一、白细胞介素-2基因佐剂对柯萨奇病毒B3VP1基因疫苗的免疫增强作用（论文文献综述）
孙源彬,陈丽丽[1]（2016）在《白细胞介素-15在感染性疾病中作用的研究进展》文中认为白细胞介素-15（interleukin,IL-15）是一种具有多种生物学活性的细胞因子,可活化NK、CD8+T淋巴细胞等免疫细胞,参与机体的先天性免疫和适应性免疫;还可作为佐剂,提高免疫细胞对抗原性物质的应答能力。因此,IL-15在细菌、病毒、寄生虫等微生物感染性疾病的致病及预后过程中发挥重要作用。
李嘉,李剑,羡鲜,刘贵霞,蓝佳明,金玉怀,谢立新,张桓,王永祥[2]（2011）在《CVB3腺病毒载体Ad/sVP1-C3d3的构建及免疫效果研究》文中研究说明目的:构建柯萨奇病毒B3（CVB3）VP1基因重组腺病毒Ad/sVP1-C3d3,并观察对小鼠的免疫效果。方法:利用AdEasy-1系统构建、包装重组腺病毒Ad/sVP1-C3d3。BALB/c小鼠随机分为Ad/sVP1-C3d3、Ad/VP1、Ad和PBS4组,肌肉注射免疫,共免疫2次,每次间隔16d。用ELISA法和微量中和试验法分别检测血清CVB3VP1IgG和中和抗体滴度;CCK-8法检测特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度。结果:成功构建、包装了重组腺病毒Ad/sVP1-C3d3。免疫小鼠后,Ad/sVP1-C3d3组血清CVB3VP1IgG滴度和中和抗体水平明显高于Ad/VP1（P<0.01）,CTL杀伤活性明显高于Ad和PBS对照组（P<0.01）及Ad/VP1组（P<0.05）,血清病毒滴度低于Ad和PBS对照组（P<0.05）。结论:重组腺病毒Ad/sVP1-C3d3能明显提高小鼠的细胞和体液免疫应答并降低血液病毒载量。
宋鸿雁[3]（2010）在《堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗免疫保护作用及免疫机理研究》文中进行了进一步梳理鸡球虫病是由艾美耳属（Eimeria）球虫寄生于鸡肠上皮细胞内所引起的寄生虫病,分布于世界各地,对养禽业危害巨大。由于目前的药物预防、活疫苗接种等防控措施存在较多问题,因此,有必要研究新的防控手段。DNA疫苗可以诱导宿主产生长期的体液免疫和细胞免疫,预防包括球虫病在内的多种疾病,因此成为疫苗发展的新方向。已经有多种球虫保护性抗原如EtMICs、SO7、5401、cSZ-1、3-1E等被发现,其保护效果也已经被大量的研究所证实。研究发现,堆型艾美耳球虫（E. acervulina）乳酸脱氢酶（LDH）是相对分子质量为37 kDa的蛋白,在球虫发育的4个阶段（卵囊、子孢子、裂殖体和裂殖子）均有相似水平的表达,可对E. acervulina的攻击产生部分保护力,被认为是一种很有潜力的疫苗候选抗原。本研究利用RT-PCR方法从E. acervulina第一代裂殖体克隆了E. acervulina LDH基因,酶切及PCR鉴定均正确的菌株经测序,结果显示,克隆片段含一个长993 bp的开放阅读框（ORF）,编码330个氨基酸,与GenBank上的E. acervulina LDH基因序列相似性为98%。应用DNA重组技术,将LDH基因克隆到原核表达载体pET28a（+）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达重组LDH蛋白。SDS-PAGE电泳显示,pET28a（+）-LDH在大肠杆菌中得到成功表达,其分子量在41 kDa左右。菌体经超声破碎后的沉淀与上清的SDS-PAGE分析结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在。本研究利用DNA重组技术,分别构建pVAX-LDH、pVAX-LDH-IFN-γ和pVAX-LDH-IL-2 DNA疫苗。经鉴定正确后,分别用重组质粒免疫14日龄雏鸡,1周后取肌肉注射部位、非注射部位组织和pVAX1空质粒注射部位,用RT-PCR和western blot检测疫苗的转录和表达情况。结果表明,构建的DNA疫苗均能在注射部位肌肉成功转录和表达。将构建的DNA疫苗pVAX-LDH、pVAX-LDH-IFN-γ和pVAX-LDH-IL-2以及LDH重组蛋白和包涵体经腿部肌肉分别于14、21日龄两次免疫雏鸡,并设立感染非免疫和非感染非免疫对照组,另设pVAX1空质粒注射组。除非感染非免疫组外,28日龄经口接种新鲜的E. acervulina孢子化卵囊,攻虫第6天宰杀全部实验动物,计算存活率、进行病变记分、增重、卵囊下降率,通过计算综合抗球虫指数（ACI）这些生理指标,评价构建的疫苗对鸡抗球虫保护力。结果表明,所构建的重组质粒对感染球虫鸡均具有一定的保护效果,其中以pVAX-LDH-IFN-γ和pVAX-LDH-IL-2重组质粒组保护效果最好。用构建的3种DNA疫苗免疫14日龄雏鸡,并设灭菌水注射和pVAX1空质粒对照组。21日龄以同样剂量加强免疫一次,二免后第7天,取鸡脾脏分离淋巴细胞。采用MTT法测定脾脏淋巴细胞增殖反应。结果发现,DNA疫苗免疫后鸡脾脏淋巴细胞增殖水平均显着高于灭菌水和pVAX1空质粒对照组。说明构建的DNA疫苗可以刺激鸡体的免疫系统尤其是细胞免疫反应。用构建的3种DNA疫苗免疫14日龄雏鸡,并设灭菌水注射和pVAX1空质粒对照组,21日龄以同样剂量加强免疫一次。分别于首次免疫后第7天和第2次免疫后第7天取鸡脾脏和盲肠扁桃体分离淋巴细胞,用带有荧光标记的CD3+、CD4+、CD8+单克隆抗体进行荧光染色,用流式细胞术检测CD3+、CD4+/CD3+、CD8+/CD3+的比例。结果发现,第1次免疫后第7天脾脏和盲肠扁桃体中各组间CD3+ T淋巴细胞水平差异均不显着（P>0.05）,第2次免疫后第7天,DNA疫苗组CD3+水平显着高于灭菌水和pVAX1空质粒组（P<0.05）。结果表明,构建的DNA疫苗可以增强鸡体T淋巴细胞反应。用构建的3种DNA疫苗免疫14日龄雏鸡,并设灭菌水注射和pVAX1空质粒对照组,21日龄以同样剂量加强免疫一次。二免后第7天,取鸡脾脏和盲肠扁桃体分离淋巴细胞。提取淋巴细胞总RNA,反转录合成cDNA,进行实时荧光定量PCR,检测脾脏和盲肠扁桃体中IFN-γ、IL-2、IL-4、TNFSF15、IL-17D和TGF-β4 mRNA水平变化,以GAPDH为内参照,采用2-ΔΔCT方法计算各细胞因子相对mRNA表达量。结果发现,疫苗免疫后鸡脾脏和盲肠扁桃体IFN-γ、IL-2、TNFSF15、IL-17D和TGF-β4 mRNA水平显着升高,表明.,本研究构建的DNA疫苗可以促进鸡体内细胞因子分泌。用构建的3种DNA疫苗免疫14日龄雏鸡,并设灭菌水注射和pVAX1空质粒对照组,21日龄以同样剂量加强免疫一次。1周后心脏采全血,制备血清,之后每间隔1周心脏采血,一直采样到二免后第6周。用重组LDH蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法,检测血清样品的IgG水平。结果发现：二免后1～6周,疫苗组显示了显着高于灭菌水和pVAX1空质粒组的特异性LDH抗体水平。pVAX-LDH-IFN-γ组和pVAX-LDH-IL-2组的抗体滴度比pVAX-LDH高,且差异显着。pVAX-LDH-IL-2组在3个疫苗组中表现最高的抗体滴度。在整个过程中,注射灭菌水和pVAX1空质粒的两个组均未检测到特异性的抗体。结果表明,构建的DNA疫苗可以诱导鸡体产生特异性抗体。本研究通过动物保护性试验和免疫机理研究结果证实,构建的DNA疫苗可以刺激机体产生显着的全身和局部免疫反应,诱导机体产生细胞免疫和体液免疫共同参与抵抗球虫感染,为机体提供一定保护力。
李琳,王永祥[4]（2010）在《IL-2、IFN-γ和GM-CSF基因佐剂对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗免疫作用的影响》文中提出目的:观察IL-2、IFN-γ和GM-CSF重组质粒对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗免疫的免疫增强效果。方法:将50只4～6周龄雄性BALB/c小鼠随机分成pcDNA3组、pcDNA3/MDC-VP1组、pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/hIL-2组、pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/m IFN-γ组、pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组,每组10只。均每3周接种1次,共3次。每次接种的第20d内眦静脉采血,用微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）检测血清中和抗体效价。第3次免疫后3周,每组取3只小鼠脾脏制备淋巴细胞悬液,检测淋巴细胞增殖活性与特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性。结果:各组血清中和抗体滴度随免疫次数增加而提高（P<0.05）;第3次免疫后pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组的血清中和抗体滴度、脾脏淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性均高于其他组（P<0.05）。结论:三种细胞因子基因佐剂均能增强pcDNA3/MDC-VP1的免疫效果,GM-CSF基因佐剂的免疫效果优于IL-2和IFN-γ。
李嘉[5]（2009）在《柯萨奇病毒B3腺病毒载体疫苗Ad/sVP1的构建及免疫效果的研究》文中进行了进一步梳理目的:柯萨奇病毒B组3型（Coxsackievirus group B type 3,CVB3）感染所致的病毒性心肌炎（viral myocarditis,VMC）严重危害人类健康,也是新生儿猝死的重要原因,目前尚无有效的预防方法。核酸疫苗的问世,为建立有效的预防方法提供了机会。本室前期的大量研究证明,以pcDNA3质粒为载体构建的多种核酸疫苗免疫小鼠后,仅可诱导产生低效价的中和抗体,不能有效阻止致死量病毒感染。因此,提高免疫原性、增强免疫效果是制备CVB3疫苗亟需解决的问题。目前提高免疫效果的关键因素之一是开发具有较高基因转移率和靶向特异性的转基因载体。在众多载体体系中,复制缺陷型腺病毒载体系统（Replication-Defective Adenovirus Vector System）以其广泛的宿主范围、极高的转染效率、外源基因高表达以及病毒滴度高等特点,在疫苗载体选择中表现出优势,成为极具应用前景的基因转移载体。VP1是CVB3的主要中和抗原,能诱导机体产生体液和细胞免疫,但用VP1基因构建的核酸疫苗免疫小鼠后产生的中和抗体效价偏低。其主要原因是VP1蛋白在转染细胞中可以表达,但却不能从转染细胞中自主释放,因而不能有效激发抗体应答。人白细胞介素2（Human interleukin-2, hIL-2）信号肽是由20个氨基酸组成的高度疏水性序列,它可以将合成的蛋白质移向细胞膜并与细胞膜结合,然后把合成的蛋白质分泌到胞外,且可以在不同种属蛋白质间相互使用。本室前期曾将CVB3 VP1基因拼接到人白介素2（hIL-2）信号肽5’端构建了分泌性重组真核表达质粒pcDNA3/sVP1,免疫小鼠可以增强中和抗体应答。本研究利用AdEasy腺病毒载体系统构建、包装重组腺病毒Ad/sVP1,并通过研究该疫苗免疫BALB/c小鼠后诱生的特异性免疫应答和病毒攻击后的免疫保护作用探讨这种疫苗的应用效果。方法: （1）目的基因的扩增与鉴定以重组质粒pcDNA3/sVP1为模板,扩增带有信号肽的VP1基因。将扩增产物与pGEM-T载体连接,构建质粒pGEM-T/sVP1。转化DH5α大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序,筛选重组子。（2）重组穿梭质粒的构建将质粒pGEM-T/sVP1以合适的限制性内切酶进行双酶切,回收带粘末端的目的片段,将目的片断分别与经合适的限制性内切酶双酶切的腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接。经转化、筛选和酶切鉴定,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/sVP1。（3）重组腺病毒质粒的构建将质粒用内切酶PmeⅠ线性化。利用AdEasy系统,经两步法分别在大肠杆菌BJ-5183中与骨架载体pAdEasy-1同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd/sVP1。用PacⅠ酶切鉴定。将阳性质粒转化入感受态E.coli DH5α,挑取阳性克隆。以碱裂解法大量提取,并用聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）沉淀法进行纯化。（4）重组腺病毒Ad/sVP1的包装与扩增将重组腺病毒质粒pAd/sVP1用内切酶PacⅠ线性化,以阳离子脂质体法转染HEK293（humanembryo kidney 293 derived cell line）细胞,并观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达。冻融法收集初代病毒液。取初代病毒液感染293细胞,逐日观察细胞病变（cytopathic effect,CPE）,及有否彗星样斑块（FOCI）形成。并经第三轮大量扩增,以提高病毒滴度。（5）病毒感染293细胞后48小时,提取细胞总蛋白及细胞培养液,通过SDS-PAGE和Western blot检测VP1蛋白的表达。（6）大量扩增重组腺病毒取Ad/sVP1以及本室保存Ad/VP1第三代病毒液感染293细胞,大量扩增重组腺病毒,并以冻融法收集病毒液。将收集到的病毒液利用大量腺病毒纯化试剂盒纯化病毒。（7）重组腺病毒滴度测定待293细胞在96孔板中生长至70-80%汇合时,以不同稀释倍数的上述病毒液感染细胞,感染后48小时GFP阳性细胞计数法测定病毒滴度。病毒滴度=荧光细胞数×病毒液的稀释倍数/病毒液量。（8）动物实验:将6～8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为3组,分别为PBS对照组、Ad/VP1组、Ad/sVP1组,每组18只,病毒液以PBS稀释后,股四头肌注射免疫小鼠,每次每只接种1×107pfu,第0、16天分别免疫,共免疫2次;每次免疫后第14天,内眦静脉取血,分离血清,用微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）及ELISA法检测血清CVB3特异性中和抗体和IgG抗体水平;第2次免疫后3周,每组3只小鼠取脾脏制备淋巴细胞悬液,采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8, CCK-8）法进行特异性淋巴细胞增殖活性和特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）杀伤活性的检测;另每组12只小鼠用4LD50CVB3进行腹腔注射,观察并记录小鼠存活情况至感染后第21天;每组剩余的3只小鼠用3LD50CVB3攻击,注射病毒后第7天取血,用于血中病毒滴度的测定。结果:（1）成功构建了pGEM-T/sVP1,测序和酶切鉴定证明符合预期结果。（2）成功构建穿梭质粒pAdTrack-CMV/sVP1,酶切分析证明符合预期设计。（3）成功构建重组腺病毒质粒pAd/sVP1,用PacⅠ酶切得到约30kb的片段和一个3.0或4.5kb的片段,PCR鉴定目的基因长度与预期值相符。（4）转染293细胞48小时后,荧光显微镜下观察到报告基因GFP的表达,重组腺病毒Ad/sVP1包装成功。初代病毒再次感染293细胞,在荧光显微镜下观察到逐日明显的细胞病变和荧光聚集,各代病毒感染细胞后均有彗星样荧光斑块形成。（5）重组腺病毒Ad/sVP1感染293细胞48小时后,经Western Blot检测,在细胞培养液中检测到VP1蛋白。（6）重组腺病毒Ad/vp1、Ad/sVP1大量扩增后的病毒滴度依次为: 3.0×109 pfu/ml、5.0×108 pfu/ml。（7）各次免疫后血清CVB3 VP1特异性IgG水平分别为:Ad/VP1组: 1:56.10,1:168.27;Ad/sVP1组: 1:66.68,1:503.50;而PBS组未检测到。单因素方差分析表明,Ad/VP1和Ad/sVP1组VP1特异性IgG逐次增加（P<0.01）;末次免疫后二组比较,Ad/sVP1组抗体滴度高于Ad/VP1组（P<0.01）。（8）各次免疫后血清CVB3中和抗体水平分别为:Ad/VP1组:1:8.41,1:31.77;Ad/sVP1组:1:8.91,1:44.87;PBS组未检测到。单因素方差分析表明Ad/VP1和Ad/sVP1组中和抗体水平逐次增加（P<0.01）;第2次免疫后Ad/sVP1组抗体滴度高于Ad/VP1组（P<0.05）。（9）小鼠脾淋巴细胞增殖增殖活性经单因素方差分析表明,以CVB3刺激时,各组间比较无统计学意义;以ConA刺激时, Ad/sVP1组高于其他二组（P<0.05）。（10）小鼠脾脏特异性CTL杀伤活性经单因素方差分析表明,Ad/sVP1组与Ad/VP1组杀伤率无统计学意义,但二者均高于PBS对照组（P<0.05）。（11）用3LD50 CVB3攻击小鼠后第7d,血清病毒滴度测定结果表明,Ad/sVP1和Ad/VP1组明显低于PBS组（P<0.05）,且Ad/sVP1组较Ad/VP1组显着降低（P<0.05）。（12）4LD50 CVB3感染小鼠后21d,Ad/sVP1组和Ad/VP1组生存率分别为:58.33% ,41.67%,PBS组无存活。经过χ2检验分析,尚不能确定三组之间有统计学差异。用Kaplan-Meier法进行生存分析,生存率曲线分布有差异,Ad/sVP1组生存状况好于PBS组（p<0.01）,但与Ad/VP1组比较无统计学意义。结论:（1）本研究利用AdEasy腺病毒载体系统成功包装了重组腺病毒载体疫苗Ad/sVP1,在293细胞内可以表达并分泌至细胞外。（2）Ad/VP1和Ad/sVP1均能诱导小鼠产生中和抗体和特异性IgG抗体,增强脾淋巴细胞增殖活性,降低病毒攻击后血清病毒滴度,提高小鼠的生存率。（3）与Ad/VP1比较,分泌型重组腺病毒Ad/sVP1能更有效的提高体液和脾淋巴细胞增殖活性,降低病毒攻击后的小鼠血中病毒滴度,免疫效果优于Ad/VP1。
闫立景[6]（2009）在《CVB3疫苗Ad/MDC-VP1与pcDNA3/MDC-VP1联合应用的免疫效果研究》文中研究指明目的:柯萨奇病毒B组（Coxsackievirus group B,CVB）是病毒性心肌炎最主要的病原,50%以上的心肌炎由该病毒感染引起,部分患者发展为慢性心肌炎和扩张性心肌病,以CVB3感染最常见。目前尚无有效的预防方法。VP1是CVB3的主要中和抗原,以质粒为载体构建的CVB3 VP1核酸疫苗肌肉注射免疫小鼠后,仅可诱导产生低效价的中和抗体,不能有效阻止致死量病毒感染。为了增强疫苗的效果,一些研究者将树突细胞趋化因子基因与目的基因拼接,构建成靶向核酸疫苗。靶向核酸疫苗有利于抗原的摄取、加工和提呈,并使树突细胞表达协同刺激分子,使无免疫原性的肿瘤抗原或免疫原性较弱的病毒抗原免疫原性明显增强。MDC是CC型趋化因子,能趋化单核/巨噬细胞、树突细胞和T细胞等。本室前期经适当接头序列构建了带有信号肽的MDC与VP1融合基因核酸疫苗pcDNA3/MDC-VP1,免疫小鼠显示对致死量病毒感染的保护作用明显增强,但仍不能完全保护小鼠抵抗致死量病毒感染。与质粒载体相比,腺病毒载体具有进入宿主细胞的能力强、宿主范围广、感染细胞后使协同刺激分子表达上调、诱导细胞因子和趋化因子产生、外源基因高表达以及病毒滴度高等特点,并且不整合到宿主染色体中,无插入突变性。在疫苗载体选择中表现出优势。一些研究显示以腺病毒为载体构建的疫苗有满意的免疫效果。本课题利用AdEasy腺病毒载体系统构建、包装重组腺病毒Ad/MDC-VP1,单独或与质粒pcDNA3/MDC-VP1联合免疫以增强VP1抗原的免疫效果。方法:1重组穿梭质粒的构建将质粒pcDNA3/MDC -VP1用限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ进行双酶切,回收目的片段MDC-VP1后与经同样酶切的腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,经转化、筛选和酶切鉴定,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/MDC-VP1。2重组腺病毒质粒的构建将pAdTrack-CMV/MDC -VP1质粒用内切酶PmeⅠ线性化,利用AdEasy系统,经两步法在大肠杆菌BJ5183中与骨架载体pAdEasy-1同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd/MDC-VP1。用PacⅠ酶切鉴定,将阳性质粒转化感受态E.coli DH5α,挑取阳性克隆。以碱裂解法大量提取重组质粒,并用聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）沉淀法进行纯化。3重组腺病毒的包装与扩增重组腺病毒质粒pAd/MDC-VP1用内切酶PacⅠ线性化,以阳离子脂质体法转染HEK293细胞,并观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达。冻融法收集初代病毒液。取初代病毒液感染HEK293细胞,进行第二轮扩增,同法进行第三、四轮大量扩增,大量收集第四代病毒液,用腺病毒纯化试剂盒进行纯化。4重组腺病毒滴度测定待HEK293细胞在96孔板中生长至7080%汇合时,以不同稀释倍数的各代病毒液及纯化后病毒液感染细胞,培养48小时后,以GFP阳性细胞计数法测定病毒滴度。病毒滴度=荧光细胞数×病毒液的稀释倍数/病毒液量。5同法扩增并纯化本室前期构建的Ad,并测定病毒滴度。6第3代Ad/MDC-VP1病毒感染HEK293细胞后48小时,分别收集细胞及上清,用Western blot法检测病毒蛋白的表达。7用碱裂解法从转化的DH5α大肠杆菌中大量提取质粒pcDNA3/MDC-VP1,用聚乙二醇沉淀法进行纯化。8动物实验:将68周龄雄性BALB/c小鼠随机分为6组,股四头肌注射质粒或重组腺病毒。Ad/MDC-VP1组（A组）:每次1.2×107pfu/100μl,免疫2次,间隔2w;pcDNA3/MDC-VP1组（B组）:每次100μg/100μl,免疫3次,间隔3w;pcDNA3/MDC-VP1+Ad/MDC-VP1组（C组）:免疫3次,初次接种质粒,间隔3w后接种Ad/MDC-VP1加强2次,间隔2w,剂量同上;Ad/MDC-VP1+pcDNA3 /MDC-VP1组（D组）:免疫3次,前两次接种Ad/MDC-VP1,间隔2w,第3次接种pcDNA3/MDC-VP1,间隔3w,剂量同上;Ad组（E组）:免疫两次,间隔2w,剂量同上;PBS组（F组）:每次100μl,免疫3次,间隔3w。每次免疫后第14天,内眦静脉取血,分离血清,用ELISA检测血清CVB3 VP1特异性IgG水平;用微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）检测血清中CVB3特异性中和抗体水平;末次免疫后3周,每组3只小鼠取脾脏制备淋巴细胞悬液,用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）进行淋巴细胞增殖活性和特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）杀伤活性的检测;每组另取3只小鼠用3LD50CVB3攻击,注射病毒后第7天采血,用于血中病毒滴度的测定;每组剩余12只小鼠用致死量的CVB3(4LD50)进行腹腔注射,观察并记录小鼠存活情况至感染后第21天。结果:1成功构建穿梭质粒pAdTrack-CMV/MDC -VP1,限制酶切分析证明符合预期设计。2成功构建重组腺病毒质粒pAd/MDC-VP1,用PacⅠ酶切得到约30kb的片段和一个4.5kb的小片段。3转染48小时后,荧光显微镜下可观察到HEK293细胞报告基因GFP的表达,重组腺病毒Ad/MDC-VP1包装成功。初代病毒液再次感染HEK293细胞,在荧光显微镜下可观察到逐日明显的细胞病变和荧光聚集,各代病毒液感染细胞后均有彗星样荧光斑块形成。4重组腺病毒Ad/MDC-VP1初代至第四代病毒滴度分别为:2.2×103 pfu/ml、1.3×104 pfu/ml、4×106 pfu/ml和5.8×108 pfu/ml。5重组腺病毒Ad/MDC-VP1三代病毒液感染HEK293细胞48h后,分别提取上清和细胞总蛋白,Western Blot检测显示上清中有表达的融合蛋白MDC-VP1。6各次免疫后血中CVB3 VP1特异性IgG平均水平分别为:A组:1:75.78,1:527.72;B组:1:66.07,1:199.99,1:459.41;C组:1:65.97,1:229.72,1:696.31;D组:1:65.98,1:459.41,1:1392.52;E组和F组均未检测到。单因素方差分析表明除E、F组外,各组VP1特异性IgG逐次增加（P<0.01）;末次免疫后各组比较,抗体滴度由高到低依次为:D组>C组>A组>B组（P<0.05）。7各次免疫后血中CVB3平均中和抗体水平分别为:A组:1:8.41,1:53.38;B组:1:7.07,1:25.2,1:50.39;C组:1:7.49,1:28.28,1:67.26;D组:1:8.41,1:50.39,1:71.26;E组和F组均未检测到。单因素方差分析表明除E、F组外,各组CVB3中和抗体水平逐次增加（P<0.01）;第2次免疫后抗体滴度由高到低依次为:A组>D组>C组>B组（P<0.05）,末次免疫后各组间比较差异无统计学意义。8小鼠脾淋巴细胞增殖试验分别以灭活的CVB3和刀豆蛋A（concanavalin A,ConA）体外刺激淋巴细胞,检测细胞增殖活性。单因素方差分析表明,以CVB3刺激时,各组间比较无统计学意义;以ConA刺激时,C、D组明显高于其他各组（P<0.01）。9小鼠脾脏特异性CTL杀伤活性经单因素方差分析表明,各组杀伤率由高到低依次为C>D>A>B>E>F,两两比较除C和D、D和A差异无统计学意义外,其它各组差异均有统计学意义（P<0.05）。10 3LD50CVB3攻击小鼠后第7d血中病毒滴度测定结果表明A、B、C、D组明显降低,各组间两两比较表明C、D组明显低于B组（P<0.05）。11 4LD50CVB3攻击小鼠后21d生存率分别为:D组:41.7%,C组:33.33%,A、B组:25%,E、F组无存活,经过Kaplan-Meier生存分析表明各组生存时间有差别（P<0.01）。结论:1成功构建并包装重组腺病毒Ad/MDC-VP1,能在HEK293细胞中表达MDC-VP1融合蛋白并分泌到细胞培养液中。2重组腺病毒疫苗Ad/MDC-VP1免疫2次后能提高小鼠体液免疫应答,增强非特异性淋巴细胞增殖活性及特异性CTL杀伤活性,且能降低病毒攻击后的小鼠血中病毒滴度。3重组腺病毒疫苗与核酸疫苗联合应用,体液免疫水平、非特异性淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性明显高于单独免疫组。4当致死量病毒攻击小鼠后,核酸疫苗与腺病毒载体疫苗联合应用能明显延长小鼠生存时间。
唐梦君[7]（2008）在《禽传染性支气管炎病毒基因双顺反子DNA疫苗及mRNA3的分子特性研究》文中认为1、本研究采用PCR扩增获取鸡的IL-2、IL-18基因,将其插入pMD18-T载体中进行测序鉴定。对含有S1、M、N目的基因的pIBVS1、pIBVM、pIBVN质粒进行测序分析。结果表明,IL-2、IL-18、S1、M、N基因全长分别为432bp、536bp、1671bp、678bp和1230bp,鉴定的目的基因正确。以pDsRed-Express-N1载体为骨架,以内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site）序列为连接元件构建绿色和红色荧光基因的双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red,转染Vero细胞后观察到绿色和红色荧光基因均获得表达。构建的pIRES-EGFP/Red载体含有卡那霉素抗性基因,比含有氨苄抗性的双顺反子载体具有更高的生物安全性,为今后开展各种病原微生物双顺反子DNA疫苗的研制提供研究工具。2、用S1、M、N基因与IL-2、IL-18基因分别替换pIRES-EGFP/Red质粒中的荧光基因,构建双顺反子表达质粒pIRES-S1/IL2、pIPES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIPES-M/IL18和pIRES-N/IL18及其单基因表达质粒,转染Vero细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测质粒在体外的表达。RT-PCR检测表明转染了重组质粒的Vero细胞中均能特异的扩增出S1、M、N和（或）IL-2、IL-18基因片段;间接免疫荧光检测表明,转染了重组质粒的细胞显示出黄绿色荧光,而转染了空质粒的细胞则没有显示出任何特异荧光。本研究为IBV结构基因和细胞因子双顺反子DNA疫苗免疫试验提供了材料。3、采用本课题组获得专利（专利号为200410081443.4）的质粒提取、纯化方法制备质粒,将质粒溶液（1mg/mL）与脂质体溶液（10mg/mL）等体积混合配制成DNA疫苗。将配制的DNA疫苗通过腿部肌肉多点注射7日龄非免疫雏鸡,28日龄加强免疫一次。分别在免疫前和免疫后7、14、21、28、35d采血检测ELISA抗体效价和外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的数量。二免后两周用IBV强毒进行攻毒。ELISA抗体水平结果显示:pIRES-S1/IL2、pIPES-M/IL2、pIRES-N/IL2疫苗组产生的抗体水平高于pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N疫苗组,在免疫后14-35d,差异显着（P＜0.05）;pIRES-M/IL18、pIPES-N/IL18疫苗组产生的抗体水平也高于pIpES-M、pIRES-N疫苗组,在免疫后14-35d,差异显着（P＜0.05）,pIRES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗组产生的抗体水平与pIRES-S1+pIRES-IL2、pIRES-S1+pIRES-IL18疫苗组相比在免疫后21-35d差异显着（P＜0.05）:外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示:pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2疫苗组在免疫后7-28d,与pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N疫苗组相比差异显着（P＜0.05）,pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18疫苗组在免疫后14-28d CD3+、CD4+T、CD8+T淋巴细胞亚群的数量高于pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N疫苗组,差异显着（P＜0.05）。pIRES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗组的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量较pIRES-S1+pIRES-IL2、pIRES-S1+pIRES-IL18 DNA疫苗组高,但差异不显着（P＞0.05）。攻毒结果表明,双顺反子DNA疫苗组的保护率介于65%～85%,其中RES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗组的保护率分别为85%和75%,高于混合质粒pIRES-S1+pIRES-IL2、pIRES-S1+pIRES-IL18 DNA疫苗组的70%和60%。其中pIRES-S1/IL2疫苗组的保护率85%高于灭活疫苗组的攻毒保护率75%。本研究研制出的IBV结构蛋白与IL-2、IL-18双顺反子DNA疫苗,为提高IBV DNA疫苗的免疫效率提供了新的途径。4、采用RT-PCR获取IBV E基因,用以替换pIRES-M/Red质粒中的红色荧光基因,构建双顺反子表达质粒pIRES-M/E,转染Vero细胞后进行表达检测。采用本论文第三章的方法制备DNA疫苗和进行动物免疫试验。结果表明:在免疫后7-35d,pIRES-M/E免疫组产生的抗体水平及外周血T淋巴细胞亚群数量高于pIRES-M组,但差异不显着（P＞0.05）;pIRES-M/E、pIRES-M组对强毒的攻击保护率分别为55%和40%,且低于灭活疫苗的攻毒保护率（75%）。本研究构建了IBV的M基因和E基因双顺反子DNA疫苗并对其免疫原性进行了研究,结果初步认为E基因对M基因免疫的协同作用不明显。5、采用RT-PCR方法对IBV mRNA3（3a3b3c）区域进行了克隆、测序及分子特性分析,测序表明3a3b3c片段大小为734bp,包含完整的3a、3b、3c（E）基因,与GenBank上公布的58株IBV毒株的相应序列的同源率介于78.2%～96.1%之间,与CK/CH/LGD/04II毒株和CK/CH/LSC/99I毒株的同源率最高（96.1%和95.9%）。对3a3b序列的RNA二级结构进行预测,结果表明两者具有相同的二级结构,但二级结构的稳定性存在差异。进一步构建3a3b的双荧光基因共表达质粒p3a3b-EGFP/Red,并对其IRES功能进行检测,结果没能检测到3a3b序列下游红色荧光基因的表达。本研究表明3a3b3c序列的分子特征与毒株的遗传变异存在相关性,为IBV的分子流行病学研究提供了新的途径。3a3b基因片段的内部核糖体进入位点功能要弱于脑心肌炎病毒的IRES序列,因此筛选高效的IRES序列用于新疫苗载体的构建还需要进一步研究。
韩新锋[8]（2008）在《串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其免疫原性研究》文中研究表明小鹅瘟（Gosling Plague）是严重危害水禽养殖业的重要传染病之一,其防制措施主要依靠疫苗接种,传统疫苗在预防和控制小鹅瘟时,存在着散毒和免疫应答不完全等缺点。基因疫苗符合未来疫苗的发展方向,具有安全和诱导全面的免疫应答等诸多优点。本研究以小鹅瘟病毒（Goose Parvovirus,GPV）VP3为研究对象,构建了VP3单基因DNA疫苗,为了增强VP3基因疫苗的免疫原性,将鹅白介素-2（Goose Interleukin-2,gIL-2）和VP3基因进行串联融合表达,还嵌入了一段CpG免疫刺激序列,将构建的三种基因疫苗分别免疫28日龄雏鹅和种鹅,并对其诱导鹅产生的体液免疫和细胞免疫进行了比较研究,为研制高效小鹅瘟病毒VP3基因疫苗打下了基础。1.为了探索GPV VP3基因构建基因疫苗的可行性,通过PCR扩增和基因重组技术克隆了GPV VP3基因并将其连接到pMD18T-Simple上,在对VP3基因分子特性、遗传特点和抗原性进行了分析之后,亚克隆到pcDNA3.1（+）CMV启动子下游的HindⅢ和BamHⅠ酶切位点之间,构建了单独表达GPVVP3基因的基因疫苗载体pcDNA-VP3,将其转染真核细胞COS-7后,利用间接免疫荧光抗体试验可以在转染后48h检测到VP3基因的高效表达。2.通过重叠延伸PCR（Splicing by overlap extention PCR）扩增gIL2-VP3串联基因,包含缺失了TAA终止密码子的gIL-2基因和缺失了ATG起始密码子的VP3基因,两个基因之间以高亲水性氨基酸（Gly-Gly-Gly-Ser）编码核苷酸相连接;将gIL2-VP3融合基因通过基因重组技术正向插入到到pcDNA3.1（+）CMV启动子的下游HindⅢ和BamHⅠ酶切位点之间,构建了表达gIL2-VP3融合基因的pcDNA-gIL2-VP3基因疫苗载体,可以在COS-7细胞内高效表达,表达产物的IL-2生物活性可达31.57U/ml。pcDNA-gIL2-VP3基因疫苗载体,可以在COS-7细胞内高效表达,表达产物的IL-2生物活性可达31.57U/ml。3.人工合成在禽体内具有免疫刺激作用的CpG序列,克隆到pMD18T-Simple载体上,然后亚克隆定向插入到pcDNA-gIL2-VP3目的基因终止密码子后的BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点之间,构建成pcDNA-gIL2-VP3/CpG基因疫苗载体,对鹅外周淋巴细胞增殖具有较强的刺激活性（SI=3.06）。4.将三种基因疫苗以50μg、100μg和200μg的不同剂量分别免疫28日龄鹅,分别于基因免疫后第3d、7d、14d、21d、28d、35d和49d颈静脉采集免疫鹅的抗凝血,分离外周血淋巴细胞后,利用MTT比色法检测ConA对鹅外周血淋巴细胞增殖的免疫刺激作用,发现鹅在免疫pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG后第28d体内细胞免疫最强,200μg pcDNA-gIL2-VP3/CpG免疫组外周血淋巴细胞的ConA刺激指数显着高于pcDNA-gIL2-VP3各组（P＜0.05）;显着高于单基因基因疫苗pcDNA-VP3各个剂量组（P＜0.05）。含有佐剂的pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG两种基因疫苗细胞免疫的峰值比单基因VP3 DNA疫苗提前7d。5.将三种基因疫苗以50μg、100μg和200μg不同剂量免疫28日龄鹅,分别于免疫后第3d、7d、14d、21d、35d、49d、63d、77d、105d、133d、161d、189d、217d,采用间接ELISA的方法检测鹅体内IgG的动态变化规律,结果显示,pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG所诱导的体液免疫水平明显高于pcDNA-VP3单基因组,这两种基因疫苗的各个剂量组均在第35d抗体水平达到最高,其中以200μg pcDNA-gIL2-VP3/CpG的ELISA水平最高,显着区别于pcDNA-VP3各剂量免疫组（P＜0.05）和极显着高于各个对照组（P＜0.01）。从pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG诱导鹅的体液免疫强度和维持时间来看,均优于pcDNA-VP3免疫鹅和GPV弱毒免疫鹅。6.将三种基因疫苗以200μg的剂量免疫28日龄鹅,分别于免疫后第15d、30d、45d、60d和75d,采用微量血清中和试验检测基因免疫所诱导的中和抗体水平,结果显示,免疫后第15d就可以检测到中和抗体,鹅血清中和抗体随时间的推移稳定中有所缓慢上升,pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG免疫后第60d的鹅血清中和抗体平均效价分别达到峰值1:178.5和1:198.2,二者之间差异不显着,但是显着高于pcDNA-VP3和GPV弱毒免疫鹅（P＜0.05）。7.将三种GPV VP3基因疫苗以200μg的剂量肌肉注射免疫开产前母鹅,分别在免疫后第7d、14d、28d、42d、56d和第70d收集免疫母鹅所产鹅蛋用作卵黄抗体的检测,另外在免疫后第14d、28d、42d取一批鹅蛋入孵用以孵化小鹅用作雏鹅攻毒保护试验。结果显示不同时间卵黄抗体和中和抗体水平与雏鹅攻毒保护率呈现一定的正相关性,三种基因疫苗以pcDNA-gIL2-VP3/CpG效果最好,具有类似于GPV弱毒苗的免疫保护效果。
李伟[9]（2008）在《柯萨奇病毒B3 VP1蛋白的原核表达及免疫效果观察》文中指出目的:柯萨奇病毒的B组（CVB）是人类病毒性心肌炎的主要病原体,以CVB3最为重要,迄今尚无有效的防治手段。VP1是CVB3的主要衣壳蛋白,含有多个T、B细胞表位,可诱导机体产生免疫应答。研究表明,编码VP1的DNA疫苗能诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答,并对感染小鼠具有一定的保护能力,但不能有效阻止致死量病毒感染。推测与DNA疫苗在体内进入细胞的量较少,目的基因表达水平较低有关。研究表明,蛋白质有很强的免疫原性,免疫动物可诱导产生高效价的抗体。据此,许多人又重新尝试用蛋白质做为疫苗以提高免疫效果。此种疫苗是提取病原体中具有免疫保护作用的蛋白,或利用DNA重组技术使重组体表达这类蛋白、多肽或合成肽制成的疫苗,称为亚单位疫苗。亚单位疫苗不含有感染性组分,无须灭活,也无致病性。自l981年成功地将口蹄疫病毒的VP3基因克隆到大肠埃希氏菌内并制成用于牛和猪的疫苗之后,迄今已研制出包括乙型肝炎疫苗在内的许多亚单位疫苗用于传染病的预防。但也有研究表明,某些病原体亚单位疫苗的免疫原性低,不能达到满意的免疫保护作用。近年有研究显示,采用prime-boost方法将亚单位疫苗与DNA疫苗联合应用能明显提高疫苗的免疫效果。本研究用原核表达系统中表达CVB3 VP1蛋白,单独或采用prime-boost方法与CVB3 VP1 DNA疫苗联合应用免疫小鼠,观察免疫效果。方法: 1利用我室前期构建的真核表达质粒pcDNA3/VP1为模板,用VP1基因的特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物与pGEM-T载体连接,转化入DH5α大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序筛选重组子。2经酶切鉴定和测序确认后,取双酶切的VP1片段和经过同样两种酶酶切的原核表达载体pET-his连接,构建原核表达质粒pET-his/VP1。3将原核表达质粒pET-his/VP1转入表达宿主菌BL21（DE3）pLysS,诱导表达携带有6×HIS标签的VP1蛋白,分别利用HIS单抗和CVB3多抗经Western-blot鉴定无误后对目的蛋白进行初步优化表达。将大量诱导表达后的菌体在冰浴中超声破碎,分离上清和包涵体沉淀,对该蛋白的水溶性进行分析。将包涵体溶液进行SDS-PAGE,切下目的条带,透析袋中透析。定量所得纯化后的蛋白。4用碱裂解法从转化的DH5α大肠杆菌中大量提取质粒pcDNA3/VP1,用聚乙二醇沉淀法进行纯化。5动物实验:将6～8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为5组,分别为PBS对照组、pcDNA3/VP1质粒组、VP1蛋白组、pcDNA3/VP1质粒初免—VP1蛋白加强组（以下简称质粒蛋白组）和VP1蛋白初免—pcDNA3/VP1质粒加强组（以下简称蛋白质粒组）,每组18只;纯化后的质粒用PBS稀释后,股四头肌注射免疫小鼠,纯化后的蛋白以PBS稀释后,腹腔注射免疫小鼠,初次免疫用完全弗氏佐剂,加强免疫用不完全弗氏佐剂。每次每只接种100μg;每3周免疫1次,共免疫3次;每次免疫后第14天,内眦静脉取血,分离血清,用微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）检测血清中CVB3特异性中和抗体的水平;第3次免疫后3周,每组3只小鼠取脾脏制备淋巴细胞悬液,采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8, CCK-8）法进行特异性淋巴细胞增殖活性和特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）杀伤活性的检测;另每组12只小鼠用致死量的CVB3（4LD50）进行腹腔注射,观察并记录小鼠死亡情况至感染后第21天;每组剩余的3只小鼠用3LD50CVB3攻击,注射病毒后第7天处死,用于血中病毒滴度的测定。结果: 1用PCR从质粒中扩增出VP1基因片段,DNA测序证实此基因片段与报道的基因序列一致。2成功构建了原核表达质粒pET-his/VP1,双酶切结果证实插入和连接均正确。3在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中成功表达了CVB3 VP1蛋白,表达蛋白主要以包涵体形式存在。Western-blot证实表达的蛋白可与HIS单抗和CVB3多抗产生特异性反应。4不同免疫次数,各组血清中和抗体的平均效价分别为:PBS对照组未检测到;pcDNA3/VP1质粒组1:5.62,1:15.85,1:23.71;VP1蛋白组1:8.91,1:44.67,1:70.79;质粒蛋白组1:5.62,1:15.85,1:33.5;蛋白质粒组1:8.91,1:44.67,1:56.23。单因素方差分析表明,三次免疫后,除PBS组外,其余各组中和抗体滴度逐次增加（P<0.05）;三次免疫后,蛋白组、质粒蛋白组和蛋白质粒组中和抗体滴度高于pcDNA3/VP1组（P<0.05）。5小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验分别以CVB3和刀豆蛋A（concanavalin A, ConA）体外刺激淋巴细胞,检测细胞增殖活性。单因素方差分析表明,以CVB3刺激时,与PBS组和pcDNA3/VP1组相比,蛋白质粒组的增殖活性显着升高（P<0.05）;以ConA刺激时,蛋白组和蛋白质粒组均显着高于PBS组（P<0.05）。6小鼠脾脏特异性CTL杀伤活性经单因素方差分析表明,质粒蛋白组在所有实验组中杀伤活性最高,PBS免疫组则最低,但两两比较无统计学意义。7用4LD50攻击小鼠,各组21天生存率分别为:蛋白组、质粒蛋白组和蛋白质粒组生存率达33.33%,而pcDNA3/VP1质粒组仅为8.33% , PBS组无存活。经χ2检验,蛋白组、质粒蛋白组和蛋白质粒组和对照组比较均差别有统计学意义。加强组小鼠的生存状况好于PBS组和pcDNA3/VP1质粒组（P<0.05）。8与几个对照组相比,蛋白组、质粒蛋白组和蛋白质粒组小鼠血中病毒滴度显着降低（P<0.05）。结论:1成功构建了CVB3VP1基因原核表达质粒pET-his/VP1。2成功表达、纯化出CVB3 VP1蛋白。3小鼠血清中和抗体滴度随免疫次数的增加而提高,三次免疫后,VP1蛋白参与的三种免疫方法诱导的和抗体水平高于DNA疫苗组。4蛋白-质粒免疫加强法能够增强小鼠淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤水平。5用致死量CVB3攻击小鼠后,蛋白组、质粒蛋白组和蛋白质粒组的小鼠生存率和存活时间均有所提高。
邱妍[10]（2007）在《四种中药多糖增强免疫和抗病毒作用及机理研究》文中认为在动物生产中，通过应用免疫增强剂提高免疫功能，从而增强对病毒性传染病的抵抗力具有重要意义。然而目前常用的免疫增强剂大多是化学合成类，存在药物残留隐患。随着人们对食品安全的关注，天然药物显示出一定优势。研究表明，许多中药成分有免疫增强作用。多糖为一类重要的中药成分，不仅有抗病毒的作用，而且能增加机体的免疫能力，作为免疫增强剂具有安全低毒、不易在畜产品中产生有害残留等优点。本研究选择4种中药多糖为研究对象，从体内、体外两个方面研究了它们的增强免疫和抗病毒的作用和机理，旨在为开发多糖类免疫增强剂提供理论依据。研究分为以下8个部分：试验Ⅰ、四种中药多糖的制备为了给整个研究准备材料，选择文献报道具有较好免疫增强作用的黄芪多糖（APS）、板蓝根多糖（IRPS）、山药多糖（CYPS）、牛膝多糖（ARPS）4种中药多糖作为研究对象。采用水煎醇沉法提取，用硫酸蒽酮法测定多糖的含量。结果，APS、IRPS、CYPS、ARPS的提取率（g／Kg）分别为37.4、59.1、53.6、48.9，糖含量（％）分别为65.8、56.7、73.5、54.9。试验Ⅱ、四种多糖对新城疫病毒感染细胞能力的影响为了评价4种多糖的抗病毒作用和机理，将黄芪多糖（APS）、板蓝根多糖（IRPS）、牛膝多糖（ARPS）和山药多糖（CYPS）与新城疫病毒以3种顺序加入培养的鸡胚成纤维细胞单层上，即先加多糖、先接种病毒、病毒和多糖感作后同时加入，观察细胞病变程度，并用MTT法测定细胞OD值的变化，以评价它们对新城疫病毒感染细胞能力的影响。结果显示，APS和IRPS的效果较好，而且先加多糖后接种病毒可以减轻病毒造成的细胞病变，且有一定的量效关系。表明，多糖的临床应用以早给药的效果为好。试验Ⅲ、四种多糖对鸡脾脏淋巴细胞增殖及一氧化氮的影响为了研究4种中药多糖增强细胞免疫的作用和机理，将5种浓度的黄芪多糖（APS）、板蓝根多糖（IRPS）、牛膝多糖（ARPS）和山药多糖（CYPS）分别加入到培养的鸡脾脏淋巴细胞中，培养24h时收集细胞培养上清液，测定一氧化氮含量和一氧化氮合酶的活力；培养48h时用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果表明，适宜浓度的4种多糖均能提高细胞培养液中一氧化氮的含量、一氧化氮合酶的活力和促进淋巴细胞增殖，且效果相当。这可能是多糖提高细胞免疫功能的机理之一。试验Ⅳ、四种多糖对鸡外周血淋巴细胞IL-4和IFN-γ的mRNA表达的影响为了研究4种中药多糖增强免疫的作用和分子机理，用Primer Premier软件设计了一对白介素-4（interleukin-4，IL-4）引物，一对干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）引物。用荧光定量PCR方法测定4种多糖对鸡外周血T淋巴细胞IL-4、IFN-γ的mRNA表达的影响。结果表明，合适剂量的APS、IRPS、ARPS和CYPS均能提高淋巴细胞IL-4、IFN-γ的mRNA表达水平，APS、IRPS的效果优于ARPS、CYPS。这可能是多糖增强免疫的分子机制之一。试验Ⅴ、四种多糖对小鼠腹腔巨噬细胞功能、溶血素及溶血空斑形成的影响及剂量筛选为了观察4种多糖对非特异性免疫功能的影响并筛选出合适的剂量，选取102只小鼠随机分为17组，16个试验组的小鼠分别腹腔注射4种浓度的黄芪多糖（APS）、板蓝根多糖（IRPS）、牛膝多糖（ARPS）和山药多糖（CYPS）溶液，对照组注射生理盐水，每天1次，连续3天。第8天分别测定腹腔巨噬细胞吞噬功能、溶血素及溶血空斑的变化。结果显示，4种多糖均能增强巨噬细胞的吞噬功能，提高溶血空斑及溶血素水平；APS在30 mg·kg-1、IRPS在20 mg·kg-1、ARPS和CYPS在50 mg·kg-1时的效果较好。试验Ⅵ、四种多糖对免疫雏鸡抗体效价及免疫器官指数的影响为了研究4种多糖增强特异性体液免疫和非特异性免疫的作用和机理，选取450羽罗曼公鸡随机均分成9组，14日龄用新支二联弱毒苗点眼滴鼻首免、28日龄肌肉注射二免，在首次免疫的同时，8个试验组分别肌肉注射高、低剂量的黄芪多糖（APS）、板蓝根多糖（IRPS）、牛膝多糖（ARPS）和山药多糖（CYPS）溶液，对照组注射生理盐水，每天1次，连续注射3次。分别于首次免疫后第7、14、21、28、35、42、49和56天，用微量法测定新城疫HI抗体效价；于首次免疫后第10、20、30、40、50和60天，称取体重、脾脏、胸腺和法氏囊的重量，计算免疫器官指数。结果，低剂量的APS、IRPS和高剂量的ARPS、CYPS均能显着提高ND HI抗体效价和免疫器官指数，且低剂量的APS、IRPS效果较好。表明4种多糖既可以协同疫苗增强特异性免疫，也能促进免疫器官的发育以提高非特异性免疫。试验Ⅶ、四种多糖对免疫雏鸡T淋巴细胞增殖及其CD4+、CD8+亚群的影响为了研究4种多糖体内增强细胞免疫的作用和机理，选取450羽罗曼公鸡随机均分成9组，14日龄用新支二联弱毒苗点眼滴鼻首免、28日龄肌肉注射二免，在首次免疫的同时，8个试验组分别肌肉注射高、低剂量的黄芪多糖、板蓝根多糖、牛膝多糖和山药多糖溶液，对照组注射生理盐水，每天1次，连续注射3次。于首次免疫后第10、20、30、40、50和60天，分别用MTT法和流式细胞仪双染色法测定外周血T淋巴细胞增殖和CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞含量的动态变化。结果表明，4种多糖均能显着促进外周血中T淋巴细胞增殖，提高CD3+、CD3+CD4+T淋巴细胞含量和CD4+／CD8+的比值，低剂量的APS和IRPS的效果最好。这可能是4种多糖增强细胞免疫的机理之一。试验Ⅷ、四种多糖对免疫雏鸡黏膜免疫功能的影响为了研究4种多糖增强黏膜免疫的作用和机理，选取450羽罗曼公鸡随机均分成9组，14日龄用新支二联弱毒苗点眼滴鼻首免、28日龄肌肉注射二免，在首次免疫的同时，8个试验组分别肌肉注射高、低剂量的黄芪多糖、板蓝根多糖、牛膝多糖和山药多糖溶液，对照组注射生理盐水，每天1次，连续注射3次。于首次免疫后第10、20、30、40、50和60天，用ELISA方法测定空肠黏液中SIgA的含量，用免疫组织化学法测定盲肠扁桃体和十二指肠绒毛SIgA细胞阳性面积。结果，4种多糖均能显着提高肠黏液中SIgA的含量和盲肠扁桃体、小肠绒毛的SIgA阳性细胞数，低剂量的APS、IRPS和高剂量的ARPS、CYPS效果较好。表明，4种多糖可以有效地增强黏膜的屏障作用，从而提高机体的抗感染能力。
二、白细胞介素-2基因佐剂对柯萨奇病毒B3VP1基因疫苗的免疫增强作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、白细胞介素-2基因佐剂对柯萨奇病毒B3VP1基因疫苗的免疫增强作用（论文提纲范文）
（1）白细胞介素-15在感染性疾病中作用的研究进展（论文提纲范文）
| 1 IL-15 的主要生物学特性 |
| 2 IL-15 在感染性疾病中的作用 |
| 2. 1 病毒性疾病 |
| 2.1.1人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiencyvirus,HIV) |
| 2.1.2肝炎病毒 |
| 2.1.3柯萨奇病毒 |
| 2. 2 细菌性疾病 |
| 2.2.1李斯特菌 |
| 2.2.2结核分枝杆菌 |
| 2. 3 寄生虫 |
| 2.3.1克氏锥虫 |
| 2.3.2弓形虫 |
| 3 结语 |
（2）CVB3腺病毒载体Ad/sVP1-C3d3的构建及免疫效果研究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 构建包装重组腺病毒Ad/sVP1-C3d3[3] |
| 1.2.2 扩增并纯化重组腺病毒Ad/sVP1-C3d3 |
| 1.2.3 动物接种 |
| 1.2.4 血清IgG抗体检测 |
| 1.2.5 中和抗体检测 |
| 1.2.6 CTL杀伤活性的测定 |
| 1.2.7 小鼠血清病毒滴度的测定 |
| 1.2.8 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 构建质粒pAdTrack-CMV/sVP1-C3d3 |
| 2.2 构建重组腺病毒质粒pAd/sVP1-C3d3 |
| 2.3 重组腺病毒在293细胞中包装成功 |
| 2.4 IgG抗体检测结果 |
| 2.5 中和抗体检测结果 |
| 2.6 特异性CTL杀伤活性 |
| 2.7 血中病毒滴度 |
| 3 讨论 |
（3）堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗免疫保护作用及免疫机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡球虫病的危害及防治现状 |
| 1 堆型艾美耳球虫生活史 |
| 2 堆型艾美耳球虫的流行状况 |
| 3 堆型艾美耳球虫病的症状及致病作用 |
| 4 鸡球虫病的防治现状 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡球虫病的免疫保护作用机制 |
| 1 发展历史 |
| 2 体液免疫 |
| 3 细胞免疫 |
| 4 局部免疫 |
| 5 细胞因子作用 |
| 参考文献 |
| 第三章 DNA疫苗研究进展 |
| 1 DNA疫苗的发展 |
| 2 DNA疫苗的免疫应答机制 |
| 3 影响DNA免疫效果的主要因素 |
| 4 DNA疫苗的优点 |
| 5 DNA疫苗存在的问题 |
| 6 鸡球虫DNA疫苗研究进展 |
| 参考文献 |
| 第四章 细胞因子作为免疫佐剂研究进展 |
| 1 细胞因子概述 |
| 2 细胞因子作为DNA疫苗佐剂的作用机制 |
| 3 细胞因子作为DNA疫苗佐剂的应用研究 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第五章 堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第六章 堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶的原核表达与纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第七章 堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗的构建及体内表达检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第八章 堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗动物保护性试验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第九章 堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗诱导淋巴细胞增殖反应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第十章 堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗诱导T淋巴细胞亚类反应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第十一章 堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA诱导细胞因子变化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第十二章 堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗诱导抗体反应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）IL-2、IFN-γ和GM-CSF基因佐剂对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗免疫作用的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒和实验动物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 免疫接种 |
| 1.4 血清中和抗体的检测 |
| 1.5 脾淋巴细胞增殖实验 |
| 1.6 特异性CTL检测 |
| 1.7 统计学处理 |
| 2 结 果 |
| 2.1 血清特异性中和抗体水平 |
| 2.2 脾脏淋巴细胞增殖活性 |
| 2.3 特异性CTL杀伤反应 |
| 3 讨 论 |
（5）柯萨奇病毒B3腺病毒载体疫苗Ad/sVP1的构建及免疫效果的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究论文 柯萨奇病毒 B3 腺病毒载体疫苗 Ad/sVP1的构建及免疫效果的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 病毒载体在疫苗研制中的发展及应用 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）CVB3疫苗Ad/MDC-VP1与pcDNA3/MDC-VP1联合应用的免疫效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究论文 CVB3 疫苗 Ad/MDC-VP1 与 pcDNA3/MDC -VP1联合应用的免疫效果研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Prime-boost免疫策略的研究现状 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）禽传染性支气管炎病毒基因双顺反子DNA疫苗及mRNA3的分子特性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 选题背景 |
| 1.禽传染性支气管炎研究概况 |
| 2.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究概况 |
| 3.细胞因子作为基因佐剂的研究进展 |
| 4.双顺反子质粒载体的国内外研究进展 |
| 5.禽传染性支气管炎病毒分子生物学及mRNA3分子特性研究进展 |
| 本研究前期工作基础 |
| 存在的主要问题 |
| 本研究的内容和目的意义 |
| 第一章 S1、M、N、IL-2、IL-18目的基因鉴定及双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的构建、鉴定 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌和细胞株 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IL-2、IL-18基因的扩增及测序鉴定 |
| 2.2.2 IBV S1、M、N结构基因的测序鉴定 |
| 2.2.3 中间质粒pcEGFP的构建 |
| 2.2.4 中间质粒pEGFP-IRES的构建 |
| 2.2.5 双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的构建 |
| 2.2.6 双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的表达检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 IL-2、IL-18基因的扩增及测序结果 |
| 3.2 IBV S1、M、N结构基因的测序结果 |
| 3.3 中间质粒pcEGFP的酶切鉴定 |
| 3.4 中间质粒pEGFP-IRES的酶切鉴定 |
| 3.5 双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的酶切鉴定 |
| 3.6 双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red表达检测结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 S1、M、N、IL-2、IL-18目的基因的测序鉴定 |
| 4.2 双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的构建与鉴定 |
| 5.小结 |
| 第二章 禽传染性支气管炎病毒结构蛋白基因S1、M、N分别与IL-2/IL-18双顺反子表达质粒的构建及鉴定 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌和细胞株 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 中间质粒pIRES-S1/Red、pIRES-M/Red、pIRES-N/Red的构建 |
| 2.2.2 双顺反子表达质粒pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2的构建 |
| 2.2.3 双顺反子表达质粒pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18的构建 |
| 2.2.4 pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N质粒的构建 |
| 2.2.5 pIRES-IL2、pIRES-IL18质粒和空质粒的构建 |
| 2.2.6 双顺反子表达质粒pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18的表达检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 pIRES-S1/Red、pIRES-M/Red、pIRES-N/Red质粒的酶切鉴定 |
| 3.2 S1、M、N基因分别与IL-2、IL-18双顺反子质粒的酶切鉴定 |
| 3.3 pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N质粒的酶切鉴定 |
| 3.4 pIRES-IL2、pIRES-IL18质粒和空质粒的酶切鉴定 |
| 3.5 S1、M、N基因分别与IL-2、IL-18双顺反子质粒转录产物的RT-PCR检测结果 |
| 3.6 S1、M、N基因分别与IL-2、IL-18双顺反子质粒表达产物的间接免疫荧光检测结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 结构基因与细胞因子双顺反子表达质粒的构建策略 |
| 4.2 双顺反子表达质粒转染真核细胞的方法 |
| 4.3 传染性支气管炎病毒结构蛋白基因的体外表达 |
| 5.小结 |
| 第三章 pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18双顺反子DNA疫苗的配制和免疫原性研究 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物和攻毒用毒株 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 质粒的制备与纯化 |
| 2.2.2 脂质体的制备、转染效率的检测 |
| 2.2.3 DNA疫苗的配制 |
| 2.2.4 pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18双顺反子DNA疫苗的免疫原性研究 |
| 3.结果 |
| 3.1 质粒的鉴定 |
| 3.2 脂质体的电镜观察 |
| 3.3 脂质体的转染效率检测 |
| 3.4 pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18双顺反子DNA疫苗免疫后ELISA抗体效价的检测结果 |
| 3.5 pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18双顺反子DNA疫苗免疫后外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的检测结果 |
| 3.6 攻毒实验结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 质粒的制备和DNA疫苗的配制 |
| 4.2 S1、M、N基因与IL-2/IL-18双顺反子DNA疫苗的免疫效果 |
| 4.3 双顺反子DNA疫苗与混合DNA疫苗免疫效果的比较 |
| 4.4 关于攻毒保护率 |
| 5.小结 |
| 第四章 pIRES-M/E真核表达质粒的构建及免疫原性研究 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、细胞株和实验动物 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒RNA提取 |
| 2.2.2 E基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2.3 双顺反子表达质粒pIRES-M/E的构建 |
| 2.2.4 双顺反子表达质粒pIRES-M/E的表达检测 |
| 2.2.5 DNA疫苗的制备 |
| 2.2.6 pIRES-M/E双顺反子DNA疫苗免疫后ELISA抗体效价的检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 E基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 E基因的测序结果 |
| 3.3 双顺反子表达质粒pIRES-M/E的酶切鉴定 |
| 3.4 转录产物的RT-PCR检测结果 |
| 3.5 pIRES-M/E双顺反子DNA疫苗的制备 |
| 3.6 pIRES-M/E双顺反子DNA疫苗免疫后ELISA抗体效价的检测结果 |
| 3.7 pIRES-M/E双顺反子DNA疫苗免疫后外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量的检测结果 |
| 3.8 攻毒保护 |
| 4.讨论 |
| 4.1 M基因和E基因共表达DNA疫苗的免疫原性 |
| 5.小结 |
| 第五章 禽传染性支气管炎病毒mRNA3的分子特性研究及其内部核糖体进入功能的检测 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 种毒、宿主菌和质粒 |
| 2.1.2 分子生物学试剂 |
| 2.1.3 生化试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的增殖 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取 |
| 2.2.3 引物的设计与合成 |
| 2.2.4 mRNA3(3a3b3c)RT-PCR扩增、克隆及序列分析 |
| 2.2.5 3a3b二级结构预测 |
| 2.2.6 重组质粒p3a3b-EGFP/Red的构建及鉴定 |
| 2.2.7 p3a3b-EGFP/Red与pIRES-EGFP/Red比较,分析3a3b内部核糖体进入位点的功能 |
| 3.结果 |
| 3.1 mRNA3(3a3b3c)RT-PCR扩增、克隆测序、序列分析结果 |
| 3.2 3a3b二级结构预测结果 |
| 3.3 重组质粒p3a3b-EGFP/Red的鉴定结果 |
| 3.4 p3a3b-EGFP/Red与pIRES-EGFP/Red的比较及3a3b内部核糖体进入位点的分析结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 本研究所用毒株的mRNA3(3a3b3c)分子与国内外的比较及特点 |
| 4.2 3a3b编码区二级结构预测结果 |
| 4.3 3a3b与IRES序列的功能比较 |
| 5.小结 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 1.禽传染性支气管病毒的概述 |
| 2.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究进展 |
| 3.细胞因子作为基因佐剂的研究进展 |
| 4.双顺反子表达质粒的国内外研究进展 |
| 5.禽传染性支气管炎病毒分子生物学及mRNA3分子特性研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在读博士期间发表的论文情况 |
（8）串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 本文创新性研究工作 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 小鹅瘟的研究进展 |
| 1 小鹅瘟病毒的病原学特征 |
| 1.1 小鹅瘟病毒的理化特征 |
| 1.2 小鹅瘟病毒的宿主范围和培养特性 |
| 1.3 基因组分子生物学 |
| 1.4 蛋白质分子生物学 |
| 2 流行病学 |
| 3 临床症状和病理变化 |
| 3.1 肠道变化 |
| 3.2 其他组织器官的变化 |
| 4 小鹅瘟诊断方法 |
| 5 小鹅瘟病毒的基因克隆以及体外编码蛋白的研究 |
| 6 综合防制 |
| 7 研究展望 |
| 第二章 增强基因疫苗免疫效果的策略 |
| 1 基因疫苗的免疫学优势和所存在的问题 |
| 1.1 基因疫苗的免疫学优势 |
| 1.1.1 诱导全方位的免疫应答 |
| 1.1.2 不同血清亚型的交叉免疫 |
| 1.1.3 嵌合免疫、多重免疫及联合免疫 |
| 1.1.4 长期免疫 |
| 1.1.5 性质稳定,安全性好,受母源抗体影响小 |
| 1.2 制约基因疫苗免疫效果的因素 |
| 1.2.1 依赖宿主产生抗原 |
| 1.2.2 宿主细胞内外屏障 |
| 1.2.3 抗原表达量低 |
| 2 增强基因疫苗免疫效果的一些策略 |
| 2.1 基因疫苗质粒的优化 |
| 2.1.1 选择强的转录启动子 |
| 2.1.2 注意密码子的偏嗜 |
| 2.1.3 构建双向或双顺反子质粒 |
| 2.1.4 载体中的免疫刺激性序列(ISS) |
| 2.1.5 其它元件 |
| 2.2 免疫接种系统和途径的选择 |
| 2.2.1 接种方法 |
| 2.2.2 接种途径 |
| 2.2.3 免疫动物的预处理 |
| 2.3 克服细胞内、外屏障 |
| 2.3.1 使用脂质体、亚精胺和核酸酶抑制剂 |
| 2.3.2 抗原蛋白的泛素化表达 |
| 2.3.3 内质网转运信号序列 |
| 2.3.4 基因疫苗的细菌传送系统 |
| 2.4 优化免疫应答趋向类型 |
| 2.4.1 和细胞因子共表达 |
| 2.4.2 共刺激信号分子 |
| 2.4.3 初次免疫和加强免疫使用相同抗原的不同类型的疫苗 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 小鹅瘟病毒VP3基因的克隆和分子特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒及核酸 |
| 1.2 试验动物和鹅胚 |
| 1.3 质粒与感受态细胞 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 GPV CHv-1强毒株的增殖 |
| 2.2 病毒基因组DNA的提取 |
| 2.3 引物设计 |
| 2.4 VP3基因的PCR扩增 |
| 2.5 PCR产物的凝胶试剂盒回收和纯化 |
| 2.6 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备 |
| 2.7 VP3基因加A尾以及与T载体的连接 |
| 2.8 重组质粒的转化 |
| 2.9 碱裂解法小量抽提重组质粒 |
| 2.10 重组质粒的酶切鉴定及PCR鉴定 |
| 2.11 VP3基因序列测定 |
| 2.12 VP3基因及推导蛋白质的二级结构及B细胞抗原表位预测 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR结果 |
| 3.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.3 CHv-1株VP3基因测序结果及其与标准株的比较分析 |
| 3.4 GPV VP3基因的遗传特点 |
| 3.5 GPV CHv-1 VP3基因推导蛋白质二级结构预测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于GPV VP3基因的PCR扩增 |
| 4.2 GPV CHv-1株VP3基因的序列测定和结果分析 |
| 4.3 GPV VP3基因用于构建基因疫苗的可行性 |
| 5 小结 |
| 第四章 小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其在真核细胞的表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及质粒 |
| 1.2 毒株、细胞及鸭胚 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 T载体的酶切和VP3基因片段的纯化回收 |
| 2.2 真核表达载体pcDNA3.1(+)的酶切和线性化 |
| 2.3 VP3基因回收片段和线性化pcDNA3.1(+)的连接(亚克隆) |
| 2.4 感受态细胞的制备 |
| 2.5 真核重组表达载体的转化 |
| 2.6 阳性重组真核表达质粒的小量抽提和鉴定 |
| 2.7 GPV病毒提纯及兔抗GPV多克隆抗体的制备 |
| 2.8 pcDNA-VP3转染COS-7真核细胞 |
| 2.9 间接免疫荧光抗体法检测pcDNA-VP3在真核细胞的瞬时表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 VP3基因的亚克隆 |
| 3.2 兔抗GPV IgG的纯化结果 |
| 3.3 真核表达质粒在COS-7细胞上的瞬时表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 构建小鹅瘟基因疫苗的必要性 |
| 4.2 构建基因疫苗的一些影响因素 |
| 4.3 GPV VP3基因疫苗在真核细胞的表达 |
| 5 小结 |
| 第五章 串联鹅IL-2的小鹅瘟病毒VP3融合基因DNA疫苗的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 重叠延伸引物的设计 |
| 2.2 碱裂解法小量抽提pMD18T-gIL2和pMD18T-VP3 |
| 2.3 gIL-2基因的PCR扩增 |
| 2.4 VP3基因的PCR扩增 |
| 2.5 gIL-2和VP3基因PCR产物的回收和纯化 |
| 2.6 gIL2-VP3融合基因的SOE PCR扩增 |
| 2.7 融合基因PCR产物的纯化和回收 |
| 2.8 克隆至pMD18T-Simple载体和转化受体菌 |
| 2.9 融合基因gIL2-VP3的亚克隆 |
| 2.10 融合基因真核表达载体的鉴定 |
| 2.11 融合蛋白的生物信息学分析 |
| 2.12 间接免疫荧光抗体法检测pcDNA-gIL2-VP3在真核细胞上的表达 |
| 2.13 pcDNA-gIL2-VP3表达蛋白的gIL-2生物学活性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 gIL2-Linker的初次PCR结果 |
| 3.2 GPV的Linker-VP3初次PCR结果 |
| 3.3 gIL2-VP3融合基因的PCR结果 |
| 3.4 融合基因的T载体克隆和测序结果 |
| 3.5 pcDNA-gIL2-VP3真核表达载体的构建结果 |
| 3.6 gIL2-VP3融合基因的生物信息学分析 |
| 3.7 间接免疫荧光抗体法检测pcDNA-gIL2-VP3在真核细胞中的表达 |
| 3.8 表达蛋白的gIL-2生物学活性测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于鹅白介素-2(gIL-2)的佐剂效应 |
| 4.2 关于重叠延伸PCR |
| 4.3 融合基因gIL2-VP3的分子结构特点 |
| 4.4 gIL-2信号肽引导的分泌表达 |
| 5 小结 |
| 第六章 CpG序列嵌入串联鹅IL-2的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗中的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 CpG的合成及T载体克隆 |
| 2.2 pMD18 T-CpG的酶切和回收 |
| 2.3 pcDNA-gIL2-VP3的酶切和回收 |
| 2.4 CpG和线性pcDNA-gIL2-VP3的连接 |
| 2.5 感受态细胞的制备 |
| 2.6 连接产物的转化 |
| 2.7 pcDNA-gIL2-VP3/CpG重组质粒的筛选 |
| 2.8 pcDNA-gIL2-VP3/CpG真核表达质粒在真核细胞的表达 |
| 2.9 pcDNA-gIL2-VP3/CpG对鹅外周血淋巴细胞的免疫刺激作用 |
| 3 结果 |
| 3.1 pMD18 T-CpG的测序结果 |
| 3.2 pMD18T-CpG的酶切鉴定 |
| 3.3 pcDNA-gIL2-VP3/CpG的构建及其鉴定 |
| 3.4 间接免疫荧光抗体试验检测pcDNA-gIL2-VP3/CpG在真核细胞的表达 |
| 3.5 CpG序列对鹅外周血淋巴细胞的增殖效应 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于CpG ODN的设计和嵌入质粒的构建 |
| 4.2 CpG序列的免疫佐剂效应 |
| 5 小结 |
| 第七章 串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗诱导鹅细胞免疫的比较研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种和质粒 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 基因疫苗的大量制备 |
| 2.2 聚乙二醇法(PEG-8000)纯化基因疫苗质粒 |
| 2.3 雏鹅的分组免疫及血样采集 |
| 2.4 鹅外周血(PBMC)淋巴细胞增殖试验(MTT法) |
| 2.4.1 外周血淋巴细胞的分离 |
| 2.4.2 淋巴细胞的诱导培养 |
| 2.4.3 样品检测及数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 基因疫苗免疫动物后健康状况 |
| 3.2 鹅免疫GPV VP3基因疫苗后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.3 pcDNA-VP3基因疫苗免疫鹅后外周血淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.4 pcDNA-gIL2-VP3免疫鹅后外周血淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.5 pcDNA-gIL2-VP2/CpG免疫鹅后外周血淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.6 GPV VP3基因疫苗免疫鹅后外周淋巴血细胞增殖试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 细胞免疫对于防治感染性疾病的重要性 |
| 4.2 细胞免疫和淋巴细胞体外增殖的关系 |
| 4.3 分子免疫佐剂对基因疫苗诱导的细胞免疫反应的影响 |
| 4.4 免疫途径、剂量对细胞免疫的影响 |
| 5 小结 |
| 第八章 串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗诱导鹅体液免疫的比较研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、质粒及疫苗 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 鹅血清IgG的纯化 |
| 2.2 兔抗鹅辣根过氧化物(HRP)酶标抗体的制备 |
| 2.3 间接ELISA的操作方法 |
| 2.4 抗原最适浓度和最适鹅血清稀释度的确定 |
| 2.5 酶标抗体稀释度的选择 |
| 2.6 GPV VP3基因疫苗免疫雏鹅后血清IgG水平的检测 |
| 2.7 GPV CHa弱毒株TCID_(50)的测定 |
| 2.8 GPV VP3基因疫苗免疫雏鹅后血清中和抗体水平的检测 |
| 2.9 种鹅的分组免疫及所产蛋卵黄ELISA抗体和中和抗体的检测 |
| 2.10 免疫种鹅所产蛋孵出的小鹅攻毒保护试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔抗鹅HRP酶标抗体的制备 |
| 3.2 抗原包被浓度和鹅血清稀释度的确定 |
| 3.3 HRP酶标兔抗鹅二抗工作浓度的确定 |
| 3.4 间接ELISA检测鹅免疫GPV VP3基因疫苗后的IgG动态变化结果 |
| 3.5 间接ELISA检测鹅免疫pcDNA-VP3后IgG动态变化 |
| 3.6 间接ELISA检测鹅免疫pcDNA-gIL2-VP3基因疫苗后IgG动态变化 |
| 3.7 间接ELISA检测鹅免疫pcDNA-gIL2-VP3/CpG基因疫苗后IgG动态变化 |
| 3.8 间接ELISA检测鹅免疫GPV VP3基因疫苗后IgG动态变化结果 |
| 3.9 病毒TCID_(50)的测定 |
| 3.10 鹅基因免疫后血清中和抗体试验检测结果 |
| 3.11 母鹅卵黄抗体ELISA检测结果和中和抗体试验结果 |
| 3.12 雏鹅攻毒保护试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ELISA标准方法的建立 |
| 4.2 关于GPV VP3基因疫苗诱导的体液免疫 |
| 4.3 免疫佐剂对体液免疫的影响 |
| 4.4 雏鹅攻毒保护试验 |
| 5 小结 |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 第五部分 附件材料 |
| 附录一 主要溶液试剂的配制 |
| 附录二 雏鹅攻毒保护试验中发病鹅的主要临床症状和病变 |
| 附录三 测序报告 |
| 1.pMD18T-VP3测序结果 |
| 2.pMD18T-gIL2-VP3测序结果 |
| 3.pMD18T-CpG测序结果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）柯萨奇病毒B3 VP1蛋白的原核表达及免疫效果观察（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究论文 柯萨奇病毒B3 VP1 蛋白的原核表达及免疫效果观察 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 亚单位疫苗的研究进展 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）四种中药多糖增强免疫和抗病毒作用及机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 文献综述 |
| 第一章 免疫增强剂的研究进展 |
| 1 动物的免疫 |
| 2 免疫增强剂的分类 |
| 3 常用的免疫增强剂 |
| 4 免疫增强剂的评价标准 |
| 参考文献 |
| 第二章 多糖抗病毒及增强免疫研究进展 |
| 1 多糖的抗病毒研究进展 |
| 2 多糖的免疫调节作用及机制 |
| 3 本研究的目的意义 |
| 参考文献 |
| 实验研究 |
| 第三章 四种中药多糖的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 四种多糖对新城疫病毒感染细胞能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 四种多糖对鸡脾脏淋巴细胞的增殖和一氧化氮分泌的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 四种多糖对鸡外周血淋巴细胞IL-4和IFN-γ的mRNA表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 四种多糖对小鼠腹腔巨噬细胞功能、溶血素及溶血空斑形成的影响及剂量筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 四种多糖对免疫雏鸡抗体效价及免疫器官指数的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第九章 四种多糖对免疫雏鸡T淋巴细胞增殖及其CD4~+、CD8~+亚群的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第十章 四种多糖对免疫雏鸡黏膜免疫功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表和完成的学术论文 |
四、白细胞介素-2基因佐剂对柯萨奇病毒B3VP1基因疫苗的免疫增强作用（论文参考文献）
- [1]白细胞介素-15在感染性疾病中作用的研究进展[J]. 孙源彬,陈丽丽. 中国生物制品学杂志, 2016(04)
- [2]CVB3腺病毒载体Ad/sVP1-C3d3的构建及免疫效果研究[J]. 李嘉,李剑,羡鲜,刘贵霞,蓝佳明,金玉怀,谢立新,张桓,王永祥. 细胞与分子免疫学杂志, 2011(01)
- [3]堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗免疫保护作用及免疫机理研究[D]. 宋鸿雁. 南京农业大学, 2010(06)
- [4]IL-2、IFN-γ和GM-CSF基因佐剂对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗免疫作用的影响[J]. 李琳,王永祥. 护理实践与研究, 2010(06)
- [5]柯萨奇病毒B3腺病毒载体疫苗Ad/sVP1的构建及免疫效果的研究[D]. 李嘉. 河北医科大学, 2009(10)
- [6]CVB3疫苗Ad/MDC-VP1与pcDNA3/MDC-VP1联合应用的免疫效果研究[D]. 闫立景. 河北医科大学, 2009(10)
- [7]禽传染性支气管炎病毒基因双顺反子DNA疫苗及mRNA3的分子特性研究[D]. 唐梦君. 四川农业大学, 2008(01)
- [8]串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其免疫原性研究[D]. 韩新锋. 四川农业大学, 2008(01)
- [9]柯萨奇病毒B3 VP1蛋白的原核表达及免疫效果观察[D]. 李伟. 河北医科大学, 2008(01)
- [10]四种中药多糖增强免疫和抗病毒作用及机理研究[D]. 邱妍. 南京农业大学, 2007(05)