一、MAGE3-HLA-A2肽疫苗诱导胃癌患者自体CTL的研究（论文文献综述）
叶春梅[1]（2021）在《改造型TP53共享新抗原诱导抗肝癌作用的研究》文中研究表明目的近年来肿瘤新抗原作为免疫治疗的靶点备受关注,成为个体化免疫治疗的主力军。而共享新抗原因其在不同患者间通用,比个体化新抗原具有更广的适用性。本研究对TP53基因突变产生的共享新抗原进行氨基酸的替换修饰,探究改造后的共享新抗原是否能增强其免疫原性,从而更好地刺激和活化T细胞,进一步增强TP53共享新抗原的抗肿瘤作用,为肝癌患者以及存在相同突变的其他肿瘤患者提供更好的新抗原疫苗奠定基础。方法1.通过文献找出肝癌TP53基因热点突变,经抗原多肽预测算法获得共享新抗原,生物信息学软件预测共享新抗原的亲和力。选择亲和力较低的TP53-Y220C共享新抗原进行氨基酸残基改造。合成改造前TP53-Y220C新抗原和改造后TP53-Y220C（L2）新抗原,用T2细胞检测改造前、改造后新抗原的亲和力和稳定性。2.将合成的新抗原肽负载于树突状细胞（Dendritic cell,DC）中,并诱导细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic lymphocyte,CTL）。通过酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）的分泌,通过CFSE染色于流式细胞仪上检测CTL细胞的增殖,乳酸脱氢酶（Lactic dehydrogenase,LDH）释放法检测不同新抗原刺激的CTL对负载TP53-Y220C新抗原T2细胞的杀伤。3.将改造前、改造后TP53-Y220C新抗原刺激活化的CTL作为效应细胞,选取存在或不存在TP53-Y220C新抗原突变位点的肝癌细胞作为靶细胞。在体外,通过LDH释放试验检测不同新抗原刺激的CTL对肿瘤细胞的杀伤。在体内,将肝癌细胞接种至斑马鱼卵黄囊内,然后注射不同新抗原刺激活化的CTL,24h后观察CTL对肝癌细胞的生长抑制情况。4.LDH试验检测不同新抗原刺激的CTL对含有或未含有TP53-Y220C新抗原突变位点的胃癌细胞、胰腺癌细胞、食管癌细胞的杀伤。ELISA法、酶联免疫斑点实验（Enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT）检测靶细胞和效应细胞共培养后IFN-γ、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor,TNF-α）的释放情况。结果1.生物信息学软件预测结果显示,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原的亲和力有提升。体外亲和力检测结果显示,改造前TP53-Y220C新抗原的亲和力为3.10±0.35,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原的亲和力为3.61±0.31。稳定性检测结果显示,改造前TP53-Y220C新抗原的稳定性<18h,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原的稳定性>18h,两者在12h和18h的解离率有显着差异（P<0.01）。2.T细胞增殖试验和ELISA试验结果显示,与改造前TP53-Y220C新抗原相比,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原能刺激更多的T细胞增殖,分泌更多的IFN-γ。3.从交叉实验结果可见,改造前TP53-Y220C新抗原和改造后TP53-Y220C（L2）新抗原刺激的CTL均能识别提呈有TP53-Y220C新抗原的T2细胞。且与改造前相比,改造后新抗原刺激的CTL与T2细胞共培养后分泌更多的IFN-γ和TNF-α。4.肝癌体外杀伤结果提示,与改造前相比,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原刺激的CTL能杀伤更多的肝癌细胞Hu H7-HLA-A0201,且IFN-γ和TNF-α的分泌量更多。斑马鱼试验显示,与改造前相比,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原刺激的CTL能在24h内使斑马鱼体内的肝癌细胞荧光面积减少更多（P<0.01）。5.LDH释放试验结果显示,TP53-Y220C新抗原和TP53-Y220C（L2）新抗原刺激的CTL均能识别和杀伤存在TP53-Y220C突变位点的胃癌细胞、胰腺癌细胞、食管癌细胞,且TP53-Y220C（L2）新抗原刺激的CTL组分泌更多的IFN-γ和TNF-α。结论1.改造的TP53-Y220C（L2）新抗原比未改造的TP53-Y220C新抗原的亲和力有所增加,稳定性显着增加,并且具有更强的免疫原性,可以更好地刺激T细胞增殖。2.肝癌细胞的体外杀伤试验和斑马鱼体内试验证明,TP53-Y220C（L2）新抗原活化的CTL比TP53-Y220C新抗原活化的CTL对肝癌细胞具有更好的细胞毒性。3.TP53-Y220C（L2）新抗原和TP53-Y220C新抗原活化的CTL对存在TP53-Y220C突变新抗原的胃癌细胞、胰腺癌细胞、食管癌细胞均有杀伤,且改造新抗原刺激的CTL可诱导更强的杀伤活性。说明TP53-Y220C新抗原符合共享新抗原特性,亲和力和稳定性增强的TP53-Y220C（L2）新抗原有望作为多种肿瘤的DC疫苗或者多肽疫苗用于抗肿瘤免疫治疗。
胡峰[2]（2020）在《非小细胞肺癌中TIGIT在CD8+T细胞的表达及作用机制研究》文中研究表明在肿瘤微环境中肿瘤抗原的持续刺激下,CD8+T细胞会进入机能缺陷或衰竭状态,从而不能有效地阻止癌症的进展。肿瘤细胞表面上调的抑制性配体PD-L1与CD8+T细胞上PD-1的相互作用是介导T细胞衰竭的机制之一;阻断PD-1/PD-L1通路的药物在癌症患者中效果显着。然而,在大部分癌症类型中,只有小部分患者（20～30%）对anti-PD-1/PD-L1免疫治疗产生应答,非应答者一般经历体内T细胞功能短暂激活后疾病继续进展,这可能是因为阻断PD-1通路难以逆转表观遗传修饰上稳定的衰竭型T细胞的命运,提示还有其它机制与PD-1通路协同地调节T细胞衰竭。由于免疫检查点分子可以协同地介导免疫抑制和促进T细胞衰竭,所以需要找出与PD-1通路协同调节T细胞衰竭的免疫检查点分子并尝试通过联合用药（同时阻断不同的通路）来进一步增强效应细胞杀伤癌细胞的活性以改善肿瘤免疫治疗的疗效。TIGIT（具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体）,是对T细胞功能起负调控作用的免疫检查点分子之一,它过表达于多种癌症中,因此我们认为它可能是一个肿瘤免疫治疗的潜在靶点。在本课题研究中,我们研究了TIGIT在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者循环血和肿瘤微环境中CD8+T细胞的表达,及其对抗肿瘤免疫应答的调控。并进一步探究了anti-TIGIT+anti-PD-1联合用药对于肿瘤治疗的改善作用,以期为非小细胞肺癌的临床治疗提供一些借鉴性的理论依据。我们发现,NSCLC患者外周血中CD8+T细胞上的TIGIT以及TIGIT和PD-1的共表达水平均高于健康对照。在NSCLC患者的肿瘤中,TIGIT和PD-1均高表达于CD8+T细胞表面。这些结果表明,在NSCLC患者的肿瘤微环境中,TIGIT和PD-1信号通路可能共同通过调节CD8+T细胞来调控T细胞介导的抗肿瘤免疫。进一步研究证实,TIGIT缺陷（基因敲除或anti-TIGIT抗体治疗）可抑制小鼠肺肿瘤的进展。然后,我们利用LLC小鼠模型来研究TIGIT分子产生免疫抑制的机制:TIGIT随着CD8+T细胞向肿瘤浸润或扩增而上调,在第12天达到最高点后下降,并与PD-1共表达;通过对比野生型小鼠和TIGIT基因敲除小鼠的表型,我们发现TIGIT缺陷可显着提高肿瘤浸润的CD8+T细胞的数量和效应功能,并抑制T细胞衰竭的进程。在LLC小鼠肿瘤模型中,anti-TIGIT和anti-PD-1联合治疗相比于单药治疗可更显着地抑制肿瘤生长。我们对比分析发现,anti-TIGIT+anti-PD-1治疗的小鼠中肿瘤抗原特异性CD8+TIL浸润水平增加且具有更强的细胞因子分泌水平,同时显着下调肿瘤微环境中Treg细胞的功能表型。第一部分TIGIT在非小细胞肺癌患者中的表达目的:探究TIGIT在非小细胞肺癌患者外周血和肿瘤微环境中的表达情况,为后续研究奠定基础。方法:采用流式细胞分析术检测NSCLC患者外周血和肿瘤微环境中CD8+T细胞表面免疫检查点分子TIGIT的表达,并进一步明确PD-1在TIGIT+CD8+T细胞上的水平。利用免疫荧光染色确定TIGIT在NSCLC患者中表达的细胞类型。结果:NSCLC患者外周血中CD8+T细胞上的TIGIT以及TIGIT和PD-1的共表达水平均高于健康对照。患者肿瘤组织中,TIGIT高表达于CD8+T细胞表面,并且PD-1高表达于TIGIT+CD8+T细胞。结论:在NSCLC患者体内TIGIT和PD-1在CD8+T细胞上共同高表达,预示着TIGIT和PD-1信号通路可能共同调节CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。第二部分TIGIT抑制肺肿瘤免疫反应的机制研究目的:旨在探究TIGIT对肺肿瘤进展的影响,以及TIGIT通过调控CD8+T细胞功能进而影响肿瘤免疫的机制。方法:在TIGIT敲除小鼠和野生型小鼠上分别建立LLC皮下移植肺肿瘤模型,确定TIGIT在小鼠抗肿瘤免疫中的作用。采用流式分析术和免疫荧光染色确定TIGIT分子在肿瘤微环境中表达的细胞类型。同时在LLC小鼠模型中确定PD-1+TIGITCD8+T细胞的作用,以及TIGIT对CD8+T细胞功能的影响。结果:TIGIT缺失或阻断TIGIT对小鼠肺肿瘤生长具有抑制作用。进一步的流式分析表明PD-1+TIGIT-CD8+T细胞是肿瘤微环境中主要的活化细胞毒性淋巴细胞群。阻断TIGIT信号通路可以增强CD8+T细胞的活性。结论:TIGIT可能促进活化的CD8+T细胞向衰竭型T细胞转变,从而抑制肿瘤内CD8+T细胞的增殖和效应功能,使它们不能有效地清除机体内的肿瘤细胞,造成肿瘤进展。第三部分anti-TIGIT与anti-PD-1联合治疗的抑癌效果目的:探讨anti-TIGIT与anti-PD-1联合治疗对肺肿瘤的治疗效果,为肿瘤的抗体药物治疗提供新的思路。方法:在小鼠上建立LLC皮下移植肿瘤模型,然后分别用对照抗体,anti-PD-1,anti-TIGIT和anti-PD-1+anti-TIGIT治疗小鼠,观察肿瘤生长情况。采用流式细胞分析术检测LLC肿瘤模型中肿瘤微环境中浸润的CD8+T和调节性T细胞比例,并进一步探讨不同治疗组CD8+T细胞的功能差异和调节性T细胞的表型改变。结果:anti-TIGIT或anti-PD-1的单一用药可以显着抑制小鼠肺肿瘤生长,而anti-TIGIT和anti-PD-1联合治疗的作用较单一治疗更加明显。并且,anti-TIGIT与anti-PD-1联合治疗可以有效促进肿瘤组织中CD8+T细胞浸润,并且增加CD8+T细胞IFN-γ的分泌。另外,anti-TIGIT与anti-PD-1联合治疗可以降低调节性T细胞表面TIGIT的表达。结论:在LLC小鼠肿瘤模型中,anti-TIGIT和anti-PD-1联合治疗相比于单药治疗可更显着地抑制肿瘤生长。anti-TIGIT和anti-PD-1联合治疗可进一步提高CD8+T细胞的肿瘤浸润和效应功能,并且潜在抑制调节性T细胞的功能。因此,在临床应用中,anti-TIGIT和anti-PD-1联合用药有望进一步改善目前anti-PD-1免疫治疗的疗效。
李振华[3]（2020）在《5-氮杂-2’-脱氧胞苷（DAC）增强MAGE-A10抗原肽表达并改善MAGE-A10特异性CTL杀伤肺癌细胞的研究》文中认为肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率居癌症死亡的首位,据世界卫生组织统计,每年约有176万人死于肺癌。由于绝大多数的肺癌患者在临床确诊时多属进展期或难以治愈的Ⅲb期或Ⅳ期,因此失去了手术根治的机会。而近些年来,随着免疫治疗在临床上的逐渐应用,其显示出了一定的优势,并对部分肺癌患者的预后产生了改善,因此被推荐为晚期肺癌标准治疗方案之一。其中肿瘤特异性T细胞是目前具有良好发展前景的免疫细胞,因此发掘能被T淋巴细胞识别的靶抗原是治疗的关键。癌睾丸抗原（cancer testis antigen,CTA）家族是目前已知的肺癌组织中重要的肿瘤相关抗原。癌睾丸抗原家族的表达模式具有相当程度的特异性:该蛋白家族内的成员在多种癌症中均有表达,如肺癌、乳腺癌、黑色素瘤,对于正常组织而言,癌睾丸抗原仅在睾丸细胞中表达,偶尔也可以在胎盘组织中被检测到,且睾丸拥有免疫豁免能力,不会被免疫系统识别并杀伤。因此,癌睾丸抗原家族是肿瘤免疫治疗的理想标靶。黑色素瘤抗原基因（melanoma antigen gene,MAGE）属于CTA亚家族,是一种肿瘤相关性抗原,其具有免疫原性及表达限制性。据研究显示,人类的MAGE家族基因位于X染色体上,其编码的肿瘤排斥抗原（tumor rejection antigen;TRA）,经过细胞内的加工从而产生抗原肽,并与人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）结合形成复合物,被自体细胞毒性T淋巴细胞特异性识别,能诱导对肿瘤细胞具有特异性杀伤能力的细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）。MAGE家族的表达模式和CTA家族相同,在多种肿瘤细胞中均有表达,如乳腺癌、黑色素瘤、食管癌、结直肠癌,且在大多数正常组织中不表达。本研究认为,MAGE家族有极大的潜力作为CTL介导肿瘤特异性免疫治疗的预备标靶。对于MAGE家族的深入研究和理解有助于肺癌的分子生物学诊断和个体化分子靶向治疗。树突状细胞（dendritie cells,DC）是非单核吞噬细胞中的一种,是人体内已知的功能最强的抗原呈递细胞（Antigen-presenting cells,APC）,抗肿瘤免疫的产生依赖于DC细胞对肿瘤抗原的捕获与加工处理,随后将抗原信息呈递给淋巴组织内的未成熟T细胞并激活机体的特异性抗肿瘤免疫反应。具有肿瘤特异性的细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）具有杀伤能力强、增殖活性强等特点。本研究拟通过MAGE-A10抗原肽与DC细胞共同培养并诱导肿瘤特异性CTL细胞,以有效杀伤癌细胞株。有学者使用与MAGE家族基因序列相似的共同表位肽进行了类似研究,证明了这个短肽对于肿瘤细胞的诱导杀伤能力。抗肿瘤免疫治疗不仅受限于肿瘤细胞表面免疫原性强弱还受到肿瘤特异性抗原的表达量和表达率的限制。靶抗原在肿瘤细胞表面表达是以肽为基础免疫治疗的核心,提升靶抗原的表达量在一定程度上可改善肿瘤免疫治疗的效果。5-氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine or DAC）是一种特异性的甲基化抑制剂,可以降低甲基化水平,应用该药物可以使MAGE-A10表达量升高。因此,本研究采用DAC处理肺癌细胞株,以期望能诱导MAGE-A10的表达升高。目前在肺癌中,高表达的MAGE-A10与患者临床病理学参数及患者生存之间的关系尚无定论。且将MAGE-A10抗原肽及去甲基药物DAC免疫疗法用于肺癌的免疫治疗的研究尚未见报道。因此,本课题设计MAGE-A10抗原肽联合去甲基药物DAC肺癌的体外杀伤作用进行研究。通过免疫组织化学法检测肺癌组织中MAGE-A10在蛋白水平的表达情况,探讨MAGE-A10的表达与患者临床病理特征的关系,通过Kaplan-Meier Plotter在线公共数据库进行生存分析,验证MAGE-A10对肺癌患者预后的影响,在不同的肺癌原代细胞及细胞系中验证去甲基药物DAC是否可以诱导肺癌细胞表面MAGE-A10表达的增加,在去甲基化药物处理过的肺癌细胞系中验证MAGE-A10特异性CTL对去甲基化药物诱导的肺癌细胞的杀伤效果。第一部分MAGE-A10抗原在人肺癌组织的表达及临床意义目的:采用免疫组织化学法,研究MAGE-A10抗原在肺癌患者组织中的表达及其与临床病理参数的相关性,为MAGE-A10抗原肽参与肿瘤免疫治疗建立理论基础。方法:1.免疫组织化学法检测MAGE-A10抗原在正常肺组织中和肺癌组织中的表达。2.分析MAGE-A10抗原表达与患者临床病理参数的相关性。3.采用Kaplan-Meier生存分析法,分析肺癌患者MAGE-A10抗原阳性表达与患者5年总生存率情况。结果:1.免疫组织化学检测结果显示,MAGE-A10蛋白在正常肺组织中阳性表达率低,阳性表达4例,阴性表达26例,阳性表达率为13.3%,在肺癌组织中阳性表达率高,阳性表达198例,阴性表达218例,阳性表达率为47.6%,在肺癌细胞质和细胞核均有表达。2.统计结果显示,MAGE-A10蛋白的表达与肺癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤临床分期、没有相关性,（P>0.05）,与淋巴结转移（6.81,0.0090）、复发转移（4.64,0.0313）具有相关性（P<0.05）。3.MAGE-A10分子阳性表达的肺癌患者较阴性表达患者5年总生存率更低。Log Rank检验结果P=5.002e-10。结论:MAGE-A10抗原在肺癌组织呈阳性表达,正常肺组织少有表达,提示MAGE-A10抗原可以作为肺癌免疫治疗的靶抗原。MAGE-A10可能与肺癌患者的不良预后相关。第二部分MAGE-A10抗原在人肺癌细胞系和原代细胞的表达及MAGE-A10的生物信息学分析目的:研究MAGE-A10在人肺癌细胞系及原代细胞中的表达状况;使用生物信息学方法分析MAGE-A10表达与患者生存的关系。方法:1.通过q RT-PCR和Western blot技术检测人类肺癌细胞系A549和H1975及原代细胞L228、L419及L329细胞中MAGE-A10的表达。2.从Kaplan-Meier Plotter在线公共数据库（http://www.kmplot.com）获得1926例OS样本,344例FP样本,982例PPS样本,并进行生存分析。结果:1.在肺癌细胞系中,A549细胞中的MAGE-A10 m RNA呈低水平表达,而在H1975细胞中呈高水平表达;在肺癌原代细胞中,L329细胞中的MAGE-A10 m RNA呈低水平表达,而在L228及L419细胞中呈高水平表达。2.基于开放的公共数据库Kaplan-Meier Plotter的分析结果显示,高表达MAGE-A10的肺癌患者其总生存期、进展后生存期及首次进展时间均短于MAGE-A10低表达的患者（P<0.05）。结论:1.H1975、L228及L419细胞中MAGE-A10 m RNA呈高水平表达,A549细胞及L329细胞呈低表达水平。2.MAGE-A10高表达的肺癌患者其总生存期、进展后生存期及首次进展时间均短于MAGE-A10低表达的患者。第三部分去甲基化药物对MAGE-A10特异性CTL杀伤活性及对肺癌细胞杀伤效应影响的研究目的:研究去甲基化药物DAC对MAGE-A10特异性CTL杀伤活性及对肺癌细胞杀伤效应影响。方法:1.通过q RT-PCR和Western blot技术检测去甲基化药物DAC处理后肺癌细胞H1975、L228、L419、A549及L329细胞中MAGE-A10 m RNA和蛋白的表达。2.ELISA法检测MAGE-A10共同抗原特异性CTL与肺癌组织原代细胞混合培养上清中IFN-γ分泌水平。3.细胞毒性实验检测MAGE-A10特异性CTL对肺癌组织原代细胞杀伤效应的影响。结果:1.去甲基化药物DAC可诱导H1975细胞、L228细胞及L419细胞MAGE-A10表达量增加,且MAGE-A10蛋白表达量和m RNA量呈剂量依赖性。2.IFN-γ释放实验结果显示同时加入MAGE-A10抗原肽与DAC组IFN-γ分泌水平有显着升高,且效靶比越高,IFN-γ分泌水平越高（P<0.05）。3.细胞毒性实验结果显示,在同一效靶比下MAGE-A10抗原肽+DAC组杀伤效率最高。效靶比为40:1时杀伤效率最高。结论:1.去甲基化药物DAC可诱导H1975细胞、L228细胞及L419细胞MAGE-A10表达量增加。2.去甲基化药物DAC能够增强MAGE-A10共同抗原肽特异性CTL对H1975细胞、L228细胞及L419细胞的杀伤功能。
宋成程[4]（2017）在《基于结构修饰及内源佐剂策略的肿瘤糖疫苗的设计及活性研究》文中研究指明肿瘤的发生常伴随糖基化的改变。肿瘤相关糖抗原（Tumor-associated carbohydrate antigens,TACAs）广泛表达于多种肿瘤细胞,是治疗及预防肿瘤的优选靶标。但其容易被免疫系统识别为自身抗原,诱发免疫耐受。因此,本论文通过抗原结构修饰提高抗原的免疫原性及内源佐剂疫苗促进免疫应答两种策略,对结构修饰的TACA缀合物疫苗及构建的内源佐剂疫苗进行了抗肿瘤活性及免疫活性的研究。基于交叉反应的结构修饰策略是将天然糖抗原进行结构修饰,其诱导的抗体,不仅识别修饰的抗原,同时可以识别天然抗原,从而提高免疫原性,打破免疫耐受。因此本论文第一部分研究了结构修饰的TACAs的免疫活性及抗肿瘤活性。佐剂具有促进肿瘤疫苗提高免疫原性、打破自身对肿瘤细胞的免疫耐受的特征。将抗原与佐剂两部分共价偶联成为一个分子,能够提高抗原提呈细胞的利用率,避免高毒性佐剂的使用,同时能引起有效的免疫应答。合成内源佐剂疫苗是一种很好的提高抗肿瘤糖疫苗免疫应答的策略。因此,本文第二部分构建了几种内源佐剂疫苗并研究了其免疫活性。具体研究内容及结果如下:第一部分:通过还原胺化法将肿瘤相关糖抗原Tn及修饰的Tn抗原与载体蛋白白喉毒素突变体（Cross reactive material of diphtheria toxin,CRM197）共价偶联,在C34佐剂辅助下免疫健康小鼠。结果显示N-氟乙酰基修饰的Tn-CRM197（S6-CRM197）可以诱发机体产生更高的针对Tn的IgG抗体,且血清抗体能够更好的与肿瘤细胞结合;能促进小鼠脾细胞分泌Th1型细胞因子IFN-γ。在Tn上验证了氟修饰对于抗肿瘤糖疫苗的潜在应用价值,接下来我们研究了基于氟修饰的三种STn衍生物（Y2、Y3、Y4）与蛋白的缀合疫苗的抗肿瘤活性及机理。首先构建小鼠CT-26结肠癌肺转移模型,免疫糖蛋白缀合疫苗Y1-KLH（STn-KLH）、Y2-KLH、Y3-KLH、Y4-KLH。结果显示Y4-KLH在佐剂辅助下可以有效的抑制肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存期。抗肿瘤机制研究显示:Y4-KLH可以诱导强烈的抗STn的IgG抗体,能够识别STn抗原阳性的肿瘤细胞,并且可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒及补体依赖的细胞毒裂解STn抗原阳性的肿瘤细胞。Y4-KLH可以刺激抗原特异性T淋巴细胞分泌IFN-γ,促进细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocytes,CTL）的免疫应答。Y4-KLH产生混合的Th1/Th2型应答,并且比Y1-KLH更早的产生Th1型应答。免疫Y2-KLH能够诱发机体产生强烈的体液免疫应答及较弱的细胞免疫应答;免疫Y3-KLH能够诱导弱的细胞免疫应答但不能引起强的STn特异性抗体免疫应答。不加佐剂辅助或在构建的小鼠腋下荷瘤模型上,疫苗Y4-KLH都呈现一定程度的抗肿瘤效果。接下来选用CRM197作为载体蛋白,研究Y4-CRM197结合不同佐剂在健康小鼠上引发的免疫应答。结果显示在无佐剂辅助或C34佐剂辅助疫苗应答的情况下,用Y4-CRM197免疫健康小鼠可以提高机体的体液免疫应答。在弗氏佐剂存在的情况下,免疫Y4-CRM197能够提高机体的细胞和体液免疫应答。在小鼠结肠癌肺转移模型上,C34作为佐剂,疫苗Y4-CRM197与Y1-CRM197相比,虽然抗肿瘤效果没有明显差别,但疫苗Y4-CRM197能够提高脾淋巴细胞分泌IFN-γ的能力,提高Th1型免疫应答,同时促进体液免疫应答。第二部分:α-半乳糖神经酰胺（α-galactosylceramide,αGC）是NKT细胞的快速激活剂,MUC1是肿瘤相关的糖肽抗原。本文首次将αGC与MUC1共价偶联,进行免疫活性研究。结果显示αGC-MUC1可以活化DC及iNKT细胞,释放大量的IFN-γ及IL-4;提高CD4+T细胞的含量且提高CTL活性;活化B细胞,促进机体产生快速且强烈的抗原特异性的抗体应答,产生多种抗原特异性的IgG亚型,提高记忆B细胞及经历体细胞突变的记忆B细胞的含量。寡核苷酸CPG1826是Toll样受体9（Toll like receptor 9,TLR9）的激动剂,将MUC1与CPG1826共价偶联同样可以激活DC及iNKT细胞;促进CTL的活性及提高脾脏中CD4+T细胞的含量;可以促进机体产生快速且强烈的抗体应答;提高记忆B细胞及经历体细胞突变的记忆B细胞的含量。首次将αGC及CPG1826同时与MUC1共价偶联,免疫活性结果显示其可以激活DC及iNKT细胞,促进机体释放IFN-γ及IL-4。能够提高CTL的活性及提高脾脏中CD4+T细胞的含量,促进脾淋巴细胞释放细胞因子IFN-γ。可以促进机体产生快速的抗体应答,活化B细胞,提高记忆B细胞及经历体细胞突变的记忆B细胞的含量。综上所述,本文基于具有交叉反应的抗原修饰策略,在肿瘤模型上证明了氟修饰的STn作为候选抗肿瘤疫苗的应用价值,为抗肿瘤糖疫苗提供了候选分子,为氟修饰TACA作为候选抗肿瘤疫苗的应用奠定了基础;首次将αGC与肿瘤相关的糖肽抗原表位共价偶联,应用在抗肿瘤内源佐剂疫苗中;也首次将αGC及CPG1826同时与抗原表位共价偶联,为基于内源佐剂抗肿瘤疫苗策略的研究提供了新的思路。
金洪娟[5]（2011）在《MAGE-1短肽体外免疫效应的实验研究》文中指出目前对恶性肿瘤的治疗主要方法包括手术治疗、放射治疗和化学治疗。手术治疗仍是目前最常用于恶性肿瘤治疗的手段,对于许多早期局部发生的肿瘤有着良好的治疗效果。但是在弥漫性发生的恶性肿瘤（如白血病,晚期肿瘤广泛转移等）、重要器官浸润生长的恶性肿瘤、远处发生隐匿转移的恶性肿瘤则治疗效果较差甚至无法进行手术治疗。放射治疗和化学治疗对正常组织亦会有杀伤从而产生较大的副作用;肿瘤耐药性的产生对化学治疗的应用也有了较大的限制。总之,应用现有的治疗手段治疗恶性肿瘤不能令人满意。近年来,随着分子生物学、免疫学的发展,人们对恶性肿瘤的生物学行为有了更加深刻的认识。恶性肿瘤是一种基因相关疾病,恶性肿瘤细胞和正常组织细胞既有着相似性和同源性,又有异质性。与正常细胞相比较,肿瘤细胞无论在形态结构、生化组成或代谢功能等方面都发生了很大的改变,而在结构上发生改变的糖蛋白或糖脂分子可以成为肿瘤细胞的新抗原,即肿瘤抗原（tumor antigen）。其中有些抗原分子为某种肿瘤所特有,而在正常组织细胞中无表达,称为肿瘤特异性抗原（tumor specific antigen,TSA）。TSA可刺激机体的免疫系统产生针对该细胞的特异性的免疫反应过程。机体的抗肿瘤效应分为细胞免疫应答及体液免疫应答,而前者起主要作用,其效应细胞为T淋巴细胞,在抗原递呈细胞（APC）递呈的刺激下可诱导产生针对表达该抗原的肿瘤细胞特异性的细胞毒性反应,即CTL效应,同时对正常组织无损伤。APC将抗原加工递呈到细胞表面,与MHC分子形成抗原肽（9-14个aa）-MHC复合体递呈给T细胞,使之活化,发挥抗瘤效应。肿瘤免疫治疗正是利用了这些理论所采取的策略。黑色素瘤相关抗原（MAGE）最早在1991年被学者发现的,它是从人黑色素瘤细胞系（MZ2）分离出的抗原,可以被细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）所识别。而后的数年间,更多种新的MAGE基因被发现,共称为MAGE基因家族,该家族成员的共有特点:定位于X染色体;拥有开放阅读框（open reading frame,ORF）,该基因编码的蛋白质C末端含有约200个氨基酸残基的同源序列;在黑色素瘤及其他多种恶性肿瘤均有不同程度的表达,而在除外睾丸和胎盘以外的正常组织中无表达。因其高度的特异性,MAGE蛋白作为抗肿瘤免疫的靶抗原,为肿瘤的特异性免疫治疗提供新的方法和途径。许多学者应用MAGE作为肿瘤治疗的靶抗原进行了大量的研究工作,在相当一部分恶性肿瘤的实验治疗中取得了满意的效果。为增强肿瘤疫苗的免疫效果,不同的学者针对肿瘤疫苗免疫过程中的不同环节做了大量的研究工作。随着基因工程技术和免疫学的发展,人们已可以对抗原氨基酸序列进行分析研究,测定抗原表位,并精确地确定了决定免疫功能的特定序列。在肿瘤抗原改造方面,近期的研究主要集中在优势表位的筛选和组合。因为机体免疫系统产生的肿瘤免疫应答主要依靠细胞免疫,作为主要的效应细胞CD8+的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）因其能特异性的识别并直接杀死肿瘤细胞而受到更多的关注。因此,改善肿瘤疫苗的设计方案之一,就是在疫苗中包括这些能够诱导CTL效应的MHC II类分子限制的抗原表位。有进一步的实验发现,单一的抗原表位不能诱导T淋巴细胞产生出足够强度的杀伤效应,因此有人尝试在同一载体内负载多个抗原表位的方法,因此本文所选择的目的基因正是覆盖了三个个高亲和力的抗原表位进行实验,探讨其作为肿瘤免疫治疗的可行性。实验首先于体外合成该短肽片段（EADPTGHSY）,冲击树突状细胞后与淋巴细胞共混获得效应细胞,应用MTT法观察其对肿瘤细胞生长的抑制作用。以野生型癌株作为靶细胞,应用MTT法及LDH方法观察其对淋巴细胞增殖及CTL效应的影响。实验结果表明MAGE-1短肽致敏的树突状细胞可激活T淋巴细胞,产生抑瘤效应。为MAGE-1短肽疫苗的抗瘤研究奠定了基础。本研究进一步应用PCR技术从人基因组中得到DNA片段,构建重组表达MAGE121-169质粒载体,在原核表达体系中诱导表达。经Westren Blot杂交鉴定、镍凝胶亲和层析法纯化目的蛋白。3H掺入法检测目的短肽诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应。MTT法检测其对T细胞免疫活性的影响。结果显示MAGE-1127-169短肽在大肠杆菌中以包涵体形式表达。Western-blot检测收获的表达产物证实为所需的目的蛋白。与淋巴细胞共孵育后测得的淋巴细胞增殖指数明显增加。首选经该短肽致敏树突状细胞,与T细胞作用后,活化的T淋巴细胞可明显抑制肿瘤细胞的生长。结果提示本研究成功诱导了MAGE-1127-169短肽的原核表达,获得纯度较高的MAGE-1121-169短肽,掌握了该短肽的表达和纯化的最适条件,同时证明在一定浓度下目的短肽可于体外诱导小鼠的特异性淋巴细胞增殖,并产生有效的CTL效应。提示了存在多个抗原表位MAGE-1121-169短肽可更好的诱导淋巴细胞增殖,诱导产生CTL效应,具有良好的免疫原性,可作为肿瘤治疗的靶点。
王国珍[6]（2011）在《肝素酶CTL表位多抗原肽（MAP）疫苗的设计及其抗肿瘤免疫效应研究》文中提出[背景和目的]肿瘤生物治疗是继手术、放疗及化疗之后的第四种肿瘤治疗方式。而以树突状细胞（Dendritic cells, DCs）为基础的肿瘤免疫治疗是当今肿瘤生物治疗研究的热点。DC是目前发现的具有强大抗原提呈功能的免疫细胞,将肿瘤相关抗原（Tumor-asscociated antigen, TAA）与DC相结合是肿瘤免疫治疗的方式之一。目前所发现的TAA大多具有组织特异性,如AFP抗原只在肝癌中表达,PSA抗原只在前列腺癌中表达,以这些TAA为基础进行肿瘤免疫治疗只能杀伤表达该抗原的肿瘤组织或细胞,其治疗窗窄。因此,寻找可用于大多数肿瘤免疫治疗的肿瘤共有抗原是肿瘤免疫治疗的关键。肝素酶是一种内源性糖苷内切酶,它通过降解基底膜（Basement Membrane,BM）和细胞外基质（Extracellular Matrix ,ECM）中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（Heparan Sulfate Proteoglycans,HSPG）促进细胞的迁移。国内外许多研究表明,肝素酶在绝大多数中晚期肿瘤中表达,与肿瘤患者的预后密切相关。抑制肝素酶的表达可以抑制肿瘤的转移,而将肝素酶转染至肝素酶阴性的肿瘤细胞中可以促进肿瘤的转移。我们过去的研究表明,肝素酶全长cDNA负载的DC可以诱导产生肝素酶特异性的细胞毒T淋巴细胞（Cytotic T Lymphocyte,CTL）,对肝素酶阳性且MHC相匹配的胃癌细胞具有明显的杀伤效应,该研究不仅提示肝素酶可作为肿瘤共有抗原用于肿瘤的免疫治疗,而且在肝素酶的全长氨基酸序列中一定存在能诱导产生肝素酶特异性的CTL表位（Epitopes）。为此,我们进一步采用生物信息学及反向免疫学技术,预测并鉴定了3条人肝素酶抗原表位和2条小鼠肝素酶抗原表位。结果表明,上述多肽表位在体内外均可诱导机体产生肝素酶特异性CTL反应,对肝素酶阳性且MHC相匹配的不同来源的各肿瘤细胞具有明显的杀伤效应;动物实验表明,小鼠肝素酶抗原表位对肿瘤荷瘤小鼠具有明显的免疫治疗和免疫保护作用。与肝素酶腺病毒疫苗相比,多肽疫苗可以体外合成,没有病毒载体的参与,安体性明显提高,因此具有更广阔的应用前景。但多肽疫苗由于分子量小,免疫原性弱,易降解,体内可能不能诱导足够强的免疫效应,因此限制了其临床应用。为解决这一弊端,1988年Tam首先提出了多抗原肽（Multiple antigen peptides, MAP）的设计策略,即采用分子量小且免疫原性弱的赖氨酸为核心基质,将若干条（一般为4条或8条）抗原表位单体耦联在一起,形成树枝样结构。这种MAP疫苗的设计原理不仅适用于B细胞表位,而且适用于T细胞表位。基于以上分析,本研究拟在以往研究的基础上,将成功鉴定出的3条人肝素酶CTL表位[277-285（KMLKSFLKA,Hpa277）, 525-533（PAFSYSFFV,Hpa525）和405-413 （WLS LLFKKL, Hpa405）]和2条小鼠肝素酶CTL表位[519-526（FSYGFFVI, mHpa519）和398-405（LSLLFKKL,mHpa398）分别构建成四分枝肽的MAP疫苗,研究其体内及体外的抗肿瘤活性,并与肝素酶CTL表位单体多肽疫苗诱导的CTL活性进行对比,为肝素酶T细胞MAP疫苗抗肿瘤效应的临床应用提供理论依据。[方法]1、将三条人肝素酶CTL表位[ 277-285（KMLKSFLKA, Hpa277） , 525-533 （PAFSYSFFV,Hpa525）和405-413（WLSLLFKKL, Hpa405）]以及两条小鼠肝素酶CTL表位[519-526（FSYGFFVI, mHpa519）和398-405（LSLLFKKL, mHpa398）]设计成MAP结构,采用标准固相肽合成法（SPSS）合成MAPs;采用反相高压液相色谱仪（RP-HPLC）分析其纯度;采用液相色谱/质谱联用（LC/MS）测目标多肽分子量。阴性对照肽选用人HLA限制性流感病毒HLA-A2.1限制性表位（NYKHCFEI）。2、按文献分离培养人外周血单个核细胞（PBMC）来源的DCs。采用光学显微镜观察其形态,并采用流式细胞术鉴定其细胞表面CD分子的表达。然后以人肝素酶MAP肽、相应单肽分别负载DC后,诱导产生肝素酶特异性CTL,制备效应细胞。采用标准51Cr释放实验检测肝素酶特异性CTL对不同靶细胞[SW480结肠癌细胞（Hpa+, HLA-A2.1+）、KATO-Ⅲ胃癌细胞（Hpa+, HLA-A2.1+）、U2OS骨肉瘤细胞（Hpa+, HLA-A2.1+）、MCF-7乳腺癌细胞（Hpa-, HLA-A2.1+）、转染了肝素酶cDNA的MCF-7/Hpa乳腺癌细胞（Hpa+, HLA-A2.1+）、HepG2肝癌细胞（Hpa+, HLA-A2.1-）、转染了HLA-A2.1cDNA的HepG2/HLA-A2.1肝癌细胞（Hpa+, HLA-A2.1+）]的免疫杀伤效应;采用同样方法检测上述效应细胞对少量表达肝素酶的自体淋巴细胞和DC的免疫杀伤活性以研究其毒副作用;采用ELISPOT技术检测上述效应细胞IFN-γ释放情况。3、按文献分离培养C57BL/6-Tg（HLA-A2.1+）小鼠骨髓来源的树突状细胞（mDC）,采用光学显微镜观察其形态,采用流式细胞术鉴定细胞表面CD分子的表达。将所选人肝素酶CTL表位MAP肽、相应单肽负载mDC后,免疫小鼠三次,每周一次。取其脾淋巴细胞作为效应细胞,采用51Cr释放实验检测肝素酶特异性CTL对上述的靶细胞以及自体淋巴细胞和树突状细胞的杀伤效应;采用ELISPOT检测效应细胞IFN-γ释放。4、按文献方法分离培养获得C57BL/6（H-2Kb）小鼠骨髓来源的成熟树突状细胞（mDC）,光学显微镜观察其形态和流式细胞术检测其细胞表面CD分子的表达。用小鼠肝素酶CTL表位多抗原肽、相应单肽分别负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,然后取其脾淋巴细胞当作效应细胞,采用标准51Cr释放试验检测肝素酶多肽诱导的特异性CTL对不同肿瘤细胞[EL-4淋巴瘤细胞(mHpa+,H-2Kb+)、B16黑色素瘤细胞(mHpa+,H-2Kb+)、Lewis肺癌细胞(mHpa+,H-2Kb+)、P815肥大细胞瘤细胞（mHpa+,H-2Kb-）]以及自体淋巴细胞和mDC的免疫杀伤效应。采用ELISPOT检测上述效应细胞IFN-γ释放。5、为研究肝素酶MAP肽对荷瘤小鼠的免疫保护,先将肝素酶多肽负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,再将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠背部皮下,每10天测一次肿瘤直径,一月后处死,比较肿瘤大小。为研究肝素酶MAP肽对荷瘤小鼠的免疫治疗作用,先将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠皮下,待肿瘤长至1mm左右时,再用肝素酶多肽负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,一月后处死,比较肿瘤大小。为研究肝素酶MAP肽对荷瘤小鼠的生存时间的影响,采用免疫治疗的研究方法,观察肝素酶疫苗接种后,记录死亡小鼠的死亡时间、数量及组别,观察时间为三个月。6、实验数据以x±SD表示,采用SPSS11.5统计软件进行t检验,当P﹤0.05时认为有统计学意义。[结果]1、采用标准固相肽合成法（SPSS）合成人及小鼠肝素酶MAP肽及相应的单肽。采用反相高压液相色谱仪（RP-HPLC）分析其纯度。采用液相色谱/质谱联用（LC/MS）测其分子量。结果表明合成的多抗原肽及相应单肽的纯度均在90%以上,达到国际多肽实验标准。所得肽的分子量理论值与实测值之间无明显差异,说明所合成的肽是我们所需的目的多肽。2、体外（In vitro）和离体（Ex vivo）实验表明,人肝素酶特异性CTL对于肝素酶阳性且HLA-A2.1匹配的SW480、U2OS和KATO-Ⅲ细胞具有明显的杀伤效应,且肝素酶MAP肽诱导的杀伤效应明显高于相应单肽诱导的杀伤效应;但对HLA-A2.1阳性但肝素酶阴性的MCF-7细胞和肝素酶阳性但HLA-A2.1阴性的HepG2细胞均无杀伤效应,而对肝素酶阳性且HLA-A2.1匹配的MCF-7/Hpa细胞和HepG2/HLA-A2.1细胞,且MAP肽诱导的杀伤效应亦明显高于相应单肽诱导的杀伤效应。提示人肝素酶MAP肽能激发较相应单肽更强的特异性抗肿瘤效应;肝素酶MAP肽诱导的CTL反应具有肝素酶特异性且受HLA-A2.1限制。进一步检测了肝素酶特异性CTL对少量表达肝素酶的自体淋巴细胞和DC是否具有免疫杀伤效应,结果表明无论是肝素酶MAP肽诱导的效应细胞,还是相应单肽诱导的效应细胞,均对上述两种靶细胞无明显杀伤效应,提示肝素酶MAP肽疫苗的安全性。ELISPOT检测效应细胞IFN-γ的分泌情况,结果表明MAP肽可以诱导更多的效应细胞产生IFN-γ。在删除CD4+T淋巴细胞后,肝素酶MAP肽及相应单肽诱导效应细胞分泌IFN-γ的水平均下降,提示CD4+T淋巴细胞在CD8+ T淋巴细胞的生成过程中具有重要作用。3、小鼠肝素酶多肽疫苗的研究表明,小鼠肝素酶特异性CTL对肝素酶阳性且H-2Kb阳性的EL-4淋巴瘤细胞、Lewis肺癌细胞以及B16黑色素瘤细胞具有明显的杀伤效应,且小鼠肝素酶MAP肽诱导的杀伤效应明显高于相应单肽诱导的杀伤效应;而对肝素酶阳性但H-2Kb阴性的P815肥大细胞瘤细胞不具有杀伤效应,对少量表达肝素酶的自体淋巴细胞和mDC亦不具有杀伤效应。进一步采用ELISPOT检测肝素酶特异性效应细胞IFN-γ的分泌能力,结果显示肝素酶MAP肽促进效应细胞IFN-γ的分泌能力明显高于相应的单肽;在删除CD4+T淋巴细胞后,上述效应细胞IFN-γ分泌水平均明显下降。4、在体研究小鼠肝素酶MAP肽及其相应的单肽对小鼠的免疫保护及免疫治疗效应。免疫保护效应结果表明小鼠肝素酶MAP肽及其相应的单肽免疫保护组小鼠皮下肿瘤体积明显小于阴性肽组及未保护组（PBS组）（p<0.05）,且MAP肽组小鼠皮下肿瘤体积明显小于相应单肽组（p<0.05）,提示小鼠肝素酶MAP肽对荷瘤小鼠免疫保护效应高于相应的单肽组。免疫治疗效应结果表明,小鼠肝素酶MAP肽及其相应的单肽免疫治疗组小鼠皮下肿瘤体积明显小于阴性肽组及未治疗组（PBS组）（p<0.05）,且多抗原肽组小鼠皮下肿瘤体积小于相应单肽组（p<0.05）,提示小鼠肝素酶多抗原肽对荷瘤小鼠免疫治疗效应强于相应的单肽组。进一步研究肝素酶多肽疫苗对荷瘤小鼠的生存时间的影响,结果表明,肝素酶MAP肽组荷瘤小鼠生存时间明显长于阴性肽组及未治疗组（PBS组）,同样长于相应的单肽组。[结论]1、采用标准固相肽合成法（SPSS）合成三条人及两条小鼠肝素酶多抗原肽[MAP4-Hpa（525-533）（PAFSYSFFV）,MAP4-Hpa（277-285）（KMLKSFLKA）, MAP4-Hpa（405-413）（WLSLLFKKL）, MAP4-mHpa（398-405）（LSLLFKKL）, MAP4-mHpa （519-526） （FSYGFFVI）]及相应的单肽,采用反相高压液相色谱仪（RP-HPLC）分析其纯度,采用液相色谱/质谱联用（LC/MS）测其分子量。结果表明合成的多抗原肽及相应单肽的纯度达到国际多肽实验标准,所合成的肽的分子量理论值与实测值无明显差异,为我们所需的目的多肽。2、无论人还是小鼠的肝素酶MAP肽体外及离体均可诱导产生较相应单肽更强的抗肿瘤反应,这种抗肿瘤免疫效应是肝素酶特异、且受MHC限制。肝素酶特异性CTL,无论是MAP肽诱导的,还是相应单肽诱导的,对少量表达肝素酶的自体淋巴细胞和DCs均无明显的杀伤效应,提示这种疫苗的安全性。此外,肝素酶MAP肽促进效应细胞IFN-γ的分泌能力强于相应的单肽,这种IFN-γ分泌能力在CD4+T淋巴细胞删除后明显减少,提示肝素酶MAP可以通过促进IFN-γ的分泌以增强非特异性的抗肿瘤效应,CD4+T淋巴细胞在CD8+T淋巴细胞的生成过程中发挥重要作用。3、体内研究证实小鼠肝素酶MAP肽可以增强荷瘤鼠的免疫保护及免疫治疗效应,并且可以明显增加荷瘤鼠的生存率,延长荷瘤鼠的生存时间。以上研究表明,肝素酶MAP肽不仅能激发较相应单肽更强的特异性的抗肿瘤效应,而且还能诱导一个较相应单肽更强的非特异性抗肿瘤的良性循环,这种肝素酶MAP疫苗具有高效、特异、安全的特点,为肝素酶MAP肽疫苗的临床应用提供了理论和实验依据。
王丽[7]（2010）在《MAGE-A3、HLA-A1及HLA-A2在食管鳞癌中的表达及其相关性研究》文中认为肿瘤严重危害人类的健康及生命,特别是恶性肿瘤,具有很高的致死率。食管癌发病率占全部恶性肿瘤的1%～2%,仅次于胃癌位居第2位,世界范围内因癌症死亡的病例中,食管癌位居第6位。我国为食管癌高发区,在进入21世纪时,仍有900万居民面临食管癌的威胁,每年约有18万人死于食管癌。目前治疗食管癌的三大传统疗法-外科手术、放疗和化疗各有其局限性,无法根除肿瘤。近年来随着分子生物学和基因工程技术的发展,根据肿瘤生物学特性,以基因免疫治疗为代表的生物治疗方法成为一个重要的研究方向,构成肿瘤尤其是恶性肿瘤综合治疗的重要组成部分。肿瘤基因免疫治疗依赖于细胞免疫和体液免疫两大免疫系统的活化,具有肿瘤高度特异性的特点,对正常细胞及组织几乎不产生损伤。保证免疫治疗成功的关键是发现并鉴定肿瘤特异性抗原,黑色素瘤相关抗原3（melanoma-associated antigens 3, MAGE-A3）作为人类已经发现并鉴定的肿瘤特异性抗原,除了睾丸和胎盘之外的正常组织以及良性肿瘤中不表达外,广泛表达于人体的多种肿瘤组织及细胞,如黑色素瘤、头颈部鳞癌、食管癌,肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等。人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）是免疫系统中的重要组成部分,参与机体递呈抗原,决定免疫细胞对肿瘤的识别和杀伤,它与肿瘤的关系一直备受关注。HLA-Ⅰ类分子主要捕获细胞内病原体的抗原肽,并递呈给免疫系统。HLA-Ⅱ类分子主要处理外源性抗原。人体内HLA-I类分子可以将MAGE-A3所编码的蛋白中某些多肽递呈于细胞表面,后者可被自体细胞毒性T淋巴细胞（autologous cytotoxic T lymphocyte, CTLs）识别,所以,MAGE-A3是一种CTLs介导的特异性免疫治疗的理想靶分子。在MAGE-A3抗原蛋白上存在许多抗原决定簇,它们可以与不同的HLA-I类分子相结合,诱导产生特异性的CTLs来杀伤MAGE-A3阳性的肿瘤细胞。所以针对肿瘤细胞的特异性细胞免疫治疗的成败与否,在很大程度上取决于HLA-I类分子的参与。效应性T淋巴细胞上的TCR识别并结合HLA-I类分子/MAGE-A3抗原肤复合体后,该细胞才能被有效地激活。在我国HLA-A1和HLA-A2在食管癌患者中具有较高的分布频率,因此,了解MAGE-A3、HLA-A1及HLA-A2分子在食管癌患者中的表达及分布情况,就可以对应用MAGE-A3抗原肽特异性免疫治疗食管癌的可能性及有效性进行估测。材料与方法1.标本收集：本研究共收集60例食管癌组织、30例癌周3cm以内的不典型增生组织及3cm以外的30例正常食管黏膜组织。癌组织经无RNA酶水冲洗以清除可能污染的瘤细胞后,再切取肿瘤组织,常规石蜡包埋,切片,不典型增生组织及正常食管黏膜组织离体40min内迅速放入-80℃冰箱保存。2MAGE-A3基因的表达检测及重组抗原的制备：RT-PCR法检测MAGE-A3在食管癌组织中的表达情况。采用DNA重组技术将MAGE-A3全长cDNA克隆到pET30a（+）载体上,转化为大肠杆菌BL21（DE3）, IPTG诱导表达,经SDS-GAGE和westernblot鉴定后,制备其可溶性蛋白,研究其对T细胞增殖能力的影响。3.HLA-A1和HLA-A2基因的表达：用间接过氧化酶免疫组织化学法对食管癌组织石蜡切片进行检测并综合分析。4.统计学处理：SPSS13.0进行数据整理和分析。对数值变量,首先作正态性和方差齐性检验,符合正态分布和方差齐性条件的作t检验和方差分析,不符合正态分布和方差齐性条件的作非参数检验进行不同组间差异的分析。对分类变量,作χ2检验。检验水准α=0.05。结果1MAGE-A3抗原蛋白表达情况：共提取所有标本蛋白120例。其中癌组织60例,Western blot方法检测发现有21例癌组织为MAGE-A3抗原阳性,阳性率为35.00%。另外还在食管不典型增生组织中发现有2例MAGE-A3表达阳性。成功获得MAGE-A3可溶性蛋白,人T细胞能够对自身抗原呈递细胞加工处理的MAGE-A3蛋白产生应答。2MAGE-A3抗原与与食管癌预后的关系：MAGE-A3抗原阳性（84.20%）的食管鳞癌患者手术后18个月的生存率明显高于其抗原阴性者（57.60%）。3HLA-A1和-A2基因分布情况：食管癌组织中HLA-A1、-A2的阳性率分别为8.33%（56/60）、53.33%（32/60）；食管不典型增生组织中HLA-A1、-A2的阳性率分别为6.66%（2/30）、46.66%（14/30）；正常食管黏膜组织中中HLA-A1、-A2的阳性率分别为3.44%（1/29）、43.33%（13/30）。推测有近19.00%（MAGE-A3/HLA-A2,53.33%、35.00%）的食管癌患者适合MAGE-A3/HLA-A2抗原肽的特异性免疫治疗。4HLA-A1、-A2缺失与食管癌：部分HLA-A1和HLA-A2基因在癌组织中丢失（HLA-A1有1例,HLA-A2有10例）而在不典型增生和正常组织中存在,HLA-A1和-A2的缺失率为18.33%（11/60）。结论1MAGE-A3抗原可作为食管癌早期诊断的表面抗原,有可能成为食管癌患者免疫治疗的靶抗原。2HLA-A1和HLA-A2基因分布情况与文献报道相似,HLA-A2能识别、结合MAGE-A3抗原肽,为MAGE-A3抗原疫苗的研制奠定了基础。3.食管癌早期,适当浓度的特异性MAGE-A3可刺激患者T细胞免疫应答,对食管癌的防治可能有价值。
鲍传庆[8]（2010）在《大肠癌患者自体树突状细胞免疫治疗技术临床应用研究》文中研究说明大肠癌包括结肠癌和直肠癌,是最常见的消化道恶性肿瘤之一。在世界范围内,大肠癌发病率居恶性肿瘤第4位,已占全身恶性肿瘤的12%-15%,每年有102万新发病例和53万死亡病例。自上世纪70年代以来,我国大肠癌发病率和死亡率有不断上升趋势（以结肠癌上升为主）,并且青年期（<30岁）大肠癌发病率高是我国大肠癌的一个显着临床特点。因大肠癌早期症状不明显,多数患者就诊时已发生区域或远处转移,单纯手术治疗不能显着改善患者预后,因此综合治疗成为目前治疗大肠癌的重要方法。生物治疗作为大肠癌综合治疗的组成部分,即可以独立运用,又可与手术及放、化疗结合,具有疗效高、特异性强、副作用小等优点,已成为研究的热点之一。树突状细胞（DC）是目前已知功能最强大的专职抗原递呈细胞,是机体T细胞特异性免疫应答的直接启动和调控者。它最大的特点是能够显着刺激初始型T细胞的增殖,在免疫反应的诱导中具有独特的地位。DC在外周组织中摄取抗原,加工分解成抗原肽与MHC-I/II类分子结合,然后移行到周围淋巴器官通过MHC分子递呈抗原给T淋巴细胞,激发特异性抗肿瘤免疫反应。与其他抗原递呈细胞相比,DC表达MHC-I/II类分子、共刺激分子和粘附分子的水平更高,因此在刺激T细胞增殖,抗肿瘤免疫中起重要作用。早在1995年国外学者就开展了DC治疗肿瘤的I期临床试验,以DC为载体开发的DC肿瘤疫苗在前列腺癌、恶性黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、脑胶质瘤、肾细胞癌等恶性肿瘤患者治疗中取得了显着的疗效。DC肿瘤疫苗用于结直肠癌的研究也表明其安全有效,不仅可降低结直肠癌患者癌胚抗原（CEA）水平,甚至可使肺部转移病灶消失。以DC为载体开发的DC肿瘤疫苗已成为现今最先进、最有希望的肿瘤免疫治疗方法之一。由于大肠癌是一种免疫原性较弱的肿瘤,且肿瘤细胞缺乏共刺激分子或某些粘附分子,并可通过抗原调变、下调MHC分子表达等机制介导肿瘤免疫逃逸,从而影响免疫治疗效果。另有研究表明,肿瘤患者体内DC数量减少及功能缺陷,使其无法有效递呈肿瘤抗原,亦是肿瘤免疫逃逸的主要原因之一。因此,提高肿瘤患者体内DC的数量并维持其强大的抗原识别、呈递功能是实施抗肿瘤免疫治疗的关键措施之一。正因为此,应用足够数量和功能正常的DC细胞进行细胞免疫治疗或基于DC细胞的抗肿瘤疫苗研究工作越来越受到重视。对肿瘤患者提供外源性DC细胞进行细胞免疫治疗的方法现已经历了以下阶段的发展:早期多采用已知肿瘤相关抗原肽或肿瘤细胞mRNA修饰致敏DC,但疗效不佳。随着研究的深入,改用肿瘤全抗原致敏DC的方法,即,将肿瘤细胞与DC融合或用肿瘤细胞裂解物负载DC制成杂交疫苗,用于胃癌、肝细胞癌及大肠癌治疗的临床研究取得较好的抗肿瘤效果。而最近研究发现,DC表面表达多种热休克蛋白（HSP）受体（如CD91,CD40,TLR2/4或LOX1）,HSP可作用于DC或单核细胞,刺激其产生细胞因子（IL-12,TNFa,IL-6等）,增强机体非特异性免疫反应。2004年免疫学权威杂志《Immunity》报道,与多肽负载的DC相比,HSP70-抗原肽复合物负载的DC在体外激发CD8+ T的能力远远高于前者（1000倍）。提示如果将HSP与DC进行有机结合,发挥二者各自的优势,将会产生更强的免疫激发作用。有鉴于此,本研究对大肠癌患者热休克凋亡自体的大肠癌细胞抗原制备、自身的树突状细胞体外诱导、以及抗原负载方法等进行了初步探讨,并比较了分别负载热休克诱导凋亡大肠癌细胞株和肿瘤细胞裂解物两种不同抗原的DC对大肠癌细胞的杀伤效果,并探讨了热休克凋亡的人自体大肠癌细胞致敏自体的树突状细胞疫苗对大肠癌患者术后免疫功能的影响,为制备大肠癌细胞肿瘤疫苗研究提供技术基础。研究共分为三个部分:第一部分自体大肠癌细胞负载树突状细胞的方法研究目的:建立自体热休克凋亡大肠癌（包括结肠、直肠癌）细胞抗原制备、树突状细胞体外诱导、以及抗原负载方法,为制备树突状细胞肿瘤疫苗提供技术基础。方法:采用酶消化法从手术切除的14例大肠癌新鲜组织获得单细胞悬液,热休克处理后用桦脂酸诱导其凋亡制备成细胞抗原;采集外周静脉血,分离单个核细胞,经GM-CSF与IL-4体外诱导成未成熟树突状细胞,负载细胞抗原后制备成DC肿瘤疫苗;苔盼蓝染色进行细胞总数及活细胞计数,计算细胞活率;用FITC-Annexin-Ⅴ和PI标记细胞,流式细胞仪检测,计算细胞凋亡率。软琼脂克隆法检测细胞体外成瘤能力;按《中华人民共和国药典》2005版第三部规定的方法进行内毒素检测。结果: （1）肿瘤细胞抗原得率:（11.81±0.65）×106/g组织;平均凋亡率:（93.16±2.31）%;（2）imDC平均得率为（9.75±0.82）×106（/121.64）×106个PBMC,细胞活率>95%;imDC表型分析:CD11c+CD14-、CD11c+HLA-DR+、CD11c+CD80+、CD11c+CD83+、CD11c+CD86+表达率分别为（87.58±2.56）%、（87.97±0.98）%、（2.21±0.69）%、（4.85±1.22）%、（5.02±0.95）%;（3）DC平均得率为（6.76±0.98）×106/（9.75±0.82）×106个imDC,细胞活率>95%,DC表型:CD11c+CD14-、CD11c+HLA-DR+、CD11c+CD80+、CD11c+CD83+、CD11c+CD86+表达率分别为（ 93.45±1.25 ） %、（89.79±1.35）%、（87.85±1.62）%、（70.74±6.45）%、（95.54±2.18）%。内毒素检测均合格（≤5 IU/mL）。结论:本方法稳定、安全、可靠,可制备出成熟DC。第二部分两种不同方式负载大肠癌细胞株的树突状细胞体外刺激淋巴细胞抗肿瘤活性的比较目的:比较树突状细胞以两种不同方式负载大肠癌细胞株体外刺激淋巴细胞的抗瘤活性。方法:分离30例大肠癌患者外周血单核细胞体外诱导DC,分别负载热休克诱导凋亡大肠癌细胞株和肿瘤细胞裂解物,以此刺激淋巴细胞作为效应细胞,大肠癌细胞株为靶细胞,MTT法测定效应细胞对靶细胞的杀伤作用。结果:负载热休克大肠癌细胞的DC与负载肿瘤细胞裂解物的DC都显示对靶细胞的杀伤活性,但前者的杀伤率显着高于后者（P<0.05）。结论:负载热休克肿瘤细胞的DC是一个更为有效的负载方式。第三部分自体DC治疗对大肠癌患者术后免疫功能的影响目的:探讨热休克凋亡的人自体大肠癌细胞致敏的树突状细胞疫苗对大肠癌术后免疫功能的影响。方法:从大肠癌患者外周血单个核细胞中诱导DC,并用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4刺激活化,经热休克凋亡自体大肠癌细胞致敏制备DC疫苗。将28例大肠癌术后患者随机分为DC疫苗治疗组14例,化疗对照组14例。对两组病例治疗前后免疫功能、临床疗效进行观察比较。结果:DC疫苗组治疗后外周血CD3+、CD4+/CD8+及NK细胞比率较治疗前明显升高（P<0.05）,且明显高于对照组化疗后的CD3+、CD4+/CD8+及NK细胞比率（P<0.05）;DC疫苗治疗后患者血清IL-2、IL-12、IFN-γ水平较治疗前明显升高（P<0.05）,且明显高于对照组（P<0.05）,生存时间明显延长。结论:大肠癌术后行热休克凋亡自体大肠癌细胞致敏的DC疫苗治疗,可提高患者的细胞免疫水平。
董博翰[9]（2009）在《肿瘤细胞裂解物—结核分枝杆菌热休克蛋白65的抗肺癌作用》文中指出肿瘤细胞裂解物（TCL）是利用一定物理或者化学的方法将肿瘤细胞裂解,使细胞内的抗原物质释放到外周而形成的抗原肽混合物。理论上TCL中含有肿瘤细胞内的全部肿瘤抗原,因此除可以作为抗肿瘤疫苗应用于抗肿瘤治疗外,还能有效的解决目前的抗肿瘤疫苗抗原性比较单一的问题。但是,以外源性的方式免疫肿瘤抗原存在不能很好激活细胞免疫反应的问题,而解决这一问题的关键是如何使抗原物质更好的活化特异性CTL。要作到这一点,首先应该想办法使外源性应用的抗原被APC以MHC I途径递呈。目前的研究已经发现一些免疫细胞,如树突状细胞（DC）等,可以利用交叉递呈的机制将外源性抗原以MHC I类途径进行递呈,从而有效的诱生抗原特异性CTL。而这一过程的发生通常需要一些免疫佐剂物质的辅助。大量的实验事实已经证明热休克蛋白（HSP）就是这样一种可以辅助交叉递呈发生的物质,因此利用它和肿瘤抗原共同诱导抗肿瘤免疫应该是可行的肿瘤治疗策略。在本研究中,我们直接在体外将MHSP65和Lewis肺癌TCL混合制备出MHSP65-TCL抗肿瘤疫苗并探索了其对Lewis肺癌的治疗效果。结果发现,MHSP65-TCL可以在C57BL/6小鼠体内产生明显的抑制Lewis肺癌细胞生长的作用,并显着延长小鼠的生存期（P<0.05）。我们接下来的研究表明,这种抗肺癌的效果是由TCL特异性的CTL细胞所介导的,小鼠体内活化的CTL细胞可以在体外明显的杀伤Lewis肺癌细胞（P<0.05）。此外,我们还发现非特异性免疫在抗肿瘤过程中也发挥了重要的作用。MHSP65-TCL正是通过激活特异性免疫和非特异性免疫这两条途径来发挥抗肺癌作用的。因此,这种新型的抗肿瘤疫苗将很有希望应用于肺癌的免疫治疗。
廖博[10]（2009）在《骨肉瘤相关抗原的免疫学筛选及其生物信息学分析》文中认为背景:骨肉瘤是一种恶性度很高的肿瘤。免疫治疗对于预防肿瘤形成以及清除荷瘤宿主体内的残留病灶,具有较好的应用前景,而建立肿瘤免疫治疗及制备骨肉瘤疫苗的一个重要前提就是要有可作为靶向的肿瘤抗原。目前已发现的能够引起特异性免疫反应的骨肉瘤抗原在动物实验及体外诱导骨肉瘤特异性CTL的产生中显示出了良好的作用。但总的来说,疫苗效果仍不理想,其原因之一在于目前发现的肿瘤抗原的免疫原性较弱,这是限制疫苗疗法进一步发展的主要问题。这就迫切需要我们识别更多的、免疫原性更强的肿瘤抗原,致力于多价疫苗的开发,推动骨肉瘤特异性主动免疫治疗的进一步研究。目的:①构建人骨肉瘤细胞cDNA表达文库;②采用骨肉瘤患者的混合血清对9901细胞cDNA表达文库进行免疫筛选,以得到可引起免疫应答的骨肉瘤肿瘤相关抗原;③通过生物信息学分析,比较筛选得到的阳性克隆,获取具有应用价值的独立知识产权的新基因,为本课题的进一步研究确定方向。方法:①提取9901细胞总RNA,分离mRNA,反转录合成双链cDNA,消平cDNA末端,连接EcoRⅠ适配子,磷酸化EcoRⅠ适配子5’端;Sephacryl-S400柱除去小于400bp cDNA片段,与噬菌体λgt11（载体）连接,用包装蛋白体外包装后建成初级cDNA文库;取适量包装体系倍比稀释后感染E.coli Y1090,测定文库大小及重组率;随机挑取10个噬斑,在ExAssist辅助性噬菌体的作用下,释放出PBK-CMV噬菌粒;感染大肠杆菌XLOLR,铺于卡那霉素抗性的LB平板;挑取克隆,37℃震摇过夜;提取质粒,经EcoR I和Xho I酶切后,初步确定片段的大小及多样性。②感染有重组λgt11噬菌体的大肠杆菌XL1-Blue MRF’铺于150mm NZY平板,37℃倒置培养6h后,将IPTG预先处理的硝酸纤维素膜覆盖于平板上,继续培养10h,做好标记;取下硝酸纤维素膜,用封闭液室温封闭1h后,置于1:100稀释的骨肉瘤患者血清（预先用大肠杆菌裂解物吸收）中孵育15h,再置于1:2500稀释的生物素化二抗中孵育1h,然后与1:2500稀释的碱性磷酸酶标记的亲合素孵育1h;采用NBT/BCIP对阳性噬斑显色;挑取阳性噬菌斑,再经3轮复筛,直至得到一致的阳性噬斑。③获得的阳性噬菌体克隆,在ExAssist辅助性噬菌体的作用下,在大肠杆菌XL1-Blue MRF’中剪切后,转变为PBK-CMV噬菌粒,感染大肠杆菌XLOLR后,铺于卡那霉素抗性的LB平板;挑取克隆,37℃震摇过夜;抽提质粒,经EcoR I和Xho I酶切后,初步确定片段的大小,然后测序。④采用BLAST软件进行序列同源性分析;采用Grail、ProtParam、ScanProsite、SOPMA、TMpred、SignalP、Psort、HLABind等软件分析阳性克隆的编码区、功能位点、二级结构、特殊结构、细胞定位及抗原决定簇情况等,为进一步的功能研究奠定基础。结果:经计算,所建文库共含噬菌体1.5×106个;蓝白筛选平板上的242个噬斑均为白色噬斑,因此重组率在94.3%以上;通过酶切对插入片段大小进行鉴定,电泳结果显示:10个噬斑均切出插入片段,且大小不一,平均大小1.4kb左右。②第一轮筛选共得到阳性噬斑131个,再经过3轮复筛,最终得到32个阳性重组噬菌体,经剪切、感染及酶切鉴定后,全部送去测序;③测序结果经BLAST,共得到12条基因序列,其中已知基因5条,新基因7条,已全部登陆GenBank;④通过CrELISA测定新基因与患者血清反应的特异性,结果表明,OSAA-3和OSAA-5具有较高的OD值,免疫原性明显强于其他抗原。结论:①成功构建了人骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库;经鉴定,其库容量高达1.5×106,重组率大于94.3%,具有较好的多样性;②对SEREX法加以改良:采用患者混合血清进行筛库,使阳性克隆的得率增加,降低筛库的风险;采用细胞系建库,使文库更具有代表性,同时正常细胞及B细胞的干扰,减少假阳性信号的产生。③阳性克隆测序后经同源序列比对分析,共获得已知基因5条,新基因7条;④通过生物信息学和酶联免疫检测分析,我们对OSAA-3和OSAA-5的理化性质和基本功能有了初步的了解,认识到它们作为骨肉瘤相关抗原免疫原性较强,可能在细胞的生长、增殖和分化中具有重要作用。
二、MAGE3-HLA-A2肽疫苗诱导胃癌患者自体CTL的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、MAGE3-HLA-A2肽疫苗诱导胃癌患者自体CTL的研究（论文提纲范文）
（1）改造型TP53共享新抗原诱导抗肝癌作用的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 肝癌TP53 共享新抗原的改造及其对肝癌细胞的抑制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 改造型TP53 共享新抗原诱导的T细胞对消化系统肿瘤细胞的抑制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 新抗原在实体肿瘤中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 致谢 |
（2）非小细胞肺癌中TIGIT在CD8+T细胞的表达及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 TIGIT在非小细胞肺癌患者CD8+T 细胞上的表达 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 TIGIT抑制肺肿瘤免疫反应的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 anti-TIGIT与 anti-PD-1 联合治疗的抑癌效果 |
| 一、材料方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述一 TIGIT在肿瘤中的作用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 非小细胞肺癌治疗的策略和展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文及参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（3）5-氮杂-2’-脱氧胞苷（DAC）增强MAGE-A10抗原肽表达并改善MAGE-A10特异性CTL杀伤肺癌细胞的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 MAGE-A10抗原在人肺癌组织的表达及临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MAGE-A10抗原在人肺癌细胞系和原代细胞的表达及MAGE-A10的生物信息学分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 去甲基化药物对MAGE-A10 特异性CTL杀伤活性及对肺癌细胞杀伤效应影响的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 肿瘤免疫治疗及MAGE-A抗原在肿瘤免疫治疗中的研究进展和应用现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）基于结构修饰及内源佐剂策略的肿瘤糖疫苗的设计及活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词及中英文对照表 |
| 第一章 前言 |
| 1 肿瘤疫苗 |
| 1.1 肿瘤相关抗原 |
| 1.2 抗肿瘤疫苗免疫应答途径 |
| 2 肿瘤疫苗策略 |
| 2.1 肿瘤细胞疫苗 |
| 2.2 DC疫苗 |
| 2.3 基因疫苗 |
| 2.4 基于蛋白/肽的肿瘤疫苗 |
| 2.5 基于糖抗原的肿瘤疫苗 |
| 3 肿瘤糖疫苗概况 |
| 3.1 肿瘤相关糖抗原 |
| 3.2 基于TACAs开发的肿瘤疫苗的难点 |
| 4 肿瘤糖疫苗策略 |
| 4.1 基于载体开发的肿瘤糖疫苗 |
| 4.2 基于TACAs结构修饰开发的肿瘤糖疫苗 |
| 4.3 基于内源性佐剂开发的全合成肿瘤糖疫苗 |
| 5 本论文立体依据、研究内容及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于Tn-CRM197设计的疫苗活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 糖蛋白复合物制备 |
| 2.2 BCA法测蛋白含量 |
| 2.3 细胞培养 |
| 2.4 免疫方案 |
| 2.5 脾淋巴细胞分离 |
| 2.6 酶联免疫吸附斑点实验 |
| 2.7 血清效价分析 |
| 2.8 流式细胞术检测抗体识别肿瘤细胞 |
| 2.9 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 Tn-CRM197 糖蛋白复合物的合成与鉴定 |
| 3.2 血清学评价 |
| 3.3 T细胞免疫应答评价 |
| 3.4 FACS分析小鼠血清识别肿瘤细胞表面Tn抗原 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于STn设计的疫苗活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 糖蛋白复合物制备 |
| 2.2 BCA法测蛋白含量 |
| 2.3 间苯二酚法测唾液酸含量 |
| 2.4 细胞培养 |
| 2.5 免疫方案 |
| 2.6 脾淋巴细胞增殖实验 |
| 2.7 ELISPOT实验 |
| 2.8 CTL分析 |
| 2.9 血清效价分析 |
| 2.10 流式细胞术检测抗体识别肿瘤细胞 |
| 2.11 ADCC分析 |
| 2.12 CDC分析 |
| 2.13 统计学处理 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 糖蛋白复合物的合成与鉴定 |
| 3.2 流式细胞术分析肿瘤细胞表面表达STn情况 |
| 3.3 疫苗在佐剂辅助时对肺部荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价 |
| 3.4 疫苗在无佐剂辅助时对肺部荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价 |
| 3.5 疫苗在佐剂辅助时对腋下荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价 |
| 3.6 疫苗Y4-CRM197在健康小鼠中的免疫学活性评价 |
| 3.7 疫苗Y4-CRM197对肺部荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 疫苗αGC-MUC1的免疫活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 免疫方案 |
| 2.3 脾淋巴细胞分离及培养 |
| 2.4 ELISPOT实验 |
| 2.5 CTL分析 |
| 2.6 流式细胞术分析CD4~+T细胞 |
| 2.7 血清效价分析 |
| 2.8 流式细胞术分析B细胞表型 |
| 2.9 体内DC细胞,B细胞及iNKT细胞的激活 |
| 2.10 血清中细胞因子检测 |
| 2.11 ELISA检测血清中的细胞因子 |
| 2.12 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 疫苗αGC-MUC1的合成 |
| 3.2 疫苗αGC-MUC1对iNKT细胞的影响 |
| 3.3 疫苗αGC-MUC1对T细胞的影响 |
| 3.4 疫苗αGC-MUC1对B细胞的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 疫苗MUC1-CPG1826 的免疫活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 免疫方案 |
| 2.3 脾淋巴细胞分离 |
| 2.4 ELISPOT实验 |
| 2.5 CTL分析 |
| 2.6 流式细胞术分析CD4~+T细胞 |
| 2.7 流式细胞术分析B细胞表型 |
| 2.8 体内DC细胞及B细胞的激活 |
| 2.9 血清中细胞因子检测 |
| 2.10 ELISA检测血清中的细胞因子 |
| 2.11 血清效价分析 |
| 2.12 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 疫苗MUC1-CPG1826的合成 |
| 3.2 疫苗MUC1-CPG1826对DC细胞的影响 |
| 3.3 疫苗MUC1-CPG1826对T细胞的影响 |
| 3.4 疫苗MUC1-CPG1826对B细胞的影响 |
| 3.5 疫苗MUC1-CPG1826对iNKT细胞的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 疫苗αGC-MUC1-CPG1826的免疫活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 免疫方案 |
| 2.3 脾淋巴细胞分离及培养 |
| 2.4 ELISPOT实验 |
| 2.5 CTL分析 |
| 2.6 流式细胞术分析CD4~+T细胞及B细胞 |
| 2.7 流式细胞术分析体内DC细胞,B细胞及iNKT细胞的激活 |
| 2.8 血清中细胞因子检测 |
| 2.9 ELISA检测血清及细胞上清液中的细胞因子 |
| 2.10 血清效价分析 |
| 2.11 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 疫苗αGC-MUC1-CPG1826的合成 |
| 3.2 疫苗αGC-MUC1-CPG1826对iNKT细胞的影响 |
| 3.3 疫苗αGC-MUC1-CPG1826对T细胞的影响 |
| 3.4 疫苗αGC-MUC1-CPG1826对B细胞的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文及着作情况 |
（5）MAGE-1短肽体外免疫效应的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 综述 |
| 1.1 肿瘤疫苗 |
| 1.1.1 细胞疫苗 |
| 1.1.2 核酸疫苗 |
| 1.1.3 肽疫苗 |
| 1.2 MAGE 基因家族 |
| 1.2.1 MAGE 的分类与结构 |
| 1.2.2 MAGE 的结构、定位和表达 |
| 1.2.3 MAGE 基因的生物学功能 |
| 1.2.4 MAGE 基因与肿瘤的免疫治疗 |
| 第2章 MAGE-1 九肽免疫原性体外实验 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料及仪器 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计学方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 细胞形态学观察 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 MAGE-1_(121-169)短肽表达载体的构建及鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验试剂与设备 |
| 3.1.2 试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 目的基因的获得 |
| 3.2.2 重组质粒构建 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 mRNA OD 值的测定 |
| 3.3.2 RT-PCR 扩增产物 |
| 3.3.3 酶切分析结果 |
| 3.3.4 测序分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 MAGE-1_(121-169)短肽体外免疫活性研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料和仪器 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 MAGE-1_(_(121-169)) 重组质粒的构建和鉴定 |
| 4.2.2 重组菌的表达 |
| 4.2.3 表达条件的优化 |
| 4.2.4 MAGE-1_(121-169) 蛋白产物分析 |
| 4.2.6 表达产物的纯化 |
| 4.2.7 表达产物的 Western-blot 分析 |
| 4.2.8 表达产物定量 |
| 4.2.9 MAGE121-169短肽免疫活性性检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组原核表达载体的转化和鉴定 |
| 4.3.2 重组菌的筛选 |
| 4.3.3 诱导物浓度的优化 |
| 4.3.4 诱导表达时间的优化 |
| 4.3.5 表达蛋白定位分析 |
| 4.3.6 目的蛋白纯化及定量 |
| 4.3.7 Western blot 分析 |
| 4.3.8 免疫活性检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）肝素酶CTL表位多抗原肽（MAP）疫苗的设计及其抗肿瘤免疫效应研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写对照 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一部分 人肝素酶 HLA-A2 限制 CTL 表位MAP 疫苗的设计及体内、外抗肿瘤免疫效应研究 |
| 前言 |
| 第一节 人肝素酶 HLA-A2 限制性 CTL 表位 MAP 疫苗的设计、合成及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第二节 外周血单个核细胞来源树突状细胞分离、培养及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第三节 肝素酶 CTL 表位多抗原肽(MAP)负载的树突状细胞疫苗体外抗肿瘤免疫效应研究 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第四节 小鼠骨髓来源的DC 分离、培养及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第五节 人肝素酶 CTL 表位多抗原肽(MAP)负载的树突状细胞疫苗诱导小鼠体内肝素酶特异性CTL 反应的研究 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 主要参考文献 |
| 第二部分 小鼠肝素酶 H-2K~b 限制CTL 表位MAP 疫苗的设计及体内抗肿瘤免疫效应研究 |
| 前言 |
| 第一节 小鼠肝素酶H-2K~b限制性CTL 表位MAP 疫苗的设计、合成及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第二节 小鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第三节 小鼠肝素酶H-2K~b限制性CTL 表位MAP 肽负载的mDC 疫苗体内抗肿瘤免疫效应研究 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第四节 小鼠肝素酶 CTL 表位 MAP 肽对荷瘤小鼠的免疫保护和免疫治疗效应研究 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 主要参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 文献综述 多肽疫苗抗肿瘤研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生在读期间发表的文章 |
（7）MAGE-A3、HLA-A1及HLA-A2在食管鳞癌中的表达及其相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 论文部分 MAGE-A3、HLA-A1及HLA-A2在食管鳞癌组织中的表达及其相关性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述部分 肿瘤相关性抗原MAGE研究现状与展望 |
| 参考文献 |
| 硕士期间所发表的文章 |
| 英文缩略词索引 |
| 致谢 |
（8）大肠癌患者自体树突状细胞免疫治疗技术临床应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 自体大肠癌细胞负载树突状细胞的方法研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 树突状细胞以两种不同方式负载大肠癌细胞株体外刺激淋巴细胞抗肿瘤活性的比较 |
| 前言 |
| 资料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 自体DC 治疗对大肠癌患者术后免疫功能的影响 |
| 前言 |
| 临床资料及方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 总结、问题及展望 |
| 综述1：大肠癌生物治疗研究进展 |
| 综述2：树突状细胞肿瘤疫苗的研究进展 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（9）肿瘤细胞裂解物—结核分枝杆菌热休克蛋白65的抗肺癌作用（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 热休克蛋白 |
| 1.2.2 肿瘤细胞裂解物（TCL） |
| 1.2.3 抗肿瘤疫苗研究进展 |
| 1.3 材料与方法 |
| 1.3.1 实验材料 |
| 1.3.2 实验方法 |
| 第2章 论文主体 |
| 2.1 实验结果 |
| 2.1.1 MHSP65-TCL 的制备及鉴定 |
| 2.1.2 MHSP65-TCL 的抗Lewis 肺癌作用 |
| 2.1.3 B16 细胞来源 MHSP65-TCL 抗黑色素瘤作用的初步探索 |
| 2.2 讨论 |
| 2.2.1 MHSP65-TCL 抗肿瘤疫苗的制备方式与组成成分的初步探索 |
| 2.2.2 MHSP65-TCL 诱导特异性抗肿瘤免疫 |
| 2.2.3 MHSP65-TCL 诱导非特异性抗肿瘤免疫 |
| 2.2.4 MHSP65-TCL 诱导的特异性与非特异性免疫的关系 |
| 2.2.5 MHSP65-TCL 免疫流程与治疗效果 |
| 2.2.6 MHSP65-TCL 免疫剂量与治疗效果 |
| 2.2.7 问题与展望 |
| 第3章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 学术成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 个人简历 |
（10）骨肉瘤相关抗原的免疫学筛选及其生物信息学分析（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 实验一 骨肉瘤9901 细胞cDNA表达文库的构建和鉴定 |
| 1.1 实验材料与实验方法 |
| 1.1.1 主要试剂和仪器 |
| 1.1.2 骨肉瘤9901 细胞的培养及收集 |
| 1.1.3 9901 细胞总RNA的提取 |
| 1.1.4 总RNA完整性的定量和检测 |
| 1.1.5 mRNA的纯化 |
| 1.1.6 定向克隆cDNA表达文库的构建及扩增 |
| 1.1.7 cDNA文库多样性的鉴定 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 总RNA定量及完整性的检测 |
| 1.2.2 cDNA第1、2 链的同位素示踪 |
| 1.2.3 重组子插入片段大小分析 |
| 1.3 分析和讨论 |
| 1.3.1 cDNA文库的应用 |
| 1.3.2 cDNA文库构建方法的选择 |
| 1.3.3 肿瘤抗原筛选的研究方法及实验前景 |
| 1.3.4 实验方法的改进 |
| 实验二 骨肉瘤肿瘤相关抗原的免疫学筛选及结果的初步分析 |
| 2.1 实验材料与实验方法 |
| 2.1.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.2 cDNA文库的免疫筛选 |
| 2.1.3 阳性噬菌体pBK-CMV的剪切及感染 |
| 2.1.4 阳性克隆的测序及分析 |
| 2.1.5 CrELISA方法检测骨肉瘤相关抗原特异性 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 骨肉瘤9901 细胞cDNA表达文库的免疫筛选结果 |
| 2.2.2 序列测定及计算机分析结果 |
| 2.2.3 新基因表达产物与正常及其它骨肿瘤血清的交叉反应 |
| 2.3 分析和讨论 |
| 2.3.1 肿瘤抗原的血清学识别 |
| 2.3.2 筛库方法的选择 |
| 2.3.3 实验方法的改进 |
| 2.3.4 筛选结果的初步分析 |
| 2.3.5 SEREX筛选结果用于主动免疫治疗的探讨 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
四、MAGE3-HLA-A2肽疫苗诱导胃癌患者自体CTL的研究（论文参考文献）
- [1]改造型TP53共享新抗原诱导抗肝癌作用的研究[D]. 叶春梅. 福建医科大学, 2021
- [2]非小细胞肺癌中TIGIT在CD8+T细胞的表达及作用机制研究[D]. 胡峰. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [3]5-氮杂-2’-脱氧胞苷（DAC）增强MAGE-A10抗原肽表达并改善MAGE-A10特异性CTL杀伤肺癌细胞的研究[D]. 李振华. 河北医科大学, 2020(01)
- [4]基于结构修饰及内源佐剂策略的肿瘤糖疫苗的设计及活性研究[D]. 宋成程. 东北师范大学, 2017(05)
- [5]MAGE-1短肽体外免疫效应的实验研究[D]. 金洪娟. 吉林大学, 2011(04)
- [6]肝素酶CTL表位多抗原肽（MAP）疫苗的设计及其抗肿瘤免疫效应研究[D]. 王国珍. 第三军医大学, 2011(12)
- [7]MAGE-A3、HLA-A1及HLA-A2在食管鳞癌中的表达及其相关性研究[D]. 王丽. 郑州大学, 2010(06)
- [8]大肠癌患者自体树突状细胞免疫治疗技术临床应用研究[D]. 鲍传庆. 苏州大学, 2010(10)
- [9]肿瘤细胞裂解物—结核分枝杆菌热休克蛋白65的抗肺癌作用[D]. 董博翰. 吉林大学, 2009(08)
- [10]骨肉瘤相关抗原的免疫学筛选及其生物信息学分析[D]. 廖博. 第四军医大学, 2009(12)