一、AVP(4-8)调控基因的新途径研究及大鼠CCTβ在昆虫细胞中的表达（论文文献综述）
孙佩瑶[1]（2021）在《棉花中5-羟色胺时空动态表达及其与棉花抗虫性的关系》文中认为为论证棉花中5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）的存在,并探究不同品种（系）棉花中的5-羟色胺时空表达量差异性及其与棉花抗虫性的关系。本试验建立了5-羟色胺在棉花中的HPLC检测方法;并运用此方法进行了对田间种植的不同品种（系）、不同时期棉花样品以及室内不同品种（系）、不同时期及烟粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）取食前后的样品进行5-羟色胺含量测定;并通过添加外源5-羟色胺饲喂法对棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）和绿盲蝽Apolygus lucorum（Hemiptera:Miridae）的生物测定,对5-羟色胺含量与棉花抗虫性的关系展开研究。随后结合已报道的参与合成5-HT的关键合成酶的CYP基因,筛选陆地棉Gossipium hirsutum中参与5-HT合成的候选基因,以酵母体外表达的方式对其进行基因功能鉴定。主要研究结果如下:1.建立了5-羟色胺在棉花叶片中的HPLC检测方法。5-羟色胺的检测结果,在0.5μg/m L～100μg/m L的范围内标准曲线的线性良好,R2值为0.9999;检测限为0.1μg/m L,定量限为0.5μg/m L。日内、日间精密度试验的相对标准偏差低于3%,样品回收率在95%～102%之间,不同浓度样品的相对标准偏差低于3%,平均相对标准偏差为1.56%。试验结果表明本实验建立的HPLC检测方法准确度高、灵敏度高,低干扰,适用于棉花样品中5-羟色胺的检测。2.采用HPLC检测方法不同品种（系）棉花在不同生长时期5-羟色胺含量。检测结果表明绿盲蝽Apolygus lucorum（Hemiptera:Miridae）抗性相关品系中,存在显着性差异（P<0.05）,5-羟色胺含量显示奥棉618>08生试5号>冀棉616>亚洲棉;而烟粉虱抗性不同的品种之间不存在差异性。5-羟色胺在不同品种的时空动态表达分析中显示,无论是烟粉虱抗性品系还是绿盲蝽抗性品系,在其生长周期内均表现为蕾期叶片中5-羟色胺含量显着性最高,花期又逐渐下降,铃期下降至苗期水平。以上表明,棉花体内5-羟色胺的表达与其抗虫性存在一定的关联,表现负相关,而且随着棉花植株的发育,5-羟色胺的含量也发生变化,其中蕾期显着性最高。3.采用HPLC方法检测烟粉虱取食前后棉花叶片中5-羟色胺含量的差异。三种烟粉虱不同抗性的棉花在被取食前5-羟色胺含量分别为4.46μg/g、10.30μg/g和8.88μg/g,烟粉虱取食24h后含量分别为20.77μg/g、17.54μg/g和10.69μg/g。其中科林13-68和科林13-93被烟粉虱取食前后5-羟色胺含量具有显着差异性。科林13-68差异性极显着（P<0.01）,5-羟色胺含量提升了4.65倍,科林13-93差异性显着,提升了1.70倍。试验结果表明,烟粉虱的取食导致棉花体内5-羟色胺含量的显着提升,其中烟粉虱敏感品系对此响应更加敏感强烈。4.通过混合饲料法,进行5-羟色胺对棉铃虫和绿盲蝽生物测定。棉铃虫生测试验结果显示,外源5-羟色胺的添加能够缩短棉铃虫化蛹周期,对照化蛹高峰集中在孵化后第17天左右,经处5-羟色胺理后,化蛹周期提前至第15天左右。此外低浓度的5-羟色胺可以显着提高棉铃虫的平均蛹重（P<0.01）,高浓度的5-羟色胺增大了棉铃虫的死亡率。绿盲蝽生测实验结果显示,5-HT的处理能够明显提前绿盲蝽的成虫羽化时间,使得同一时间内,处理组中成虫羽化率显着高于对照组,且处理组绿盲蝽死亡率显着低于对照组。5.结合已报道的水稻中参与合成5-HT的关键合成酶的CYP71A1基因,筛选陆地棉Gossipium hirsutum中参与5-HT合成的候选基因,筛选出的相似度较高的基因为Cot AD＿50968、Co-t AD＿22317、Cot AD＿66315和Cot AD＿01894,以酵母体外表达的方式对其进行基因功能鉴定。经体外基因酶活测定,发现筛选出的5个基因不表达色胺-5-羟化酶（Tryptamine 5-hydroxylase,T5H）不能将色胺催化生成为5-羟色胺。
高炳淼[2]（2012）在《芋螺毒素基因重组表达研究》文中提出芋螺毒素（Conotoxins,CTX）具有序列超变、二硫键丰富、结构新颖、靶点广泛、生物毒性强等特点。它们既可以作为生物体内具有重要生理功能靶点的探针和“解码器”,又可作为海洋新药及新药的先导化合物来研究与开发。目前随着海南产芋螺资源日益濒危,尽快抢占药用海洋生物芋螺的基因资源制高点,具有非常重要的战略意义。深入研究芋螺毒素的生物合成法在海洋生物医药领域既有重要的理论价值,又具有广阔的应用前景和巨大的潜在经济效益。人工化学合成芋螺毒素成本高、毒性大、氧化折叠后的异构体产物异常复杂,难以纯化且产率很低。通过基因工程方法获得廉价重组芋螺毒素,可望解决芋螺毒素天然资源匮乏、分离纯化困难、化学合成昂贵等难题。为此我们根据芋螺毒素基因设计了多条合成引物,分别克隆到四种不同表达系统的表达载体中,探索芋螺毒素基因在四种表达系统中的表达效果,为芋螺毒素的结构和功能研究奠定基础。本研究主要包括以下几个部分：1.芋螺毒素基因GeXIVAWT在大肠杆菌中的表达根据芋螺毒素基因GeXIVAWT按照大肠杆菌密码子偏好设计了GeXIVAWT-P1/2和GeXIVAWT-P3/4两对引物,退火后形成基因GeXIVAWT-12和GeXIVAWT-34,其中基因GeXIVAWT-12引入终止密码子表达后具有完整的C末端；基因GeXIVAWT-34未引入终止密码子表达后带有His-tag便于重组蛋白的纯化。它们分别与双酶切的表达载体pET22b（+）连接,成功构建了两个表达载体pGeXIVAWT-12和pGeXIVAWT-34.将这两个表达载体转化进大肠杆菌BL21（DE3）中,利用IPTG进行诱导表达,结果重组芋螺毒素GeXIVAWT-12/34均以包涵体的形式获得了高效表达,经超滤管纯化的rGeXIVAWT-12和亲和柱纯化的rGeXIVAWT-34进一步RP-HPLC分析并质谱鉴定发现大肠杆菌信号肽未能有效切除,其中rGeXIVAWT-34经条件优化后的最大表达量为61.6mg/L。通过稀释法进行体外复性后获得具有生物活性的重组芋螺毒素,活性实验表明重组芋螺毒素能够抑制昆虫细胞Sf9的生长,并具有剂量效应。2.芋螺毒素基因MrVIB在大肠杆菌中的表达根据芋螺毒素基因MrVIB设计了未进行密码子优化的引物MrVIB-P1/2,退火后形成基因MrVIB-12,其未增加终止密码子表达后具有His-tag便于重组蛋白的纯化。它与酶切的表达载体pET22b（+）连接,成功构建了表达载体pMrVIB-12。将这个表达载体转化进大肠杆菌BL21（DE3）中,利用IPTG诱导和表达条件优化,结果重组芋螺毒素MrVIB获得了分泌表达,经亲和层析纯化和进一步RP-HPLC分析后质谱鉴定结果表明信号肽被大肠杆菌内源性的信号肽酶成功地切除,且在细胞周质中形成正确的三个二硫键。动物实验模型表明重组芋螺毒素MrVIB比非选择性镇痛药具有很强的缓解小鼠疼痛的药理学作用。3.芋螺毒素基因MrVIB在毕赤酵母中的表达根据芋螺毒素基因MrVIB设计了4对引物分别为MrVIB-P5/6.MrVIB-P7/8、 MrVIB-P9/10和MrVIB-P11/12,其中MrVIB-P9/10和MrVIB-P11/12两对引物按照毕赤酵母偏爱密码子进行优化。四对引物分别退火后形成基因为MrVIB-56、 MrVIB-78、MrVIB-910和MrVIB-1112,其中基因MrVIB-56和MrVIB-910未引入终止密码子表达后带有His-tag便于后期目的蛋白的纯化；基因MrVIB-78和MrVIB-1112引入终止密码子表达后具有完整的C末端。它们分别与双酶切的毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,成功地构建了四个酵母表达载体分别为αA-MrVIB-56、αA-MrVIB-78、αA-MrVIB-910和αA-MrVIB-1112。将构建好的表达载体线性化后电转化毕赤酵母菌GS115,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后获得了高拷贝酵母重组子,并利用甲醇进行了诱导表达研究。初步探索了诱导表达的条件,结果表明选择培养基MGY/MM比BMGY/BMMY诱导表达效果好。表达产物经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,结果表明带组氨酸标签的重组芋螺毒素MrVIB-56和MrVIB-910获得了表达,且优化密码子的重组芋螺毒素MrVIB-910的表达量略有提高。由此可知,芋螺毒素基因MrVIB已在毕赤酵母中获得成功表达,但表达量很低,有待于进一步的优化表达条件并进行分离纯化后质谱鉴定和生物活性研究。4.芋螺毒素基因MrVIB在昆虫细胞中的表达根据芋螺毒素基因MrVIB序列,设计了两条引物MrVIB-P13/14,退火后形成基因MrVIB-1314,并引入终止密码子,表达的重组芋螺毒素可获得完整的C末端。将引物退火后获得基因,连接到载体pFastBacTMTB上,成功构建了重组载体pFastBac-MrVIB-1314.然后将这个表达载体转化DH1OBac感受态大肠杆菌,通过辅助质粒Hlper帮助将基因MrVIB整合到穿梭载体Bacmid中,获得重组杆状病毒载体Bacmid-MrVIB-1314。通过脂质体介导方法将重组杆状病毒载体Bacmid-MrVIB-1314转染昆虫细胞Sf9,使杆状病毒载体在昆虫细胞内复制并表达重组芋螺毒素。表达产物经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,结果表明杆状病毒Bacmid-MrVIB-1314在感染的昆虫细胞中获得了表达,具体的验证还需要进一步进行分离纯化后质谱鉴定及生物活性研究。5.芋螺毒素基因MrVIB在哺乳动物细胞中的表达根据芋螺毒素基因MrVIB设计引物两对引物MrVIB-P17/18和MrVIB-P19/20,退火后分别形成基因MrVIB-1718和MrVIB-1920。它们分别与双酶切的表达载体pcDNATM4/Max-HisA和pcDNATM3.1/V5-HisA连接,成功地构建了两个重组表达载体pcDNA4-MrVIB-1718和pcDNA3.1-MrVIB-1920。利用脂质体介导法将这两个重组表达载体转染CHO细胞,经过抗生素G418筛选得到具有遗传稳定性的细胞CHO-1718和CHO-1920,能够稳定表达重组芋螺毒素。表达产物经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,结果表明重组芋螺毒素MrVIB-1718和MrVIB-1920在CHO细胞中以分泌的方式进行表达,有利于表达后的翻译修饰,可形成天然芋螺毒素的结构与生物活性。具体的验证还需要进一步进行分离纯化后质谱鉴定及生物活性研究。综上所述,芋螺毒素基因分别在目前常用的大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒和哺乳动物细胞等四种表达系统中获得表达,为探索和建立高活性、低成本、安全性高的大规模生产重组芋螺毒素的外源表达系统奠定了基础。
覃宇翔[3]（2011）在《OPCML蛋白在杆状病毒—昆虫系统中的表达及其活性研究》文中研究指明[研究背景和目的]OPCML是定位于染色体11q25的基因,包含有7个外显子,跨越600kb,分子量约为60kd,表达的蛋白位于细胞膜,属于鸦片受体类的细胞粘附因子[1],广泛存在于神经系统细胞中,在调节鸦片受体和信号传导上具有重要的作用,促进细胞分化以及改变细胞膜性质。之前绝大多数的研究主要集中在中央神经系统细胞中细胞之间的粘附、识别及信号传导上,通过激活腺苷酸环化酶（AC）和相关离子通道而发挥作用[1]。已有的研究证实人染色体11q25的LOH（loss-of-heterozygosity）与卵巢上皮癌的不良预后呈正相关,因此推测在这个区域里存在与卵巢上皮癌相关的抑癌基因（TSG）,OPCML则是这些候选的TSG之一。本研究利用连接目的基因OPCML的重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞,鉴定OPCML基因在SF9昆虫细胞中的表达,对其表达条件进行初步探索及最佳的蛋白纯化方法,并验证其对卵巢癌细胞系A2780的增殖、粘附能力及细胞周期的抑制作用。[材料和方法]试验一:OPCML基因全长扩增和携带其基因的昆虫表达载体的构建参考GenBank上发表的OPCML基因序列设计引物,从CD1小白鼠脑组织中克隆OPCML基因片段,将OPCML基因连接到PACGp67A质粒上,获得OPCML-PACGp67A质粒,利用PCR、酶切技术检测质粒连接成功。试验二: OPCML蛋白在SF9昆虫细胞中的表达选择生长状态良好的SF9昆虫细胞,用重组杆状病毒OPCML-PACGp67A感染,观察感染症状;利用SDS-PAGE分析蛋白条带分子量大小;以不同剂量的病毒感染液感染SF9细胞,感染的持续时间不同,选择表达量高的感染时间作为最佳表达时间;利用Western blot技术检测OPCML基因在昆虫细胞中的表达。试验三:OPCML与卵巢癌细胞增值、粘附、生长周期的体外实验将从昆虫细胞中大量表达、纯化的OPCML蛋白直接作用于体外培养的卵巢上皮癌细胞A2780,检测作用前后增殖指数、生长曲线、细胞周期等生物学行为的变化。[结果]OPCML基因连接到杆状病毒载体PACGp67A质粒上,获得OPCML-PACGp67A质粒,利用PCR、酶切技术检测质粒连接成功。重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞感染时间在5-6天表达量最高,成功表达OPCML蛋白并进行OPCML蛋白纯化。为进一步研究和应用OPCML蛋白打下了基础。流式细胞数测定细胞周期结果显示,OPCML蛋白并不影响A2780细胞的生长周期,细胞增殖实验也显示OPCML蛋白对卵巢癌细胞增殖无明显抑制作用。但细胞粘附实验结果显示,OPCML蛋白可以提高A2780细胞的粘附力,但需有足够的蛋白浓度。[结论]1.克隆OPCML基因开放阅读框序列,并成功构建真核表达重组质粒OPCML-PACGp67A。2.感染重组病毒的昆虫SF9细胞大量高效表达OPCML蛋白,经过纯化后,Western-blot验证所表达的蛋白与理论OPCML蛋白吻合。3.OPCML蛋白对A2780细胞的增殖无抑制作用,但能增加细胞间的粘附。4.OPCML作为一个抑癌基因,对卵巢的靶向治疗可能存在很大的潜力。
廖仲磊[4]（2008）在《鸡传染性喉气管炎病毒HN1株gB基因核酸疫苗的构建与鸡IL-18联合免疫效力观察》文中研究表明鸡传染性喉气管炎（ILT）是由鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）引起鸡的一种急性、高度接触性上呼吸道传染病,呈全球性流行,是危害养禽业的重要疫病之一。目前国内外防制本病普遍采用弱毒疫苗。这些疫苗的毒力普遍偏强,可以在鸡体内潜伏感染,而且在鸡体传代过程中毒力返强。因此,研制更安全而有效的疫苗,将有利于彻底控制乃至根除ILT。DNA疫苗作为第3代疫苗,因其既有亚单位疫苗的安全性,又有减毒活疫苗的有效性而受到研究人员的瞩目。但是DNA疫苗诱导机体产生的抗体水平低,还不能完全有效抵抗致死剂量病原体的攻击,因此,本研究采用PCR技术从河南省分离的ILTV HN1株DNA中扩增gB基因,构建gB基因重组真核表达质粒,并将其与鸡IL-18基因重组真核表达质粒联合免疫SPF鸡,探索ILTV HN1株gB基因的免疫原性以及鸡IL-18的免疫增强作用,以期为更好地防制ILT提供新的思路。研究内容如下：1.根据已发表的ILTV SA2疫苗株gB基因序列（M64927）设计、合成了1对引物,以ILTV HN1株基因组DNA为模板,从河南省分离的ILTV HN1株DNA中扩增gB基因,并进行克隆和测序。结果表明,获得了ILTV HN1株gB基因,全长为2629bp,包含一个完整的开放阅读框,共编码873个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有8个潜在的N-糖基化位点,有12个与二硫键形成有关的半胱氨酸。序列分析表明,ILTV HN1株gB基因与GenBank中读取的澳大利亚SA2疫苗株、辽宁疫苗株、烟台株、美国632强毒株、英国Throne强毒株gB基因核苷酸序列同源性为99%以上,与ILTV-SA2株gB基因比较发现,ILTV HN1株gB基因核苷酸序列在第89位均缺失1个碱基G,而在第102位又都插入1个碱基A,从而引起该毒株gB基因推导的氨基酸序列中第28-32位5个氨基酸的移码突变。2.根据真核表达载体pcDNA3.1（+）和ILTV gB全基因核苷酸序列,设计、合成1对引物,PCR扩增ILTV gB全基因。将EcoRⅠ和XhoⅠ酶切获得的gB基因片段克隆到经同样处理的真核表达载体pcDNA3.1（+）中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/gB（简称pgB）。将pgB质粒转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,RT-PCR表明转染细胞中含gB基因的mRNA,间接免疫荧光检测表明目的蛋白在CEF中得到了表达。3.通过RT-PCF技术,无需用非特异性免疫原如ConA、PHA等刺激分离的脾淋巴细胞,直接从罗曼鸡脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增鸡IL-18全基因,并克隆和测序。结果表明,鸡IL-18基因全长为597bp。与GenBank中查得的鸡IL-18基因进行比较发现,罗曼鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致。将该基因片段重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL-18（简称pIL-18）。经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ叹酶切、PCR扩增和基因测序,证实鸡IL-18全基因被正确重组到pcDNA3.1（+）真核表达质粒上；将pIL-18质粒转染Cos7细胞,转染细胞中含鸡IL-18基因的mRNA,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用。4.为了检测这2个质粒是否可以诱导动物机体产生特异性免疫,分别用这2个重组质粒和载体质粒pcDNA3.1（+）以及减毒疫苗免疫接种21日龄SPF鸡,免疫分组（A）pgB,（B）pIL-18,（C）pgB和pIL-18,（D）减毒疫苗和pIL-18,（E）减毒疫苗,（F）pcDNA3.1（+）,（G）Control。免疫2次,间隔为2周,每次每只鸡的免疫剂量为100μg。以MTT法检测鸡外周血淋巴细胞经丝分裂原ConA刺激后的增殖反应活性,Real-time PCR检测细胞因子IFN-γ和IL-2的表达水平、流式细胞术检测外周血CD4+T、CD8+T和TCR+T细胞的变化及间接ELISA法检测血清抗体水平。结果表明,ILTV gB基因免疫诱导机体产生了较强的淋巴细胞增殖反应,免疫组外周血中CD4+T、CD8+T和TCR+T细胞明显高于对照组,含IL-18基因的两组（C和D）诱导了高水平的IFN-γ和IL-2表达,载体质粒和空白对照组没有变化,血清抗体在免疫后第2周发生阳转,而对照组无相应变化。这是ILTV基因gB基因和鸡IL-18基因免疫研究的首次报道。第2次免疫后3周,所有鸡以ILTVHN1株强毒0.4mL进行攻毒。攻毒后,非免疫鸡全部发病,并在第2天出现死亡,免疫组部分发病,ILTV HN1株gB基因单独或与鸡IL-18基因联合免疫的保护率分别为79%、86%,而对照组仅为7%。这表明ILTV HN1株gB基因和鸡IL-18基因联合免疫提供了较强的免疫保护,这为ILTV的防制开辟了新的途径。
王彦彬[5]（2008）在《猪干扰素a和γ在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达及重组蛋白初步应用》文中提出一、为获得猪干扰素α（Porcine interferon alpha,PoINF-α）和干扰素γ（Porcine interferon gamma,PoINF-γ）基因,本研究参照Genebank已发表的猪干扰素α和干扰素γ基因序列,分别设计一对引物,应用反转录多聚酶链式反应,从有丝分裂原刀豆素（ConA）诱导的猪脾淋巴细胞总RNA中扩增出猪干扰素α和干扰素γ基因,将扩增片段通过T-A策略连接到克隆质粒pGEM-T载体上,经PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定,证明克隆片段为猪干扰素α和干扰素γ基因。与网上公布的猪干扰素α和干扰素γ基因序列进行比较,其序列同源性分别99.8%和100%。从而为进一步应用该基因在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中进行表达奠定了基础。二、杆状病毒/昆虫细胞是被广泛用来表达外源基因的表达系统,但许多表达的外源蛋白存在于细胞内,不能分泌到细胞上清。Tessier研究发现蜂素信号肽能够介导外源基因进行分泌表达,但又有该信号肽无效的报道,因此本课题的目的是研究蜂素信号肽对猪干扰素α在昆虫细胞中表达是否产生影响。根据蜂素信号肽序列,设计二条部分重叠的引物,通过PCR扩增出蜂素信号肽基因,然后与编码成熟猪干扰素α的基因片段通过PCR进行连接获得嵌合体基因片段,同时扩增出即不包含蜂素信号肽又不包含原有信号肽的仅编码成熟猪干扰素α的基因片段,将二个片段分别插入pFastBacTMDual载体,置于pH启动子控制下,酶切和测序验证正确后,转化到DH10Bac宿主菌,在三个抗性和IPTG、X-gal的共同作用下,通过定点转位获得穿梭载体bacmid。重组bacmid经电泳和PCR鉴定,然后转染昆虫细胞,获得重组杆状病毒。间接免疫荧光和Western blot鉴定重组蛋白的表达,结果表明,带有蜂素信号肽的猪干扰素α在昆虫细胞中实现分泌表达,而不带蜂素信号肽的猪干扰素α重组蛋白主要分布在昆虫细胞内。从而证明蜂素信号肽能够介导猪干扰素α在昆虫细胞中的分泌表达。通过猪水泡性口炎病毒（VSV）在猪肾细胞（PK-15）致病变抑制作用检测其抗病毒活性,表明带有蜂素信号的重组杆状病毒感染昆虫细胞获得的重组蛋白对VSV表现出较高的抑制活性,上清的抗病毒效价达到1.07×106 U/mL。昆虫细胞裂解液的抗病毒效价为3.15×105 U/mL。上清中抗病毒活性为细胞中的抗病毒活性近3.4倍。不带蜂素信号肽的重组杆状病毒感染昆虫细胞获得的重组蛋白,细胞中的抗病毒活性为3.82×105 U/mL,上清中的抗病毒活性为9.67×104 U/mL。细胞中的抗病毒活性高于上清中的抗病毒活性。对比带蜂素信号肽和不带蜂素信号肽对猪干扰素α在昆虫细胞中的表达,蜂素信号肽能够介导猪干扰素α在昆虫细胞中达到分泌型表达,并且对表达具有增强作用,增强能力达到近3倍。三、为获得重组猪γ干扰素,本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪干扰素γ基因插入供体质粒pFastBacTMDual多克隆位点,置于pH启动子控制下,为实现分泌型表达,昆虫细胞可识别的蜂素信号肽取代猪α干扰素原有信号肽构建嵌合体基因,并在C端融合6个组氨酸标签以便于纯化。将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞,在三个抗性作用下,通过蓝白斑筛选,获得重组Bacmid穿梭质粒,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。猪γ干扰素重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blot证明在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞（PK-15）上抑制水泡性口炎病毒（VSV）致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性,结果表明:昆虫细胞上清的抗病毒效价达到6.67×105 U/mL。重组猪γ干扰素的获得为进一步作为免疫佐剂对各种疫苗的增强作用,以及用作治疗剂在临床上治疗病毒性疫病等方面的研究奠定了基础。四、猪干扰素包含有α、β和γ三种,其中α、β属于Ⅰ型,具有较强的抗病毒作用,是由受病毒感染的多种体细胞产生,γ属于Ⅱ型干扰素,除具有较强的抗病毒作用外,还具有较强的免疫调节作用,主要是由被激活的T细胞和NK细胞产生。Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素联合使用,具有协同作用,比单独使用其中一种具有更强的抗病毒效果。为获得Ⅰ型和Ⅱ型复合型干扰素重组蛋白,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PoINF-α和PoINF-γ基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTMDual中,分别置于pH和p10启动子控制下,为达到分泌型表达,二个基因的原有信号肽通过PCR技术替换为昆虫细胞可以识别并剪切的蜂素信号肽。获得重组转移载体后,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经蓝白菌落筛选获得含有二个外源基因的重组穿梭载体rBacmid,经脂质体介导转染昆虫细胞Sf9,获得包含二个外源基因的重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western-Blotting分析可见大小约为19kDa-21kDa的特异性条带及其它不同糖基化异构体。间接免疫荧光发现荧光信号主要分布在细胞膜上,证明是分泌型表达。抗病毒活性检测发现重组蛋白具有极强的抑制VSV病毒在PK-15细胞上增殖活性,上清抗病毒达到3.24×107 U/mL,细胞中抗病毒活性为5.86×106 U/mL。五、猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的主要导致怀孕母猪后期流产、早产、死胎和木乃伊胎产弱仔增多,仔猪出现咳嗽、呼吸困难、呼吸急促等呼吸道症状和断奶前死亡率增高的一类疾病,在世界范围内广泛存在,给养猪业创成巨大的经济损失。许多报道证明干扰素对猪蓝耳病病毒具有抑制作用。本研究制备的复合型干扰素在Marc-145细胞上对猪蓝耳病病毒是否具有抑制作用。通过致病变抑制作用进行检测,结果表明复合型干扰素具有较强的抗病毒作用,干扰素粗制品经210稀释后,在Marc-145细胞上能够抑制猪蓝耳病病毒100TCID50的致细胞病变作用。
窦永喜[6]（2008）在《猪IFN-γ及其受体的生物学功能研究》文中提出IFN-γ是由机体内活化的T淋巴细胞和NK细胞产生的一种糖蛋白,丝裂原以及抗原特异性刺激的T细胞克隆也可产生和分泌。IFN-γ除具有抗病毒、抗胞内寄生菌、抗胞内寄生原虫、抗细胞增殖的作用外,还具有独特而强大的免疫调节功能,可促进MHCⅡ类抗原的表达,增强APC与T细胞的相互作用,增强Th细胞和CTL转化的能力等。IFN-γ有较为严格的种属特异性,不同物种之间通用使其活性降低或失去作用。IFN-γ活性形式为两条单体链结合形成的同型二聚体形式,单体没有生物学活性。IFN-γ作为机体免疫应答的产物,一方面是机体发挥免疫功能,清除胞内寄生病原体不可缺少的成分,与疾病的发生、发展有着密切的关系;另一方面,机体内IFN-γ分泌过量,可引起病理性反应。由于IFN-γ具有上述诸多重要的生物学活性,故其在疾病的诊断、治疗和预防等方面具有广阔的应用前景。但是,IFN-γ在临床应用时可引起发热、寒战、恶心等一系列的副作用,而且有些不良反应是不可逆的损害,这限制了其在临床中的应用。因此,开展新型、低毒副作用的pIFN-γ研究意义重大。此外,IFN-γ必须与受体相结合,通过受体的介导才能发挥其生物学效应,对其受体的研究将有利于明确IFN-γ的作用机制,进而发现疾病治疗和预防的新途径。本论文在对克隆的pIFN-γ基因进行适当的改造,去除其信号肽序列,将该基因与pGEX-4T-1载体上的谷胱甘肽S-转移酶（GST）拼接,然后在原核表达系统中进行表达,并对其诱导表达条件、蛋白纯化方法进行系统研究,最终获得了纯度高达95%的GST-pIFN-γ融合蛋白,产量为0.40.5g/L培养液。体外试验证实该重组蛋白具有较高的生物活性,可有效抑制PRV（DNA病毒）和FMDV（RNA病毒）的复制,并且具有稳定、不宜降解和低毒副作用的优点。开展了重组pIFN-γ体外抗弓形虫研究,结果表明pIFN-γ可诱导猪腹腔巨噬细胞产生抗虫作用,且随pIFN-γ量的增加抗弓形虫作用越明显,但任何浓度的重组pIFN-γ对弓形虫入侵PK15细胞无明显影响。对pIFN-γ诱导永生化细胞（PK15细胞）凋亡的作用及其对细胞端粒酶的影响进行了研究,结果发现在高浓度pIFN-γ的长时间诱导下,PK15细胞端粒酶显着下降,因此PK15细胞（肿瘤样细胞）发生凋亡,具体表现为细胞变圆脱落,DNA出现典型的“梯状带”,荧光染色可发现细胞核固缩,有凋亡小体出现;但如果用低浓度pIFN-γ进行诱导作用,PK15细胞端粒酶明显升高;该研究结果为IFN-γ临床治疗肿瘤提供了理论依据和指导。以表达纯化的GST-pIFN-γ作为抗原免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞和SP2/0细胞融合,再经纯化的GST-pIFN-γ和的带组氨酸标签pIFN-γ作为包被抗原进行筛选,最终获得2株分泌pIFN-γ单抗的杂交瘤细胞株,经鉴定这两株单抗抗体亚类均属于IgG2a,轻链为κ型,对杂交瘤细胞株的染色体组型、单抗的稳定性及其识别的抗原位点等进行分析,结果证明所获2株单抗均表现稳定,可满足常规实验的要求。在对不同动物IFNGR两条链基因序列比对基础上,选择保守区段作为引物;然后分离猪外周血淋巴细胞,经刺激后提取细胞总RNA,应用RT-PCR方法克隆了猪IFNGR两条链基因,序列测定表明猪IFNGR1基因ORF为1413bp,共编码470个氨基酸;猪IFNGR2基因ORF为1110bp,共编码369个氨基酸。对不同物种IFNGR序列比较发现,不同物种间的差异比较大,据此推测这可能是IFN-γ种属特异性的重要原因之一。然后利用分子生物学软件对两条链进行结构预测,设计引物扩增猪IFNGR胞外区片段并对其进行原核表达,经鉴定该基因在原核中得到正确表达;开展了两条受体链胞外区对pIFN-γ抗病毒活性的影响研究,发现猪IFNGR1胞外区可降低pIFN-γ抗病毒活性,而IFNGR2胞外区可增强pIFN-γ抗病毒活性,由此可知猪IFNGR两条链均可结合pIFN-γ;此外,推测猪IFNGR1具有信号转导功能且是IFN-γ信号转导的主要执行者,而IFNGR2则在IFN-γ信号转导中起次要作用或没有信号转导的能力。
邓尚龙[7]（2008）在《石斑鱼抗菌肽Hepcidin基因的克隆、表达与抗菌活性研究》文中研究指明本研究根据鲈鱼抗菌肽Hepcidin基因（GenBank登录号AY5472821）的cDNA序列设计了一对特异引物，利用RT-PCR技术从石斑鱼肝脏中扩增到一条基因片段，并采用RACE技术，获得了该基因的全长592bp的cDNA序列（GenBank登录号：DQ177321）。该基因含有一个261bp碱基的阅读框（ORF），可编码87个氨基酸的多肽，包括24个氨基酸的信号肽、40个氨基酸的优势域和23个氨基酸的成熟肽（内含4个半胱氨酸）；预测成熟肽分子量约为2465．8Da，等电点PI为5．97，是一种阴离子肽。BLAST检索表明，该多肽与其他肽类的同源性较低，但与多种鱼类来源的Hepcidin抗菌肽的同源性较高，推测是鱼类Hepcidin抗菌肽家族的一个新成员。运用PCR和反向PCR技术扩增获得其基因组DNA序列，与已知Hepcidin基因的结构组成相同，均由3个外显子和2个内含子组成。第一个外显子包含5′UTR、信号肽和部分优势域编码序列，第二个外显子仅编码部分优势域，而第三个外显子编码部分的优势域和成熟肽序列以及3′UTR。分析基因组DNA上游区域，发现含有多个调控序列，包括TATA框和cap帽子结构，确认的转录起始位点与扩增得到的Hepcidin cDNA的5′端起始序列一致；另外还发现了上游调控区内多种转录因子的结合位点。将不含信号肽的该基因cDNA编码序列与融合表达载体pTrc-CKS连接，转化入E．coli TOP10F′表达菌株，IPTG诱导后得到的表达产物主要以包涵体为主，上清中的部分可溶性蛋白经过金属鏊合层析纯化后，得到较高纯度的融合蛋白，经重组人鼻病毒14亚型P3C蛋白酶酶切，获得了分子量约为14 kDa的融合表达目的蛋白的酶切产物。研究了融合表达蛋白酶切产物对4种细菌的抗菌作用，发现该蛋白能够选择性抑制部分革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌）和革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）的生长，但对表皮葡萄球菌无抗菌活性；65℃水浴60 min后仍对溶壁微球菌具有抗菌活性，表明该蛋白具有热稳定性。综上分析，该基因编码的蛋白质具有显着的Hepcidin抗菌肽的特征，是首次从石斑鱼肝脏中分离到的一条编码Hepcidin抗菌肽的新基因。本研究同时也为基因工程重组生产石斑鱼抗菌肽和该抗菌肽的应用研究奠定基础。
杨小艳[8]（2008）在《大鼠Smad7真核表达质粒的构建及在肝星状细胞中抗纤维化特性研究》文中认为目的:肝纤维化（HF）是多种慢性肝病病情发展的共同病理基础和病理特征,是临床肝病向肝硬化发展的中间环节,是可逆性病变,以细胞外基质（ECM）增加为特征。转化生长因子β（TGF-β）是肝纤维化发生发展过程中最重要的促进因子,是ECM沉积的关键介质,肝星状细胞（HSC）活化则是其中心环节。Smad蛋白是信号转导蛋白,介导TGF–β由细胞膜进入细胞核,Smad7负性调控TGF-β的信号转导。本研究构建并鉴定大鼠Smad7基因pcDNA3.1（+）真核表达质粒,脂质体介导转染HSC-T6细胞,旨在观察外源Smad7基因可否有效转染肝星状细胞并初步研究其抗纤维化的效果,为进一步探讨Smad7在TGF-β/Smad信号转导中的抗纤维化机制及用于肝纤维化治疗做准备。方法:根据大鼠Smad7基因全序列,设计特异性引物,TRIzol法抽提冰冻大鼠肝组织总RNA,RT-PCR获得Smad7 cDNA片段,应用分子克隆技术构建Smad7/pcDNA3.1（+）重组质粒,双酶切证实的阳性克隆进行测序鉴定。脂质体介导转染HSC-T6,分为正常对照、空质粒组及转染组,运用免疫细胞化学染色法检测HSC中Smad7及α-SMA定位和表达,分别采用RT-PCR法和Western-blot法检测HSC中Smad7 mRNA及蛋白水平的表达;Western-blot检测α-SMA表达;RT-PCR检测TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达。结果:成功构建大鼠Smad7真核表达质粒;Smad7及α-SMA在胞浆中表达,α-SMA表达阳性提示HSC-T6被激活;Smad7转染组与正常对照、空质粒组比较:Smad7mRNA表达显着增加1.053±0.009 （P=0.009）,蛋白水平明显上调0.083±0.016（P=0.020）,α-SMA蛋白水平明显下降0.518±0.085 （P=0.032）;Smad7转染组TGF-β1、Ⅰ型胶原mRNA表达降低0.961±0.013、0.592±0.096 （P=0.000;P=0.004）;Ⅲ型胶原mRNA表达差异无统计学意义0.910±0.018 （P=0.950）。正常对照、空质粒组Smad7mRNA和蛋白水平、α-SMA蛋白水平、TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达差异无统计学意义（P=0.944,0.644,0.612,0.595,0.967,0.950）。结论:1、大鼠Smad7/PcDNA3.1（+）真核细胞表达重组质粒构建成功;2、Smad7及α-SMA在细胞浆中表达,α-SMA表达阳性提示HSC-T6被激活;3、外源Smad7可有效转染HSC-T6,显着上调Smad7mRNA和蛋白表达水平;4、外源Smad7可使HSC-T6细胞中的α-SMA蛋白表达减少,即活化HSC数量减少,提示Smad7过表达在一定程度上可以使ECM的合成下降;5、Smad7过表达影响TGF-β1及Ⅰ型胶原mRNA的表达水平,提示其参与TGF-β/Smad信号转导,可能在一定程度上具有抗纤维化的生物学活性。
肖波[9]（2008）在《腺病毒介导重组人蛋白C及人神经生长因子Beta基因在兔乳腺中高效表达的研究》文中提出基因工程蛋白药物的生产是目前国际上研究的热点。如何经济、高效的生产这类蛋白也一直是人们努力探索的一个问题。目前,虽然有细菌、真菌、昆虫细胞、动物细胞、转基因植物、转基因动物等几种外源蛋白表达系统,但他们均存在着各种缺陷。为探讨利用动物乳腺作为表达系统来生产外源蛋白,本研究选取了两种药用蛋白,即一种是存在于人血浆中的药用蛋白——人蛋白C（hPC）,另一种是用于治疗神经性病变的细胞因子——人神经生长因子beta（hNGF-β）作为目标蛋白,通过腺病毒介导,使这两种蛋白的cDNA基因在兔乳腺中高效表达,并在兔乳汁中获得有功能的目标蛋白。从而为腺病毒介导外源基因在动物乳腺中高效表达重组药用蛋白方法的进一步开发和生产提供技术和理论依据。本研究主要包括以下内容:（1）提取人胚胎脏器组织中的总RNA,经RT-PCR,获得用于表达的hPC和hNGF-β的cDNA基因。通过对这两种cDNA进行测序分析,并将二者所编码的氨基酸序列与已发表的相应氨基酸序列进行比对,确定所扩增的cDNA的正确性。（2）真核表达载体的构建及其外源基因在培养细胞中的表达,证实构建入表达载体中的hPC和hNGF-βcDNA基因可用于表达;（3）细菌内同源重组法构建重组腺病毒载体;（4）重组腺病毒载体在HEK293细胞中的包装及重组腺病毒的扩增;（5）重组腺病毒中的外源基因在培养的乳腺上皮细胞中的表达;（6）将重组腺病毒注射到兔乳腺感染乳腺上皮细胞,分别检测兔乳汁中重组人蛋白C（rhPC）和重组人神经生长因子Beta（rhNGF-β）的表达情况,并经相应的活性鉴定,确定所表达蛋白有无相应的功能;（7）对所构建的两种表达rhPC载体进行表达效果的比较,通过优化载体进一步完善该技术体系。主要研究结果如下:（1）通过RT-PCR法从人胚胎心脏和肝脏组织中分别获得了hNGF-β和hPC的cDNA基因。经DNA测序分析,所得hPC和hNGF-β的cDNA与Genbank中的相应序列一致。通过对这两种cDNA所编码的氨基酸序列分析,二者均与已发表的两种蛋白的氨基酸序列一致。（2）以pcDNA3.1+、pIRES和pShuttle-CMV为基础质粒,构建了含有hPC及hNGF-βcDNA基因的真核表达载体p3PG和p3NG以及穿梭表达载体pShPG和pShNG。其中,载体中p3PG和p3NG含有新霉素抗性筛选标记基因和GFP报告基因,可对已转染的哺乳动物细胞进行抗性筛选,也可对目标蛋白基因的表达进行实时观测;pShPG、pShNG中含有GFP报告基因,可对目标蛋白基因的表达进行确定,提高了检测目标蛋白基因表达的效率,为rhPC及rhNGF-β的表达研究奠定了基础。（3）构建了含有hPC cDNA基因的穿梭表达载体pShPF,内含有促进hPC向成熟转变所需蛋白Furin的cDNA基因。（4）通过不同表达载体在CHO和HEK293细胞株中的表达,证实了所构建载体在哺乳动物细胞中表达的可能性,获得了hPC和hNGF-βcDNA在细胞的体外表达,为后面含hPC基因和hNGF-β基因的腺病毒载体的构建奠定了基础。（5）将所构建并经鉴定正确的pShNG、pShPG和pShPF载体用Pme I酶切线性化,然后将所获得的线性化片断与Adeasy质粒共转化大肠杆菌BJ5183,或者直接用线性化的pShNG、pShPG和pShPF直接转化处于感受态且含有Adeasy质粒的大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组的方法获得了重组AdPG、AdPF和AdNG腺病毒载体。验证了“两步转化法”可大幅度提高细菌内同源重组制备腺病毒载体的效率。（6）在培养的HEK293细胞中,进行了AdPG、AdPF、AdNG重组腺病毒的包装与扩增。通过重组腺病毒在兔乳腺上皮细胞中的表达研究,证实了重组腺病毒可感染乳腺上皮细胞并且表达目标蛋白。（7）通过对兔乳腺的感染试验,高效表达了具有生物活性的rhNGF-β和rhPC, rhNGF-β的最高表达量为346μg/mL,rhPC的最高表达量达到958μg/mL。从而证实了以腺病毒为载体导入动物乳腺表达外源蛋白的可行性。（8）通过对所构建的两种表达hPC的载体进行表达效果的比较,证实了furin对成熟hPC的表达起作用,但不如报道的效果较好,其原因可能是由于所构建的载体的差异而使furin表达量不同,从而造成hPC原肽不能完全被降解成成熟的hPC。本研究利用腺病毒为载体,在兔乳腺中高效表达了rhPC和rhNGF-β。通过将furin基因构建入腺病毒载体中hPC基因的下游,促进了rhPC的成熟表达,表明通过优化腺病毒载体的构建可促进动物乳腺成熟表达外源基因的蛋白。rhPC和rhNGF-β的高效表达充分说明以腺病毒为载体,利用动物乳腺进行外源蛋白的生产是可行的。该方法进一步拓展了腺病毒载体的应用范围,无论在转基因技术理论领域,还是在基因工程药物生产研究方面,均具有重要意义,为转基因蛋白药物的生产开辟了一条新途径。
褚秀玲[10]（2007）在《分子修饰前后的人参皂苷抗马立克氏病毒的作用及其机制研究》文中研究指明人参皂苷是中药人参的主要活性成分之一。对药物分子的化学改造和修饰是研制新药与改变药效的主要途径之一。本实验以马立克氏病毒为模型,通过体内、外抗病毒实验,系统比较了分子修饰前后的人参皂苷抗马立克氏病毒的作用及效果。体外实验结果显示,药物在高浓度时,表现为细胞毒性效应,抑制CEF细胞的生长;中、低浓度时促进细胞的生长。人参皂苷衍生物7具有更好的抗病毒效果,其感染阻断、增殖抑制和直接杀灭三种途径抗MDV的半数抑制浓度IC50分别是20.83μg/mL、61.98μg/mL和125.43μg/mL,选择指数SI分别是13.47、4.61和2.28。人参皂苷及其衍生物7对MDV具有直接的破坏作用,并可以减轻MDV对CEF的损伤程度,降低单位视野中的病毒粒子数。体内实验结果表明,衍生物7能够显着降低实验鸡的发病率和死亡率,减少实验鸡脏器肿瘤阳性率,与病毒对照组相比差异显着（p<0.05）;并且可以改善免疫器官的形态,降低病毒抗原在组织中的表达,促进免疫器官发挥抗病毒作用。
二、AVP(4-8)调控基因的新途径研究及大鼠CCTβ在昆虫细胞中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、AVP(4-8)调控基因的新途径研究及大鼠CCTβ在昆虫细胞中的表达（论文提纲范文）
（1）棉花中5-羟色胺时空动态表达及其与棉花抗虫性的关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 植物次生代谢物简介 |
| 1.2 植物防御病虫害的主要次生代谢物 |
| 1.2.1 酚类 |
| 1.2.2 萜类 |
| 1.2.3 生物碱 |
| 1.2.4 其它类 |
| 1.3 棉花中参与抗病虫害的次生代谢物研究进展 |
| 1.3.1 参与抗病虫害的棉花次生产物 |
| 1.3.2 棉花害虫防治的新途径—化学生态调控 |
| 1.4 植物中5-HT的研究进展 |
| 1.4.1 5-羟色胺简介 |
| 1.4.2 5-羟色胺的合成代谢途径 |
| 1.5 细胞色素P450 酶系与植物的次生代谢 |
| 1.5.1 植物细胞色素P450 |
| 1.5.2 植物细胞色素P450 参与的植物防御反应 |
| 1.6 研究目的 |
| 第二章 高效液相色谱法检测棉花中5-HT的方法建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试剂与仪器 |
| 2.1.2 色谱条件 |
| 2.1.3 标准品的配置 |
| 2.1.4 样品处理 |
| 2.1.5 标准曲线与检测范围的确立 |
| 2.1.6 精密度试验 |
| 2.1.7 回收率试验 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 线性与范围 |
| 2.2.2 精密度试验 |
| 2.2.3 回收率实验 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 不同品种棉花5-HT时空动态表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试植物 |
| 3.1.2 材料处理方式 |
| 3.1.3 HPLC分析鉴定5-HT |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 陆地棉5-HT含量与绿盲蝽抗性相关性分析 |
| 3.2.2 陆地棉5-HT含量与烟粉虱抗性相关性分析 |
| 3.2.3 不同时期表达差异 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 室内测定烟粉虱取食对棉花5-HT表达的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试棉花 |
| 4.1.2 供试昆虫 |
| 4.1.3 棉花样品处理 |
| 4.1.4 HPLC分析鉴定5-HT |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 室内测定5-HT对棉铃虫的生理影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试虫源 |
| 5.1.2 处理方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 参与5-HT合成的CYP基因功能鉴定 |
| 6.1 实验材料与方法 |
| 6.1.1 试剂与仪器 |
| 6.1.2 基因筛选 |
| 6.1.3 构建体外表达载体 |
| 6.1.4 候选CYP基因重组表达载体的诱导表达 |
| 6.1.5 候选CYP体外酶活测定 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 候选基因筛选 |
| 6.2.2 候选基因体外酶活测定结果 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）芋螺毒素基因重组表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分：序言 |
| 1.1 芋螺毒素研究进展 |
| 1.1.1 芋螺毒素的分类和命名 |
| 1.1.2 芋螺毒素基因的获取方法 |
| 1.1.3 芋螺毒素多样性 |
| 1.1.4 芋螺毒素获取途径 |
| 1.1.5 芋螺毒素的药理学活性 |
| 1.1.6 芋螺毒素的药用价值 |
| 1.2 研究目的与意义 |
| 第二部分 芋螺毒素基因GeXIVAWT在大肠杆菌中表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和基因 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 培养基与抗生素 |
| 2.1.4 试剂和缓冲液 |
| 2.1.5 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 退火反应 |
| 2.2.3 大肠杆菌质粒DNA的制备 |
| 2.2.4 DNA的琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 表达载体质粒双酶切 |
| 2.2.6 琼脂糖电泳回收DNA |
| 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞制备 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态菌转化效率检测 |
| 2.2.9 连接转化 |
| 2.2.10 PCR筛选转化子 |
| 2.2.11 表达载体重组子测序 |
| 2.2.12 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.2.13 Tricine-SDS-PAGE分析表达产物 |
| 2.2.14 重组菌株培养条件优化方法 |
| 2.2.15 蛋白质的亲和层析 |
| 2.2.16 HPLC纯化目的蛋白 |
| 2.2.17 MALDI-TOF质谱鉴定 |
| 2.2.18 目的蛋白的体外折叠 |
| 2.2.19 细胞培养 |
| 2.2.20 活性检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 引物设计 |
| 2.3.2 载体构建示意图 |
| 2.3.3 表达载体构建 |
| 2.3.4 目的蛋白的诱导表达 |
| 2.3.5 重组蛋白表达条件优化 |
| 2.3.6 重组蛋白初步分离纯化 |
| 2.3.7 重组芋螺毒素的复性条件优化 |
| 2.3.8 重组芋螺毒素的RP-HPLC分析和质谱鉴定 |
| 2.3.9 活性实验 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分 芋螺毒素基因MrVIB在大肠杆菌中表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、质粒和基因 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 基本试剂 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 基本实验操作 |
| 3.2.3 热板实验 |
| 3.2.4 福尔马林实验 |
| 3.2.5 CCI实验模型 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 载体构建示意图 |
| 3.2.2 表达载体构建 |
| 3.3.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.3.4 重组蛋白分离纯化和鉴定 |
| 3.3.5 重组芋螺毒素MrVIB的活性 |
| 3.4 讨论 |
| 第四部分 芋螺毒素基因MrVIB在毕赤酵母中表达 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 工具酶及试剂 |
| 4.1.3 培养基与抗生素 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 表达载体的构建 |
| 4.2.3 酵母重组子的诱导表达 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 引物设计 |
| 4.3.2 毕赤酵母表达载体构建 |
| 4.3.3 酵母菌电转化及阳性转化子鉴定 |
| 4.3.4 毕赤酵母重组子诱导表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第五部分 芋螺毒素基因MrVIB在昆虫细胞中表达 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌株与质粒 |
| 5.1.2 细胞与培养基 |
| 5.1.3 工具酶及试剂 |
| 5.1.4 仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物合成 |
| 5.2.2 转移载体构建 |
| 5.2.3 重组Bacmid载体的构建 |
| 5.2.4 重组杆状病毒的制备和鉴定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 基因在昆虫细胞中的表达过程 |
| 5.3.2 转移载体构建 |
| 5.3.3 重组Bacmid载体构建 |
| 5.3.4 昆虫细胞培养及活力检测 |
| 5.3.5 重组病毒感染昆虫细胞 |
| 5.3.6 重组蛋白的表达检测 |
| 5.4 讨论 |
| 第六部分 芋螺毒素基因MrVIB在CHO细胞中表达 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 菌株与质粒 |
| 6.1.2 细胞与培养基 |
| 6.1.3 工具酶及试剂 |
| 6.1.4 仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 引物设计 |
| 6.2.2 表达载体的构建 |
| 6.2.3 重组表达载体在CHO细胞中表达 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 重组载体构建 |
| 6.3.2 基因在CHO细胞中的表达过程 |
| 6.3.3 CHO细胞培养 |
| 6.3.4 G418浓度的确定 |
| 6.3.5 细胞的筛选结果 |
| 6.3.6 电泳分析重组蛋白表达 |
| 6.4 讨论 |
| 第七部分 结论 |
| 7.1 芋螺毒素基因GeXIVAWT在大肠杆菌中的表达 |
| 7.2 芋螺毒素基因MrVIB在大肠杆菌中的表达 |
| 7.3 芋螺毒素基因MrVIB在毕赤酵母中的表达 |
| 7.4 芋螺毒素基因MrVIB在昆虫细胞中的表达 |
| 7.5 芋螺毒素基因MrVIB在哺乳动物细胞中的表达 |
| 7.6 芋螺毒素基因在四种表达系统中的表达比较 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文 |
（3）OPCML蛋白在杆状病毒—昆虫系统中的表达及其活性研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 卵巢恶性肿瘤概述 |
| 1.1 卵巢恶性肿瘤流行病及病因学 |
| 1.1.1 发病率 |
| 1.1.2 卵巢癌的高危因素 |
| 1.1.2.1 生殖因素 |
| 1.1.2.1.1 月经状况与卵巢癌 |
| 1.1.2.1.2 孕产次与卵巢癌 |
| 1.1.2.1.3 不孕症与卵巢癌 |
| 1.1.2.1.4 诱导排卵与卵巢癌 |
| 1.1.2.1.5 口服避孕药与卵巢癌 |
| 1.1.2.1.6 癌家族史 |
| 1.1.2.1.7 子宫切除术及输卵管绝育术 |
| 1.1.2.1.8 不合理膳食 |
| 1.1.2.1.9 性激素与卵巢癌 |
| 1.2 卵巢恶性肿瘤分子病理 |
| 1.2.1 癌基因 |
| 1.2.1.1 Her-2/neu 基因 |
| 1.2.1.2 ras 基因 |
| 1.2.1.3 EGFR |
| 1.2.2 抑癌基因 |
| 1.2.2.1 p53 抑癌基因 |
| 1.2.2.2 P16 抑癌基因 |
| 1.2.2.3 BRCA1与BRCA2基因 |
| 1.2.2.4 PTEN |
| 1.2.2.5 nm23 基因 |
| 1.2.3 生长因子与卵巢癌 |
| 1.2.3.1 表皮生长因子（EGF）与卵巢癌 |
| 1.2.3.2 转化生长因子β与卵巢癌 |
| 1.2.3.3 胰岛素样生长因子与卵巢癌 |
| 1.2.3.4 血管内皮生长因子与卵巢癌 |
| 2 OPCML 基因概述 |
| 2.1 OPCML的结构与功能 |
| 2.2 OPCML在常见肿瘤中的表达 |
| 2.2.1 OPCML 在卵巢癌中的表达 |
| 2.2.2 OPCML 在宫颈癌中的表达 |
| 2.2.3 OPCML 在肝细胞癌中的表达 |
| 2.2.4 OPCML 与其他肿瘤 |
| 2.3 OPCML 基因的抗肿瘤机制 |
| 2.4 OPCML 与肿瘤的防治 |
| 3 昆虫杆状病毒概述 |
| 3.1 杆状病毒的分类 |
| 3.2 杆状病毒基因组的结构和功能研究 |
| 3.3 杆状病毒的生活周期 |
| 3.4 重组杆状病毒系统的构建 |
| 3.5 昆虫细胞系的组织来源 |
| 3.6 昆虫杆状病毒载体表达系统的特点 |
| 3.6.1 昆虫杆状病毒载体表达系统优点 |
| 3.6.2 昆虫杆状病毒载体表达系统缺点 |
| 3.7 昆虫细胞系统和培养基 |
| 3.8 宿主细胞工程 |
| 3.9 宿主细胞的继代效率 |
| 3.10 表达蛋白质高效纯化方法的进步 |
| 3.10.1 用于纯化的新tag 的发展 |
| 3.10.2 通过BEVS 获得膜蛋白 |
| 3.10.3 抑制蛋白降解提高重组蛋白表达水平 |
| 3.10.4 利用活体昆虫进行目的基因的表达 |
| 综述参考文献 |
| 第二章 OPCML 基因在杆状病毒—昆虫系统中的表达及其初步活性研究 |
| 第一部分 OPCML 基因全长扩增和携带其基因的真核表达载体的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 组织来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 用具处理 |
| 2.2 OPCML基因的引物设计 |
| 2.3 感受态的制备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 OPCML杆状病毒表达系统的构建 |
| 2.4.1.1 目的基因OPCML 克隆 |
| 2.4.1.1.1 小鼠脑组织总RNA 的提取 |
| 2.4.1.1.2 cDNA 第一链的合成 |
| 2.4.1.1.3 PCR 扩增OPCML 基因片段 |
| 2.4.1.1.4 OPCML 的纯化与回收 |
| 2.4.1.1.5 连接片段与载体的准备 |
| 2.4.1.2 OPCML 与PACGp67A 的连接 |
| 2.4.1.3 连接产物转化大肠杆菌DH5α |
| 2.4.1.4 挑选阳性克隆 |
| 2.4.1.5 质粒DNA 的提取 |
| 2.4.1.6 重组质粒双酶切法鉴定 |
| 2.4.1.7 重组质粒的测序 |
| 2.4.1.8 测序结果的序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 OPCML 基因的克隆 |
| 3.2 重组OPCML-PACGp67A 的筛选及鉴定 |
| 3.3 OPCML 全长测序结果及BLAST 比对结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二部分 OPCML蛋白在SF9昆虫细胞中的表达、纯化及其活性研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 SF9 细胞的培养 |
| 2.3.2 重组 OPCML-PACGp67A 质粒染昆虫细胞 |
| 2.3.3 重组杆状病毒的收获、滴度测定 |
| 2.3.4 OPCML蛋白质的初步纯化 |
| 2.3.5 SDS-PAGE和Western-blotting检测OPCML蛋白的表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 SF9 细胞病变 |
| 3.2 重组杆状病毒的收获、滴度测定 |
| 3.3 OPCML蛋白纯化 |
| 3.4 BCA法测定蛋白浓度 |
| 3.5 表达产物的SDS-PAGE和Western-blot检测 |
| 4 讨论 |
| 第三章 OPCML蛋白对卵巢癌A2780细胞生物学功能影响的检测 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 试剂的配制 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 卵巢癌 A2780 细胞的复苏和培养 |
| 2.2.2 细胞增殖实验 |
| 2.2.3 细胞粘附实验 |
| 2.2.4 流式细胞术测定细胞周期 |
| 2.2.5 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 倒置显微镜下观察 |
| 3.2 细胞的增殖实验 |
| 3.3 细胞粘附实验 |
| 3.4 流式细胞术测定细胞周期 |
| 4 讨论 |
| 论文参考文献 |
| 致谢 |
（4）鸡传染性喉气管炎病毒HN1株gB基因核酸疫苗的构建与鸡IL-18联合免疫效力观察（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语说明 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡传染性喉气管炎病毒研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 分子生物学特征 |
| 1.3 诊断 |
| 1.4 防制 |
| 参考文献 |
| 第二章 DNA疫苗研究进展 |
| 2.1 DNA疫苗的组成 |
| 2.2 DNA疫苗的免疫学特性 |
| 2.3 DNA疫苗免疫机制及特点 |
| 2.4 影响基因免疫效果的因素 |
| 2.5 基因免疫试验研究 |
| 2.6 应用前景 |
| 参考文献 |
| 第三章 白细胞介素-18的研究进展 |
| 3.1 IL-18的发现 |
| 3.2 IL-18的产生及分布 |
| 3.3 IL-18的分子结构特点 |
| 3.4 IL-18受体及信号传递 |
| 3.5 IL-18的功能 |
| 3.6 IL-18的生物活性 |
| 3.7 IL-18的应用前景 |
| 3.8 鸡IL-18的研究概况 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 鸡传染性喉气管炎病毒HN1株gB基因的克隆与序列分析 |
| 摘要 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第五章 鸡传染性喉气管炎病毒HN1株gB基因真核表达载体的构建及表达 |
| 摘要 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第六章 鸡白细胞介素18基因的扩增、克隆及其真核表达载体的构建 |
| 摘要 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第七章 鸡传染性喉气管炎病毒gB基因和鸡IL-18基因免疫学试验 |
| 摘要 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第八章 鸡传染性喉气管炎病毒gB基因和鸡IL-18基因联合免疫的攻毒保护试验 |
| 摘要 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（5）猪干扰素a和γ在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达及重组蛋白初步应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 综述一 干扰素的研究进展 |
| 1. 干扰素的分类和诱生 |
| 2. 干扰素的分子结构 |
| 3. 干扰素的生物学活性 |
| 4. 干扰素的受体和信号传导 |
| 5. 干扰素诱导产生的蛋白 |
| 6. 病毒对干扰素的逃避机制 |
| 7. 猪干扰素的生产和临床应用概况 |
| 8. 展望 |
| 综述二 杆状病毒/昆虫细胞表达系统综述 |
| 1. 杆状病毒的分类和生物学特点 |
| 2. 杆状病毒载体表达系统的特点 |
| 3. 杆状病毒/昆虫细胞表达系统的研究进展 |
| 4. 影响在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中表达外源蛋白的因素 |
| 5. 杆状病毒/昆虫细胞表达系统的应用 |
| 6. 结束语 |
| 前言 |
| 第一章 猪干扰素α和γ基因的克隆 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 3. 结论与讨论 |
| 第二章 蜂素信号肽对猪干扰素α在昆虫细胞中表达的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 3. 结论与讨论 |
| 第三章 猪干扰素γ在昆虫细胞中的分泌表达及其活性检测 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 3. 结论与讨论 |
| 第四章 猪干扰素α和γ在昆虫细胞中共表达及其抗病毒活性检测 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果和分析 |
| 3. 结论和讨论 |
| 第五章 重组复合型猪干扰素对猪蓝耳病毒的抑制作用 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 3. 结论与讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 附录一 实验中主要仪器和试剂及其配制 |
| 附录二 英文符号缩写说明 |
（6）猪IFN-γ及其受体的生物学功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 IFN-γ研究进展 |
| 1.1.1 IFN-γ的分子结构和编码基因 |
| 1.1.2 IFN-γ的诱生 |
| 1.1.3 重组IFN-γ的研究 |
| 1.1.4 IFN-γ基因的转录调控 |
| 1.1.5 IFN-γ的生物学活性及其作用机制 |
| 1.1.6 IFN-γ的检测方法研究 |
| 1.1.7 IFN-γ应用研究及前景 |
| 1.2 IFN-γ受体及其介导的信号转导研究进展 |
| 1.2.1 IFNGR的结构特点 |
| 1.2.2 IFNGR介导的信号转导 |
| 1.2.3 IFN-γ信号通路的负反馈调控 |
| 第二章 猪IFN-γ融合表达和纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验菌种和载体 |
| 2.1.2 酶和试剂 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 溶液 |
| 2.1.5 仪器与设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 表达载体的构建 |
| 2.2.2 重组菌的诱导表达及表达条件的优化 |
| 2.2.3 GST-pIFN-γ高效表达产物的纯化 |
| 2.2.4 纯化GST-pIFN-γ蛋白分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 原核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.3.2 GST-pIFN-γ融合蛋白诱导表达条件的优化 |
| 2.3.3 GST-pIFN-γ的高效表达及纯化 |
| 2.3.4 纯化GST-pIFN-γ蛋白含量及产量测定 |
| 2.3.5 表达产物Western-blot分析 |
| 2.4 分析讨论 |
| 第三章 重组GST-pIFN-γ融合蛋白抗病毒活性及其理化特性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物、细胞及病毒株 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 溶液 |
| 3.1.4 仪器与设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 PK15 细胞的培养 |
| 3.2.2 病毒毒价测定 |
| 3.2.3 重组GST-pIFN-γ融合蛋白抗病毒活性分析 |
| 3.2.4 GST-pIFN-γ稳定性研究 |
| 3.2.5 机体毒副反应性研究 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PRV和标准O型FMDV毒价测定 |
| 3.3.2 GST-pIFN-γ抗病毒活性测定 |
| 3.3.3 GST-pIFN-γ稳定性研究 |
| 3.3.4 机体毒副反应性研究 |
| 3.4 分析讨论 |
| 第四章 带His标签猪IFN-γ的表达、纯化及活性分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 原核表达载体的构建及鉴定 |
| 4.2.2 重组pIFN-γ诱导表达条件的优化 |
| 4.2.3 重组pIFN-γ的纯化 |
| 4.2.4 纯化重组pIFN-γ的含量及产量测定 |
| 4.2.5 表达产物的Western-blot分析 |
| 4.2.6 重组pIFN-γ的活性分析 |
| 4.3 分析与讨论 |
| 第五章 重组猪IFN-γ体外抗弓形虫作用的研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试剂 |
| 5.1.2 虫株、细胞和实验动物 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 弓形虫悬液制备 |
| 5.2.3 培养细胞弓形虫攻虫剂量的测定 |
| 5.2.4 重组猪IFN-γ诱导培养细胞抗弓形虫试验 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 弓形虫致细胞病变的观察 |
| 5.3.2 弓形虫攻虫剂量的确定 |
| 5.3.3 重组猪IFN-γ诱导细胞抗弓形虫结果 |
| 5.4 分析与讨论 |
| 第六章 猪IFN-γ诱导PK15 细胞凋亡及其作用机制研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 细胞及试剂 |
| 6.1.2 溶液 |
| 6.1.3 仪器与设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 PK15 细胞培养 |
| 6.2.2 GST-pIFN-γ诱导及细胞收集 |
| 6.2.3 凋亡DNA Ladder提取与电泳分析 |
| 6.2.4 Hoechst 33258 荧光染色检测 |
| 6.2.5 AO/EB荧光染色检测 |
| 6.2.6 pIFN-γ对PK细胞端粒酶活性影响检测 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 诱导细胞形态的观察 |
| 6.3.2 诱导细胞DNA电泳分析 |
| 6.3.3 Hoechest染色检测PK15 细胞凋亡 |
| 6.3.4 AO/EB荧光染色检测PK15 细胞凋亡 |
| 6.3.5 pIFN-γ对PK细胞端粒酶活性影响检测结果 |
| 6.4 分析与讨论 |
| 第七章 猪IFN-γ单克隆抗体的研制及鉴定 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 抗原、细胞系及实验动物 |
| 7.1.2 试剂及耗材 |
| 7.1.3 溶液及培养基 |
| 7.1.4 仪器与设备 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 间接ELISA法最佳抗原包被量及阳性血清最佳稀释度的确定 |
| 7.2.2 动物免疫 |
| 7.2.3 细胞融合 |
| 7.2.4 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 7.2.5 阳性杂交瘤细胞的克隆化、冻存和复苏 |
| 7.2.6 单克隆抗体腹水的制备 |
| 7.2.7 杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 间接ELISA法最佳抗原包被量及阳性血清稀释滴度的确定 |
| 7.3.2 第三次免疫后BALB/c小鼠血清ELISA检测结果 |
| 7.3.3 亚克隆和单克隆细胞株ELISA检测结果 |
| 7.3.4 杂交瘤细胞及单抗特性鉴定 |
| 7.3.5 单抗识别抗原表位分析 |
| 7.4 分析讨论 |
| 7.4.1 抗原 |
| 7.4.2 动物选择和免疫 |
| 7.4.3 饲养细胞的制备 |
| 7.4.4 瘤细胞和融合 |
| 7.4.5 杂交瘤抗体的检测 |
| 7.4.6 克隆化 |
| 7.4.7 单克隆抗体亚类 |
| 7.4.8 杂交瘤细胞的染色体 |
| 7.4.9 单抗的稳定性实验 |
| 7.4.10 pIFN-γ单抗的应用 |
| 第八章 猪IFN-γ受体基因克隆、表达及功能研究 |
| 8.1 材料 |
| 8.1.1 试验动物、菌种和载体 |
| 8.1.2 酶和试剂 |
| 8.1.3 培养基 |
| 8.1.4 溶液 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 淋巴细胞的分离与培养 |
| 8.2.2 淋巴细胞的刺激诱导 |
| 8.2.3 总RNA的提取 |
| 8.2.4 引物的设计与合成 |
| 8.2.5 RT-PCR扩增目的基因 |
| 8.2.6 目的基因的克隆 |
| 8.2.7 重组质粒的提取与鉴定 |
| 8.2.8 猪IFNGR基因序列及其编码蛋白的结构预测 |
| 8.2.9 猪IFNGR基因表达引物的设计及扩增 |
| 8.2.10 猪IFNGR表达载体构建及鉴定 |
| 8.2.11 猪IFNGR胞外区的诱导表达及SDS－PAGE分析 |
| 8.2.12 重组猪IFNGR表达产物的纯化 |
| 8.2.13 纯化表达产物的检测 |
| 8.2.14 猪IFNGR1 与IFNGR2 胞外区对pIFN-γ抗病毒效应的影响 |
| 8.3 结果 |
| 8.3.1 RNA提取结果 |
| 8.3.2 RT-PCR产物 |
| 8.3.3 重组克隆载体的鉴定 |
| 8.3.4 猪IFNGR1 和IFNGR2 序列测定及分析 |
| 8.3.5 原核表达载体的构建及鉴定 |
| 8.3.6 猪IFNGR1 和IFNGR2 胞外区重组蛋白诱导表达 |
| 8.3.7 猪IFNGR1 和IFNGR2 胞外区重组蛋白的纯化 |
| 8.3.8 纯化重组蛋白含量测定 |
| 8.3.9 纯化重组蛋白Western-blot分析 |
| 8.3.10 猪IFNGR1 和IFNGR2 胞外区对pIFN-γ抗病毒效应的影响 |
| 8.4 分析讨论 |
| 第九章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）石斑鱼抗菌肽Hepcidin基因的克隆、表达与抗菌活性研究（论文提纲范文）
| 缩略语中英文对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 抗菌肽的研究进展 |
| 第二节 鱼类抗菌肽的研究 |
| 第三节 含半胱氨酸抗菌肽的研究 |
| 第四节 抗菌肽基因工程及应用前景 |
| 第五节 本研究的技术路线、目的和意义 |
| 第二章 石斑鱼hepcidin cDNA基因的扩增 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 生物信息学分析序列 |
| 第二节 结果 |
| 2.1 总RNA的提取 |
| 2.2 RT-PCR结果 |
| 2.3 石斑鱼5‘RACE和3’RACE结果 |
| 2.4 石斑鱼肝脏全长cDNA序列的拼接 |
| 2.5 石斑鱼肝脏hepcidin基因ORF的RT-PCR扩增 |
| 2.6 石斑鱼hepcidin cDNA基因编码氨基酸序列的性质分析 |
| 第三节 讨论 |
| 第三章 石斑鱼hepcidin基因组DNA及5′和3′侧翼片段扩增 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 第二节 结果 |
| 2.1 基因组提取及酶切 |
| 2.2 基因组DNA 编码区片段的扩增 |
| 2.3 基因组上下游片段的扩增及序列分析 |
| 第三节 讨论 |
| 第四章 石斑鱼hepcidin的原核表达载体的构建及表达 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 第二节 结果 |
| 2.1 预连接pTrc-CKS表达载体制备 |
| 2.2 石斑鱼Hepcidin表达目的片段的扩增及重组菌落的PCR鉴定 |
| 2.3 融合表达载体的构建及测序结果分析 |
| 2.4 pTrc-CKS/石斑鱼Hepcidin重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 第三节 讨论 |
| 第五章 原核表达融合蛋白的纯化和抗菌活性的测定 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 第二节 结果 |
| 2.1 石斑鱼Hepcidin融合表达产物的纯化 |
| 2.2 纯化表达产物的脱盐 |
| 2.3 纯化融合表达蛋白的浓度 |
| 2.4 纯化融合表达目的蛋白的纯度鉴定和酶切效果分析 |
| 2.5 表达产物抗菌活性测定 |
| 第三节 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间参加的科研项目 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）大鼠Smad7真核表达质粒的构建及在肝星状细胞中抗纤维化特性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分：大鼠Smad7真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 测序 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分：外源Smad7对肝星状细胞Smad7mRNA及蛋白表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计学处理 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分：Smad7 过表达对肝星状细胞的影响及意义 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计学处理 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评语 |
（9）腺病毒介导重组人蛋白C及人神经生长因子Beta基因在兔乳腺中高效表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 动物乳腺反应器生产重组蛋白的研究进展 |
| 1.1.1 动物乳腺生物反应器表达重组蛋白的研究概况 |
| 1.1.2 动物乳腺生物反应器存在的问题及发展前景 |
| 1.2 腺病毒及其载体的研究进展 |
| 1.2.1 腺病毒的一般生物学特性 |
| 1.2.2 腺病毒载体的构建 |
| 1.2.3 腺病毒载体的优点 |
| 1.2.4 腺病毒载体的应用 |
| 1.3 人蛋白C 转基因的研究现状 |
| 1.3.1 蛋白C 的结构特性及其作用 |
| 1.3.2 重组人蛋白C 的研究状况 |
| 1.4 人神经生长因子转基因的研究现状 |
| 1.4.1 神经生长因子的结构 |
| 1.4.2 神经生长因子的生物活性 |
| 1.4.3 神经生长因子在临床上的应用 |
| 1.4.4 神经生长因子的来源 |
| 1.4.5 重组人神经生长因子的研究进展 |
| 第二章 人蛋白C 及人神经生长因子Beta cDNA 序列的克隆及其表达载体的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 hPC 及hNGF-β全长cDNA 的扩增与序列分析 |
| 2.2.2 hPC 及hNGF-β表达载体及穿梭载体的构建 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 人蛋白C 和人神经生长因子beta 基因序列的分离、克隆 |
| 2.3.2 hPC 及hNGF-β表达载体的构建 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 人蛋白C 及人神经生长因子beta cDNA 在CHO 和293 细胞中的表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 四种载体转染CHO 和HEK293 细胞光镜检查结果 |
| 3.2.2 转染CHO、HEK293 细胞mRNA 检测 |
| 3.2.3 Western blot 检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 载体线性化对转染效率的影响 |
| 3.3.2 关于双标记筛选表达载体的便利性 |
| 3.3.3 关于外源基因导入方法的选择 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 同源重组法在细菌内制备重组腺病毒载体的研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 穿梭载体的线性化 |
| 4.2.2 重组腺病毒载体的鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 关于构建腺病毒载体的方法 |
| 4.3.2 细菌内同源重组法构建重组腺病毒载体的优势 |
| 4.3.3 影响大质粒转化的因素 |
| 4.3.4 二次转化提高细菌内同源重组的成功率 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 重组腺病毒的扩增及其在乳腺上皮细胞中表达的研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 重组腺病毒的包装 |
| 5.2.2 重组腺病毒的扩增 |
| 5.2.3 重组腺病毒的纯化和滴度测定 |
| 5.2.4 重组腺病毒在兔乳腺上皮细胞中的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 腺病毒的生活周期 |
| 5.3.2 腺病毒生产中的几个重要环节 |
| 5.3.3 关于重组腺病毒滴度的测定 |
| 5.3.4 关于重组腺病毒在乳腺上皮细胞中的表达 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 重组腺病毒在兔乳腺中高效表达的研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 兔乳腺感染病毒后rhNGF-β的表达 |
| 6.2.2 兔乳腺感染病毒后hPC 的表达 |
| 6.2.3 兔乳中所表达的rhNGF-β和rhPC 的活性分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 结论及创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 人PC cDNA 序列 |
| 附录2 人PC cDNA 测序图 |
| 附录3 人神经生长因子cDNA 序列 |
| 附录4 神经生长因子βcDNA 测序图 |
| 缩略词和中英文对照表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）分子修饰前后的人参皂苷抗马立克氏病毒的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词表 |
| 文缩略词表(续) |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 中药抗病毒研究进展 |
| 1 病毒的致病机理和机体的抗病毒免疫 |
| 2 中药抗病毒的作用机理和途径 |
| 3 中药抗病毒的研究方法和思路 |
| 4 中药抗病毒的临床应用与研究 |
| 5 小结 |
| 第二章 皂苷与人参皂苷的研究进展 |
| 1 皂苷 |
| 2 人参皂苷 |
| 3 小结 |
| 第三章 马立克氏病毒研究进展 |
| 1 MDV 生物学研究进展 |
| 2 MDV 分子生物学研究进展 |
| 3 小结 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 人参皂苷及其衍生物体外抗马立克病毒鸡胚成纤维细胞模型的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 人参皂苷及其衍生物对鸡胚成纤维细胞最大安全浓度的测定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 人参皂苷及其衍生物体外抗马立克氏病毒的药效学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 通过透射电镜观察人参皂苷及其衍生物体外抗马立克氏病毒作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 人参皂苷及其衍生物体内抗马立克氏病毒的疗效观察 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章 人参皂苷及其衍生物体内抗马立克氏病毒的作用机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
| 详细摘要 |
| 导师简历 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
四、AVP(4-8)调控基因的新途径研究及大鼠CCTβ在昆虫细胞中的表达（论文参考文献）
- [1]棉花中5-羟色胺时空动态表达及其与棉花抗虫性的关系[D]. 孙佩瑶. 中国农业科学院, 2021(09)
- [2]芋螺毒素基因重组表达研究[D]. 高炳淼. 海南大学, 2012(04)
- [3]OPCML蛋白在杆状病毒—昆虫系统中的表达及其活性研究[D]. 覃宇翔. 广西医科大学, 2011(08)
- [4]鸡传染性喉气管炎病毒HN1株gB基因核酸疫苗的构建与鸡IL-18联合免疫效力观察[D]. 廖仲磊. 南京农业大学, 2008(06)
- [5]猪干扰素a和γ在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达及重组蛋白初步应用[D]. 王彦彬. 河南农业大学, 2008(03)
- [6]猪IFN-γ及其受体的生物学功能研究[D]. 窦永喜. 中国农业科学院, 2008(10)
- [7]石斑鱼抗菌肽Hepcidin基因的克隆、表达与抗菌活性研究[D]. 邓尚龙. 吉林农业大学, 2008(11)
- [8]大鼠Smad7真核表达质粒的构建及在肝星状细胞中抗纤维化特性研究[D]. 杨小艳. 石河子大学, 2008(01)
- [9]腺病毒介导重组人蛋白C及人神经生长因子Beta基因在兔乳腺中高效表达的研究[D]. 肖波. 西北农林科技大学, 2008(12)
- [10]分子修饰前后的人参皂苷抗马立克氏病毒的作用及其机制研究[D]. 褚秀玲. 吉林大学, 2007(03)