模型的构建及模型质量评估 |
| 1.14 Ts ENO与 PDB库中已知寄生虫烯醇酶晶体的三维结构比对 |
| 1.15 小鼠PLG与人PLG分子结构的比对与相似性分析 |
| 1.16 Ts ENO与人PLG的分子对接 |
| 1.17 Ts ENO与 PLG的相互作用分析及关键氨基酸位点的确定 |
| 1.18 PLG活性决定位点(Trp761)与Ts ENO的相互作用分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TsENO的序列信息 |
| 2.2 TsENO的理化性质 |
| 2.3 TsENO的疏水性分析结果 |
| 2.4 TsENO的亚细胞定位分析结果 |
| 2.5 跨膜区分析 |
| 2.6 信号肽预测 |
| 2.7 Ts ENO的模体(MOTIF)分析 |
| 2.8 TsENO的结构域分析 |
| 2.9 TsENO的序列保守性分析及进化树构建 |
| 2.10 TsENO抗原位点及空间结构预测 |
| 2.11 TsENO的二级结构分析: |
| 2.12 TsENO蛋白结合位点的预测 |
| 2.13 Ts ENO3D分子模型的构建及模型质量评估 |
| 2.14 Ts ENO与 PDB库中已知寄生虫烯醇酶晶体的三维结构比对 |
| 2.15 小鼠PLG与人PLG分子结构的比对与相似性分析 |
| 2.16 Ts ENO与人PLG的分子对接 |
| 2.17 Ts ENO与 PLG的相互作用分析及关键氨基酸位点的确定 |
| 2.18 PLG的关键氨基酸(Trp761)与Ts ENO的相互作用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 TsENO与 PLG相互作用的验证及Ts ENO在旋毛虫侵入时的作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.4 旋毛虫种株、实验动物、表达质粒、菌株及细胞 |
| 1.5 旋毛虫各期虫体的收集与抗原制备 |
| 1.6 TsENO与 M-TsENO的重组表达、纯化与复性 |
| 1.7 rTsENO的酶活性分析 |
| 1.8 Real-time PCR检测Ts-eno的转录水平 |
| 1.9 IFA检测Ts ENO在虫体表面的表达 |
| 1.10 石蜡切片IFA检测TsENO在虫体内部的组织定位 |
| 1.11 Far-Western blot检测rTsENO与 PLG的结合 |
| 1.12 ELISA检测rTsENO与 PLG的结合 |
| 1.13 IFA检测TsENO与小肠上皮组织的特异性结合 |
| 1.14 赖氨酸类似物(?-ACA)竞争性结合试验 |
| 1.15 纤溶酶原激活试验 |
| 1.16 rTsENO及其免疫血清对旋毛虫幼虫侵入肠上皮细胞影响 |
| 1.17 干扰TsENO的表达对IIL侵入IECs的阻断作用 |
| 1.18 rTsENO的免疫保护作用 |
| 1.19 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TsENO与 M-TsENO的重组表达、纯化与复性 |
| 2.2 rTsENO与 M-rTsENO的酶活性分析 |
| 2.3 Real-time PCR检测Ts-eno在旋毛虫不同发育期的转录水平 |
| 2.4 TsENO在旋毛虫不同发育阶段虫体表面的表达情况 |
| 2.5 TsENO在旋毛虫不同发育阶段虫体的表达与定位 |
| 2.6 Far-Western blot检测rTsENO与 PLG的结合 |
| 2.7 ELISA检测rTsENO与 PLG的结合 |
| 2.8 IFA检测rTsENO与小肠黏膜组织的特异性结合 |
| 2.9 赖氨酸类似物(?-ACA)竞争性结合试验 |
| 2.10 纤溶酶原激活试验 |
| 2.11 rTsENO及其免疫血清对旋毛虫幼虫侵入肠上皮细胞影响 |
| 2.12 抑制TsENO的表达对IIL侵入IECs的阻断作用 |
| 2.13 rTsENO的免疫保护作用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 烯醇酶在寄生虫侵入宿主中的作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（4）旋毛虫三种半胱氨酸蛋白酶抑制因子的功能研究及重组酶聚合酶扩增检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 abstract 第一章 引言 |
| 1.1 旋毛虫及旋毛虫病概述 |
| 1.2 寄生性线虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子的研究进展 |
| 1.2.1 半胱氨酸蛋白酶抑制因子的类型及结构特征 |
| 1.2.2 寄生性线虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子 |
| 1.2.3 寄生性线虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子的作用机制 |
| 1.2.4 旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子 |
| 1.3 旋毛虫的诊断方法 |
| 1.4 总结与展望 |
| 1.5 研究目的与意义 第二章 旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子蛋白功能研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 虫种、实验动物、质粒、菌株及细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 旋毛虫各期虫体的收集 |
| 2.1.4 旋毛虫各期虫体总RNA的提取及反转录 |
| 2.1.5 qRT-PCR |
| 2.1.6 原核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.1.7 重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.1.8 兔抗TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2 重组蛋白高免血清的制备和鉴定 |
| 2.1.9 免疫定位 |
| 2.1.10 酶活抑制试验 |
| 2.1.11 旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的准备 |
| 2.1.12 RAW264.7细胞的培养 |
| 2.1.13 CCK-8检测 |
| 2.1.14 总NO检测 |
| 2.1.15 ELISA检测细胞培养上清中的细胞因子 |
| 2.1.16 重组蛋白免疫保护性试验 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2的PCR扩增结果 |
| 2.2.2 旋毛虫TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2 的时期表达差异 |
| 2.2.3 原核表达重组质粒酶切鉴定结果 |
| 2.2.4 重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.2.5 兔抗TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2 重组蛋白高免血清的鉴定 |
| 2.2.6 TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2 在旋毛虫肌幼虫中的分布 |
| 2.2.7 rTsStefin、rTsCystatin1和rTsCystatin2 重组蛋白抑制活性分析 |
| 2.2.8 TsCystatins对IFN-γ激活的RAW264.7 细胞的增殖没有影响 |
| 2.2.9 TsCystatins抑制IFN-γ激活的RAW264.7 细胞产生NO |
| 2.2.10 TsCystatins对 RAW264.7 细胞产生细胞因子的影响 |
| 2.2.11 重组蛋白免疫保护性分析 |
| 2.3 讨论 第三章 表达异源半胱氨酸蛋白酶抑制因子弓形虫弱毒株的构建 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验动物、质粒、虫株及细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要溶液的配置 |
| 3.1.4 异源表达载体的构建 |
| 3.1.5 抗性及异源表达序列的扩增 |
| 3.1.6 CRISPR-Cas9质粒的提取 |
| 3.1.7 转基因弓形虫的构建 |
| 3.1.8 转基因弓形虫的PCR鉴定 |
| 3.1.9 转基因弓形虫的间接免疫荧光的鉴定 |
| 3.1.10 转基因弓形虫的Western blot的鉴定 |
| 3.1.11 其他弓形虫启动子表达旋毛虫的Stefin及 Cystatin |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 GRA1启动子和GRA2终止子的扩增 |
| 3.2.2 对Stefin、Cystatin1和Cystatin2 添加3×HA |
| 3.2.3 构建异源表达载体序列 |
| 3.2.4 构建异源表达载体筛选载体 |
| 3.2.5 异源表达及筛选序列的扩增 |
| 3.2.6 无内毒素CRISPR-Cas9质粒的大量提取 |
| 3.2.7 转基因弓形虫的单克隆筛选 |
| 3.2.8 转基因弓形虫PCR验证 |
| 3.2.9 转基因弓形虫的间接免疫荧光检测 |
| 3.2.10 转基因弓形虫的Western blot检测 |
| 3.2.11 其他弓形虫启动子表达旋毛虫Stefin及 Cystatin |
| 3.3 讨论 第四章 RHΔGRA17::TsCystatin2 的生物学特性及免疫保护性研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验动物及虫株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要试剂的配置 |
| 4.1.4 弓形虫裂解抗原的制备 |
| 4.1.5 噬斑试验 |
| 4.1.6 入侵试验 |
| 4.1.7 复制试验 |
| 4.1.8 小鼠免疫试验 |
| 4.1.9 血清中IgG抗体及IgG1、IgG2a抗体亚类的检测 |
| 4.1.10 脾细胞制备 |
| 4.1.11 细胞因子的检测 |
| 4.2 结果和分析 |
| 4.2.1 噬斑试验 |
| 4.2.2 入侵试验 |
| 4.2.3 胞内增殖试验 |
| 4.2.4 转基因株的免疫原性 |
| 4.2.5 转基因株引起的抗旋毛虫免疫反应 |
| 4.2.6 旋毛虫减虫率 |
| 4.3 讨论 第五章 旋毛虫重组酶聚合酶扩增检测方法的建立 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 组织DNA提取 |
| 5.1.4 引物和探针的设计 |
| 5.1.5 RPA琼脂糖凝胶检测方法的建立 |
| 5.1.6 LF-RPA检测方法的建立 |
| 5.1.7 传统PCR检测方法的建立 |
| 5.1.8 LF-RPA反应条件的探索 |
| 5.1.9 LF-RPA特异性及灵敏度 |
| 5.1.10 旋毛虫肌幼虫的收集 |
| 5.1.11 LF-RPA检测人工感染样品 |
| 5.1.12 肌肉与虫体混合试验 |
| 5.1.13 抑制试验 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 LF-RPA的反应条件 |
| 5.2.2 特异性分析 |
| 5.2.3 灵敏度分析 |
| 5.2.4 抑制试验 |
| 5.2.5 人工感染样品的检测 |
| 5.3 讨论 第六章 全文结论 参考文献 致谢 作者简介 |
（5）旋毛虫丝氨酸蛋白酶的表达与鉴定及用于免疫诊断的研究（论文提纲范文）
| 摘要 abstract 英文缩略词(Abbreviations) 第一部分 旋毛虫成虫排泄分泌抗原的血清学诊断 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂的配方 |
| 1.4 寄生虫和实验动物 |
| 1.5 血清样本的收集和制备 |
| 1.6 旋毛虫肌幼虫,肠道感染性幼虫和成虫的收集 |
| 1.7 ELISA法检测旋毛虫感染血清 |
| 1.8 SDS-PAGE蛋白分析和Western-blot鉴定 |
| 1.9 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 检测成虫ES和可溶最佳包被条件及Cut-off值 |
| 2.2 成虫ES和成虫可溶检测感染不同旋毛虫虫种小鼠感染血清 |
| 2.3 成虫ES和成虫可溶检测不同寄生虫感染小鼠血清抗体结果 |
| 2.4 成虫ES和成虫可溶检测旋毛虫感染不同剂量不同天数小鼠血清抗体结果 |
| 2.5 检测旋毛虫和其他寄生虫染的病人血清中抗旋毛虫抗体水平 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 第二部分 旋毛虫丝氨酸蛋白酶(TsSP)的克隆表达及功能鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要实验试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂配方 |
| 1.4 旋毛虫种、实验动物、菌体 |
| 1.5 在线预测TsSP蛋白的理化性质 |
| 1.6 TsSP序列比对及进化树的构建 |
| 1.7 设计TsSP的 PCR扩增引物 |
| 1.8 收集旋毛虫不同虫期的虫体 |
| 1.9 旋毛虫不同虫期总RNA的提取 |
| 1.10 RNA反转录制备各个虫期cDNA |
| 1.11 内参基因(GAPDH)检测cDNA质量 |
| 1.12 TsSP目的基因扩增 |
| 1.13 TsSP基因与克隆载体pGEM-T |
| 1.14 制备BL21感受态 |
| 1.15 重组质粒转化入感受态中 |
| 1.16 重组菌落PCR鉴定 |
| 1.17 质粒提取步骤 |
| 1.18 重组质粒pGEM-TsSP的双酶切和测序鉴定 |
| 1.19 目的基因TsSP与表达载体的连接 |
| 1.20 菌种冻存 |
| 1.21 重组菌的诱导表达及可溶性分析 |
| 1.22 rTsSP蛋白的亲和纯化 |
| 1.23 rTsSP免疫血清的制备及效价的测定 |
| 1.24 Western-blot检测rTsSP的抗原性和免疫原性 |
| 1.25 旋毛虫TsSP基因在各个虫期核酸水平的表达 |
| 1.29 旋毛虫TsSP蛋白在各个虫期的表达及定量 |
| 1.30 检测TsSP在旋毛虫各个虫体的表达和定位 |
| 1.31 ADCC-抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用[9-11] |
| 1.32 体外侵入实验 |
| 1.33 rTsSP与肠上皮细胞的特异性结合作用 |
| 1.34 rTsSP免疫保护 |
| 1.35 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TsSP生物信息学分析 |
| 2.2 旋毛虫TsSP基因引物设计 |
| 2.3 扩增TsSP基因 |
| 2.4 重组质粒PGEM-T-TSsp的测序及序列分析 |
| 2.5 重组表达载体的PCR鉴定及双酶切鉴定 |
| 2.6 重组质粒pQE80L-TsSP诱导表达及可溶性分析 |
| 2.7 rTsSP的亲和纯化 |
| 2.8 ELISA检测rTsSP免疫血清的效价 |
| 2.9 Western-blot分析rTsSP重组蛋白的抗原性 |
| 2.10 旋毛虫TsSP基因转录水平的表达 |
| 2.11 TsSP蛋白在旋毛虫不同发育虫期蛋白表达水平的鉴定 |
| 2.12 IFA检测TsSP蛋白在旋毛虫不同虫期虫体表面的表达及定位 |
| 2.13 IFA检测TsSP在旋毛虫不同发育期虫体内部的表达 |
| 2.14 抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC) |
| 2.15 体外侵入 |
| 2.16 rTsSP与 IEC的结合作用 |
| 2.17 rTsSP诱导免疫类型的鉴定 |
| 2.18 rTsSP的免疫保护作用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 第三部分 rTsSP在旋毛虫病早期诊断及免疫保护中的应用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试剂和仪器 |
| 1.2 蛋白的制备 |
| 1.3 不同感染血清的制备 |
| 1.4 Western-blot检测 |
| 1.5 ELISA检测 |
| 1.6 滴鼻免疫实验方案 |
| 1.7 ELISA检测抗体反应 |
| 1.8 肠道冲洗液中sIgA的检 |
| 1.9 免疫荧光分析肠道分泌IgA细胞的数量 |
| 1.10 肠道杯状细胞及粘蛋白的鉴定 |
| 1.11 细胞因子检测 |
| 1.12 旋毛虫攻击感染小鼠及免疫保护评估 |
| 1.13 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Western-blot检测rTsSP对早期旋毛虫感染血清的识别 |
| 2.2 Western-blot分析对rTsSP的敏感性 |
| 2.3 rTsSP-ELISA检测其他旋毛虫种属感染小鼠血清结果 |
| 2.4 rTsSP-ELISA检测其他寄生虫感染小鼠血清结果 |
| 2.5 rTsSP-ELISA检测旋毛虫感染不同剂量不同时间的小鼠血清 |
| 2.6 rTsSP-ELISA检测旋毛虫感染猪血清 |
| 2.7 rTsSP检测旋毛虫和其他寄生虫感染的病人血清 |
| 2.8 rTsSP滴鼻免疫所引起的体液免疫应答 |
| 2.9 肠道粘膜sIgA应答 |
| 2.10 IFA检测旋毛虫天然TsSP在不同期的表达 |
| 2.11 肠道杯状细胞及粘蛋白的检测 |
| 2.12 小肠分泌IgA细胞的荧光鉴定 |
| 2.13 rTsSP滴鼻免疫后细胞因子的变化 |
| 2.14 rTsSP滴鼻免疫后所产生的免疫保护作用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 全文结论 综述 寄生虫丝氨酸蛋白酶功能与旋毛虫病免疫保护的研究 |
| 1 丝氨酸蛋白酶和酶的作用机制 |
| 2 寄生线虫的丝氨酸蛋白酶 |
| 2.1 鞭虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.2 简单异尖线虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.3 猪蛔虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.4 丝虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.5 犬钩虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.6 小卷蛾斯氏线虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.7 绦虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.8 吸虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.9 旋毛虫丝氨酸蛋白酶 |
| 3 旋毛虫病的免疫生物学 |
| 4 抗旋毛虫感染疫苗的发展 |
| 4.1 虫体提取物和分泌物诱导的保护免疫 |
| 4.2 用于诱导保护预防旋毛虫的免疫途径和佐剂 |
| 4.3 重组蛋白和亚型表位所诱导的抗旋毛虫的保护应答 |
| 4.4 抗旋毛虫的DNA疫苗 |
| 4.5 旋毛虫疫苗的远景 |
| 5 结论 |
| 参考文献 个人简历及博士期间发表论文 |
| 1 个人基本信息 |
| 2 教育背景 |
| 3 发表论文情况 |
| 4 获奖荣誉 |
| 5 参加国际会议 致谢 |
（6）旋毛虫不同发育时期抗原基因的克隆表达与诊断特性研究（论文提纲范文）
| 缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 研究内容 |
| 4 技术路线 |
| 第一部分 旋毛虫四个抗原基因编码蛋白的生物信息学分析 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 不同发育时期抗原基因的克隆表达与蛋白纯化 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 基因重组蛋白对鼠血清中旋毛虫特异性抗体的动态观察 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四部分 基因重组蛋白对人旋毛虫病诊断效果的鉴定 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 研究总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件 |
（7）旋毛虫P53ES基因重组蛋白单克隆抗体的制备和鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 旋毛虫及旋毛虫病 |
| 1.2 旋毛虫病的流行状况 |
| 1.3 旋毛虫诊断方法的研究进展 |
| 1.3.1 病原学诊断 |
| 1.3.2 免疫学诊断 |
| 1.4 旋毛虫诊断抗原的研究进展 |
| 1.4.1 虫体抗原 |
| 1.4.2 表面抗原 |
| 1.4.3 杆细胞颗粒相关抗原 |
| 1.4.4 排泄-分泌抗原(ES 抗原) |
| 1.4.5 旋毛虫重组抗原 |
| 1.5 旋毛虫单克隆抗体的研究 |
| 1.6 本课题研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 实验动物和细胞 |
| 2.1.3 旋毛虫虫种 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要溶液的配制 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 P53 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.2 ES 抗原制备方法 |
| 2.2.3 旋毛虫阴性及阳性血清的制备 |
| 2.2.4 动物的免疫 |
| 2.2.5 间接ELISA 检测方法的建立 |
| 2.2.6 单克隆抗体的制备 |
| 2.2.7 单克隆抗体及杂交瘤细胞的特性鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 P53 重组蛋白的表达与纯化 |
| 3.1.1 P53 重组蛋白的SDS-PAGE 分析 |
| 3.1.2 纯化后P53 重组蛋白浓度的测定 |
| 3.1.3 重组蛋白的Western-blot 分析 |
| 3.2 细胞融合与筛选 |
| 3.2.1 ELISA 筛选方法的建立 |
| 3.2.2 细胞融合率的计算 |
| 3.2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选与建立 |
| 3.3 杂交瘤细胞的鉴定 |
| 3.3.1 杂交瘤细胞的染色体分析 |
| 3.3.2 杂交瘤分泌抗体稳定性鉴定 |
| 3.4 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.4.1 杂交瘤细胞培养上清液效价的测定 |
| 3.4.2 腹水单抗效价测定 |
| 3.4.3 抗体亚类鉴定结果 |
| 3.4.4 Western-blot 鉴定 |
| 3.4.5 单克隆抗体交叉反应 |
| 3.4.6 间接免疫荧光试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫原的选择 |
| 4.2 细胞的融合和克隆 |
| 4.3 单克隆抗体的特异性 |
| 4.4 间接免疫荧光试验 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）伪旋毛虫肌幼虫WR29抗原基因的克隆、表达及鉴定（论文提纲范文）
| 内容提要 英文缩写词表 前言 第一篇 文献综述旋毛虫分子生物学研究进展 |
| 1 旋毛虫种属分类的研究进展 |
| 1.1 分类现状 |
| 1.2 我国旋毛虫属的分类 |
| 2 旋毛虫分类的分子生物学技术研究进展 |
| 2.1 简单重复序列锚定PCR |
| 2.2 限制性酶切片段长度多态性及核酸探针技术 |
| 2.3 随机扩增多态性DNA |
| 2.4 PCR- 单链构象多态性分析 |
| 2.5 多重PCR ( multiplex PCR) |
| 2.6 DNA 序列分析及分子系统发生研究 |
| 3 旋毛虫抗原的研究 |
| 3.1 旋毛虫表面抗原 |
| 3.2 虫体抗原 |
| 3.3 杆细胞颗粒相关抗原 |
| 3.4 旋毛虫排泄/分泌(Excretory-Secretory，ES)抗原 |
| 3.5 旋毛虫重组抗原 |
| 4 旋毛虫病的检测方法 |
| 4.1 检测病原 |
| 4.2 免疫学诊断 |
| 4.2.1 皮内试验 |
| 4.2.2 补体结合试验(CF) |
| 4.2.3 凝集试验 |
| 4.2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 4.2.5 免疫酶染色试验(IEST) |
| 4.2.6 增强化学发光酶免疫染色试验(ECIA) |
| 4.2.7 循环抗原的检测 |
| 4.2.8 聚醛化聚苯乙烯( PAPS)免疫微球快速诊断法 |
| 4.2.9 免疫聚合酶链反应法( Immuno-PCR) |
| 4.3 Western 印迹技术 |
| 4.4 聚合酶链式反应(PCR)检测技术 第二篇 研究内容 |
| 第一章 伪旋毛虫肌幼虫WR29 抗原基因的序列分析及克隆 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 分析 |
| 1.2.2 pBluescript-WR29 目的片段PCR 扩增 |
| 1.2.3 pMD -WR29 克隆载体的构建 |
| 1.2.4 重组质粒pMD18T-WR29 的序列鉴定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 伪旋毛虫肌幼虫WR29 抗原基因重组表达载体的构建及高效表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 重组质粒pET-WR29 的构建 |
| 2.2.2 重组质粒的测序鉴定 |
| 2.2.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.2.4 重组蛋白的表达量测定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 伪旋毛虫肌幼虫WR29 抗原基因重组蛋白的鉴定及在不同发育时期的表达分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 兔抗WR29 重组蛋白抗血清的制备 |
| 3.1.4 Western blotting 检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 包涵体的纯化 |
| 3.2.2 血清效价的测定 |
| 3.2.3 Western blotting 检测结果 |
| 3.2.4 各组样品总RNA 纯度及完整性分析 |
| 3.2.5 WR29mRNA 检测情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 结论 参考文献 致谢 导师及作者简介 中文摘要 ABSTRACT |
（9）旋毛虫、伪旋毛虫肌幼虫cDNA文库的构建及其免疫学筛选（论文提纲范文）
| 提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 旋毛虫分子生物学研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 旋毛虫肌幼虫cDNA 文库的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 伪旋毛虫肌幼虫cDNA 文库的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 旋毛虫肌幼虫cDNA 文库的免疫学筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 伪旋毛虫肌幼虫cDNA 文库的免疫学筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| CURRICULUM VITAE |
| Personal Date of Master Candidate |
（10）旋毛虫49ku ES抗原基因核酸疫苗构建及免疫保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 旋毛虫与旋毛虫病 |
| 1.1.1 病原分类与形态 |
| 1.1.2 生活史 |
| 1.1.3 流行病学 |
| 1.1.4 致病作用和病理变化 |
| 1.1.5 临床症状 |
| 1.1.6 诊断 |
| 1.1.7 治疗 |
| 1.1.8 预防 |
| 1.2 旋毛虫ES 抗原的研究进展 |
| 1.2.1 ES 抗原的分泌与成分组成 |
| 1.2.2 ES 抗原中的糖基 |
| 1.2.3 ES 抗原的酶活性 |
| 1.2.4 ES 抗原与营养细胞的形成 |
| 1.2.5 成虫的ES 抗原 |
| 1.2.6 ES 抗原的功能 |
| 1.2.7 基因重组ES 抗原 |
| 1.3 旋毛虫疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 减毒活疫苗 |
| 1.3.2 天然抗原疫苗 |
| 1.3.3 合成肽疫苗 |
| 1.3.4 重组抗原疫苗 |
| 1.3.5 核酸疫苗 |
| 1.3.6 影响免疫效果的因素 |
| 1.3.7 对不同隔离种旋毛虫感染的免疫保护效果 |
| 1.3.8 小结 |
| 1.4 核酸疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 核酸疫苗的结构与分类 |
| 1.4.2 核酸疫苗的免疫机理 |
| 1.4.3 核酸疫苗的特点 |
| 1.4.4 核酸疫苗的接种方法和途径 |
| 1.4.5 影响核酸疫苗免疫效果的主要因素 |
| 1.4.6 核酸免疫的新进展 |
| 1.4.7 核酸疫苗研究需要解决的几个问题 |
| 1.4.8 核酸疫苗的应用前景与展望 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 各隔离种旋毛虫 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 质粒与菌种 |
| 2.1.5 主要试剂及药品 |
| 2.1.6 主要实验仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 旋毛虫成囊前期幼虫（pre-encysted larvae EL）的收集 |
| 2.2.2 旋毛虫肌幼虫（musle larvae ML）的收集 |
| 2.2.3 旋毛虫成虫(adult worms AW)的收集 |
| 2.2.4 旋毛虫总RNA 的提取 |
| 2.2.5 RNA 的反转录和P49 基因的扩增 |
| 2.2.6 目的基因的分子克隆和鉴定 |
| 2.2.7 重组真核表达载体pcDNA-P49 的构建 |
| 2.2.8 核酸疫苗的免疫保护效果 |
| 3 结果 |
| 3.1 旋毛虫不同发育时期虫体收集 |
| 3.2 旋毛虫不同隔离种成囊前期幼虫49KU ES 抗原基因的克隆与序列分析 |
| 3.2.1 猪旋毛虫成囊前期幼虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定 |
| 3.2.2 犬旋毛虫成囊前期幼虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定 |
| 3.2.3 猫旋毛虫成囊前期幼虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定 |
| 3.2.4 美国猪旋毛虫成囊前期幼虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定 |
| 3.2.5 旋毛形线虫成囊前期幼虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定 |
| 3.2.6 本地毛形线虫成囊前期幼虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定 |
| 3.2.7 旋毛虫不同隔离种成囊前期幼虫49ku ES 抗原基因的序列分析 |
| 3.3 猪旋毛虫不同发育时期虫体49KU ES 抗原基因的克隆与序列分析 |
| 3.3.1 猪旋毛虫成囊前期幼虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定 |
| 3.3.2 猪旋毛虫肌幼虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定 |
| 3.3.3 猪旋毛虫成虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定 |
| 3.3.4 猪旋毛虫不同发育时期虫体49ku ES 抗原基因的序列分析 |
| 3.4 重组真核表达载体PCDNA-P49 的构建 |
| 3.5 核酸疫苗的免疫效果 |
| 3.5.1 pcDNA3.1-P49-S/EL 免疫后的抗体检测 |
| 3.5.2 T 细胞亚类检测 |
| 3.5.3 pcDNA3.1-P49-S/EL 免疫对猪旋毛虫攻击感染的免疫保护作用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 旋毛虫不同隔离种与旋毛虫不同发育阶段虫体 |
| 4.2 旋毛虫不同隔离种成囊前期幼虫49KU ES 抗原基因的克隆与序列分析 |
| 4.3 猪旋毛虫不同发育时期虫体49KU ES 抗原基因的克隆与序列分析 |
| 4.4 重组真核表达载体PCDNA-P49 的构建 |
| 4.5 核酸疫苗的免疫保护作用 |
| 4.5.1 抗体的检测 |
| 4.5.2 T 细胞亚类检测 |
| 4.5.3 pcDNA3.1-P49-S/EL 免疫对猪旋毛虫攻击感染的免疫保护作用 |
| 4.6 本实验的创新 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
四、猪、犬旋毛虫成虫免疫原性试验（论文参考文献）
- [1]旋毛虫雌虫生殖力的影响因素及新生幼虫免疫保护作用评价[D]. 杨莹. 东北农业大学, 2021
- [2]旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在旋毛虫入侵及免疫调节过程中功能的研究[D]. 伊娜娜. 东北农业大学, 2020
- [3]旋毛虫烯醇酶激活宿主纤溶系统促进幼虫侵入肠黏膜机制的研究[D]. 姜鹏. 郑州大学, 2020(02)
- [4]旋毛虫三种半胱氨酸蛋白酶抑制因子的功能研究及重组酶聚合酶扩增检测方法的建立[D]. 李婷婷. 中国农业科学院, 2019
- [5]旋毛虫丝氨酸蛋白酶的表达与鉴定及用于免疫诊断的研究[D]. 孙阁阁. 郑州大学, 2019(07)
- [6]旋毛虫不同发育时期抗原基因的克隆表达与诊断特性研究[D]. 翟铖铖. 中国疾病预防控制中心, 2018
- [7]旋毛虫P53ES基因重组蛋白单克隆抗体的制备和鉴定[D]. 雷帅. 东北农业大学, 2009(02)
- [8]伪旋毛虫肌幼虫WR29抗原基因的克隆、表达及鉴定[D]. 李文辉. 吉林大学, 2008(07)
- [9]旋毛虫、伪旋毛虫肌幼虫cDNA文库的构建及其免疫学筛选[D]. 杨志东. 吉林大学, 2007(02)
- [10]旋毛虫49ku ES抗原基因核酸疫苗构建及免疫保护作用研究[D]. 路义鑫. 东北农业大学, 2006(02)