一、热休克预处理抑制过氧化氢所致心肌细胞Smac的释放及细胞凋亡（论文文献综述）
何川[1]（2021）在《FOXO3a在替莫唑胺诱导的保护性线粒体自噬中的作用和机制研究》文中提出背景:胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发肿瘤,具有较高的侵袭性和复发性[2]。新诊断的恶性胶质瘤的治疗方案主要以手术切除肿瘤为主,结合放疗、化疗等综合治疗方法[3]。替莫唑胺是临床一线化疗药物,然而由于耐药机制的建立,替莫唑胺取得的效果仍然有限[4]。越来越多的证据表明自噬在降低胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性方面起着重要的作用[9]。自噬是一种进化上高度保守的分解代谢过程。细胞通过将非必须的细胞组分或功能障碍的细胞器通过溶酶体降解来提供营养或能量,以维持细胞的稳态[6]。抑制自噬是提高胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞对替莫唑胺敏感性的有效手段[9-12]。但是自噬导致胶质瘤细胞对替莫唑胺抗性的具体机制尚不清楚。通过自噬清除受损线粒体的过程被称为线粒体自噬[13]。细胞通过线粒体自噬的方式清除受损的线粒体,可以抑制细胞内ROS的积累,阻断线粒体中促凋亡蛋白如AIF、细胞色素C的释放[14]。尽管自噬赋予了胶质瘤细胞对替莫唑胺的抗性[9,12],但尚不清楚自噬的保护作用是否与清除受损线粒体相关。Bcl-2/腺病毒E1B 19-k Da相互作用蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-ineracting protein 3,BNIP3）是一种自噬受体,负责介导受损线粒体通过自噬途径清除[13]。然而,替莫唑胺是否能引发线粒体自噬尚不明确。叉头盒转录因子3a（forkhead box transcription factor 3a,FOXO3a）是FOX蛋白家族成员。FOXO3a调控多种细胞功能如增殖、分化、侵袭转移和细胞死亡[15]。自噬的激活和BNIP3的上调均由FOXO3a调控[16-18],但是FOXO3a是否参与了BNIP3介导的线粒体自噬仍不清楚。因此,我们研究了FOXO3a在替莫唑胺引起胶质瘤细胞死亡中的作用,以及它与BNIP3介导的线粒体自噬之间的关系。目的:用人类及大鼠胶质瘤细胞系以及裸鼠移植瘤模型来研究FOXO3a和BNIP3在替莫唑胺诱导胶质瘤细胞死亡中的作用及机制。方法:1.MTT法检测胶质瘤细胞生存率。2.LDH释放法检测胶质瘤细胞死亡率。3.si RNA转染研究相关蛋白在替莫唑胺引起胶质瘤细胞死亡中的作用。4.免疫荧光技术检测相关蛋白在细胞内定位的变化。5.DCFH-DA荧光探针检测胶质瘤细胞内ROS水平变化。6.Mito SOX荧光探针检测胶质瘤细胞内线粒体超氧化物水平的变化。7.JC-1荧光探针检测胶质瘤细胞线粒体膜电位的变化。8.Mito Tracker荧光探针检测胶质瘤细胞线粒体形态和数量的变化。9.蛋白质印迹技术检测胶质瘤细胞和组织内蛋白表达的变化。、10.中性单细胞凝胶电泳检测胶质瘤细胞DNA双链断裂。11.构建Stub RFP-Sens GFP-LC3B慢病毒转染的U87细胞,研究替莫唑胺对胶质瘤细胞自噬的作用。12.C6裸鼠移植瘤模型研究替莫唑胺对体内胶质瘤细胞的作用。结果:1.替莫唑胺以浓度依赖的方式抑制胶质瘤细胞的体外增殖,并能抑制体内胶质瘤的生长。2.替莫唑胺引起胶质瘤细胞的DNA双链断裂,AIF核转位和线粒体膜电位降低。3.替莫唑胺引起胶质瘤细胞内ROS升高,通过GSH抑制ROS的升高能够抑制替莫唑胺引起的DNA双链断裂。替莫唑胺引起胶质瘤细胞线粒体超氧化物积累,通过Mn TBAP抑制线粒体超氧化物的积累可以抑制胶质瘤细胞内ROS升高,并抑制DNA双链断裂。4.替莫唑胺激活胶质瘤细胞自噬。通过3MA、bafilomycin A1或ATG5 si RNA抑制自噬能够增强替莫唑胺引起的AIF核转位、细胞内ROS升高,增强替莫唑胺的杀伤作用。5.替莫唑胺激活BNIP3介导的线粒体自噬。通过si RNA敲低BNIP3的表达能够增强替莫唑胺引起的AIF核转位、ROS升高,增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的杀伤作用。6.通过si RNA敲低FOXO3a的表达,能够抑制BNIP3和LC3B的上调,从而抑制替莫唑胺引起的保护性线粒体自噬,增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的杀伤作用。结论:1.替莫唑胺通过诱发氧化应激损伤线粒体,引起AIF释放和核转位、ROS升高,进而导致DNA双链断裂和胶质瘤细胞死亡。2.BNIP3介导的线粒体自噬通过清除受损的线粒体,抑制AIF的释放和ROS的升高,保护胶质瘤细胞免受替莫唑胺的杀伤。3.抑制FOXO3a调控的线粒体自噬,能够增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的杀伤作用。
刘大伟[2]（2019）在《miR-199a-5p通过HIF-1α/P-GSK3β/mPTP轴影响心肌缺血再灌注损伤的研究》文中进行了进一步梳理在过去的几十年里,心血管疾病的预防、诊断和治疗方面已经有了非常重大的进展。然而,心血管疾病仍然是威胁人民健康的头号杀手。近年来的统计数字表明,全世界新发心血管疾病患者人数逐年增高,虽然随着介入技术的逐步普及,大大提高了心血管疾病患者的生存率,但心血管疾病的死亡率仍占总死亡率的三分之一左右。我国的心血管患病率依然处于持续上升阶段。心肌缺血时冠状动脉循环受损可导致严重的缺氧损伤。通过溶栓治疗或经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention,PCI）快速恢复冠状动脉血流对于限制心肌梗死面积的扩大、保留左心射血功能和防止左心室重构至关重要。通过溶栓治疗或PCI进行血运重建可将心脏病发作患者的死亡率降低近50%。然而,血运重建后含氧量高的血液恢复会加重缺血组织损伤,这种现象被称为缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury,I/RI）。缺血/再灌注损伤的概念是在1960年由Jennings等人首次提出的。研究发现,心脏缺血/再灌注损伤与细胞内钙超载、氧化应激、血管内皮细胞损伤和细胞凋亡等有关。这促使人们寻找新的治疗策略来保护心脏免受I/RI损伤,从而改善心肌梗死患者的预后。Micro RNA（mi RNA）是一类由22个碱基左右组成的、内源性的非编码的单链小分子RNA,通过对m RNA的降解或者翻译抑制在转录后水平负调控靶基因的表达。近年来多项研究发现mi RNA参与了心肌重塑、心肌肥厚、心肌细胞凋亡、心律失常、心力衰竭等心血管系统的病理生理过程,尤其是在心脏缺血/再灌注损伤中的调控作用,越来越受到人们的重视。研究发现,在心脏缺血/再灌注损伤的小鼠体内注入mi R-1,mi R-21和mi R-24可以减少心肌梗死范围。Ren等研究发现,mi R-320在心脏缺血/再灌注损伤中表达明显降低,敲除mi R-320可以使热休克蛋白20（heatshock protein 20,Hsp20）表达增加,从而减少心脏缺血/再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡。本研究分别以急性心肌梗死病人血浆、乳大鼠原代心肌细胞和H9C2心肌细胞为研究对象。分别应用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）、蛋白印迹法（Western Blot）、MTS实验、LDH实验、流式细胞术和免疫共沉淀等实验方法研究心肌缺血再灌注损伤情况下mi R-199a-5p的表达;然后通过体外实验研究过表达或敲低mi R-199a-5p后对心肌细胞糖氧剥夺复氧复糖损伤情况下的细胞活力和LDH释放、细胞凋亡及线粒体膜电位水平的影响,最后通过检测相关通路蛋白的表达情况进一步探讨其影响心肌缺血再灌注损伤的途径,阐明了mi R-199a-5p在心肌缺血再灌注损伤的作用,从而为更深刻的认识心肌缺血再灌注损伤发生发展的分子机制。第一部分心肌缺血再灌注损伤时mi R-199a-5p的表达目的:验证mi R-199a-5p在心肌梗死患者和心肌细胞中的表达。方法:1.RT-PCR法检测19例男性心肌梗死患者和23例男性对照组血浆中mi R-199a-5p的表达水平。2.RT-PCR法检测乳大鼠原代心肌细胞糖氧剥夺复氧复糖损伤时mi R-199a-5p的表达水平。3.RT-PCR法检测H9C2心肌细胞糖氧剥夺复氧复糖损伤时mi R-199a-5p的表达水平。结果:1.RT-PCR结果显示:与对照组相比,mi R-199a-5p在心肌梗死组表达水平显着增高,差异具有统计学意义。2.与对照组相比,糖氧剥夺复氧复糖处理后原代心肌细胞及H9C2细胞中mi R-199a-5p表达升高（P<0.05）。小结:mi R-199a-5p在心肌缺血再灌注损伤情况下中表达显着增高。第二部分mi R-199a-5p对H9C2细胞株糖氧剥夺复氧复糖凋亡的影响目的:研究过表达和敲低mi R-199a-5p对糖氧剥夺复氧复糖损伤状态下H9C2心肌细胞细胞活力和细胞凋亡等功能的影响。方法:1.构建过表达和敲低H9C2细胞糖氧剥夺复氧复糖损伤细胞模型。2.MTS实验和LDH实验检测过表达mi R-199a-5p对糖氧剥夺复氧复糖损伤对H9C2细胞细胞活力的影响。过表达mi R199a-5p可以降低H9C2细胞HIF-1α、P-GSK3β/GSK3β蛋白的表达3.MTS实验和LDH实验检测敲低mi R-199a-5p对糖氧剥夺复氧复糖损伤H9C2细胞的细胞活力的影响。4.TUNEL实验检测敲低mi R-199a-5p对糖氧剥夺复氧复糖损伤H9C2细胞凋亡的影响。5.采用流式细胞术检测敲低mi R-199a-5p对糖氧剥夺复氧复糖损伤H9C2细胞的线粒体通透性转换孔的影响。结果:1.成功构建过表达和敲低mi R-199a-5p的H9C2心肌细胞模型。2.MTS与LDH实验结果显示过表达mi R-199a-5p对糖氧剥夺复氧复糖条件下H9C2细胞细胞培养中细胞活力明显低于糖氧剥夺复氧复糖组。3.MTS与LDH实验结果显示,敲低mi R-199a-5p可以减轻糖氧剥夺复氧复糖对H9C2细胞株细胞活力的影响。4.TUNEL实验结果显示,敲低mi R-199a-5p能够减轻H9C2细胞糖氧剥夺复氧复糖所致的细胞凋亡。5.流式细胞学实验结果显示,敲低mi R-199a-5p能够减轻H9C2细胞糖氧剥夺复氧复糖所致的线粒体膜电位水平的下降。小结:1.过表达mi R-199a-5p能够加重H9C2心肌细胞糖氧剥夺复氧复糖损伤。2.敲低mi R-199a-5p能够减轻H9C2心肌细胞糖氧剥夺复氧复糖损伤。第三部分mi R-199a-5p通过HIF-1α/P-GSK3β/mPTP轴影响心肌细胞缺血再灌注损伤目的:预测并验证mi R-199a-5p的靶基因,进一步研究mi R-199a-5p在心肌缺血再灌注损伤过程中的细胞功能的分子生物学机制。方法:1.通过Targetscan、MIRBase和MIRDB等mi RNA靶基因预测数据库,在线预测mi R-199a-5p可能的靶基因。2.在细胞水平上通过双荧光素酶报告基因验证mi R-199a-5p的靶基因及参与的信号通路。3.通过si RNA转染技术来干预HIF-1α的蛋白表达,进而采用Western Blot等方法来验证mi R-199a-5p与HIF-1α/P-GSK3β/m PTP轴之间的靶点调控关系。4.采用免疫细胞化学染色的方法来定性检测敲低mi R-199a-5p对P-GSK3β与ANT的影响。5.采用免疫共沉淀的方法来定量检测敲低mi R-199a-5p后P-GSK3β与ANT以及CYP-D三者之间的关系。结果:1.预测mi R-199a-5p的靶基因:通过mi RNA靶基因预测数据库预测mi R-199a-5p的靶基因,三个软件交集的mi R-199a-5p靶基因并选择1个靶基因作为mi R-199a-5p的可能靶基因来进一步研究。2.mi R-199a-5p双萤光素酶报告基因分析显示,mi R-199a-5p调控该位点明显影响了荧光素酶活性,因此证实mi R-199a-5p直接结合HIF-1α的3’UTR并抑制其表达。3.Western Blot检测结果显示,mi R-199a-5p能够通过调节HIF-1α/P-GSK3β/m PTP分子通路上相关蛋白的表达进而影响心肌缺血再灌注损伤。4.免疫共沉淀和免疫化学染色结果显示,敲低mi R-199a-5p能够促进P-GSK3β与线粒体通透性转换孔上ANT的结合,抑制线粒体损伤。小结:1.报告基因实验证实HIF-1α为mi R-199a-5p的靶基因。2.证实mi R-199a-5p能够通过HIF-1α/P-GSK3β/mPTP轴影响H9C2细胞糖氧剥夺复氧复糖损伤。结论:1.mi R-199a-5p在心肌组织和细胞模型缺血再灌注损伤情况下中表达显着增高。2.mi R-199a-5p通过HIF-1α/P-GSK3β/mPTP轴导致心肌细胞的缺血再灌注损伤。
胡艳[3]（2011）在《热休克预处理对鼠心肌细胞凋亡和金属硫蛋白表达的影响》文中认为目的：探讨热休克预处理对过氧化氢所致大鼠心肌细胞凋亡和线粒体金属硫蛋白表达的影响。方法：体外培养的H9C2大鼠心肌细胞随机分为3组：①正常对照组（Ctrl组,n=3）,心肌细胞中加入含血清DMEM培养基,置于37℃,5%CO2培养箱中3h；②H202损伤组（H202组,n=3）,心肌细胞中加入含0.5 mmol/L H2O2的无血清DMEM培养基,置于37℃,5%CO2培养箱中3h；③热休克预处理后H202损伤组（HSR组,n=3）,心肌细胞中加入含血清DMEM培养基,用无菌无粉手套包裹心肌细胞培养瓶置于42℃恒温水浴箱中孵育1 h,然后在37℃,5%C02细胞培养箱中恢复6h,将培养瓶中的含血清DMEM培养基吸除并清洗,随后同②组。采用流式细胞术观察各组心肌细胞凋亡情况；并用电子显微镜技术观察各组心肌细胞线粒体结构的改变；用western-blotting技术测定各组心肌细胞线粒体细胞色素C和金属硫蛋白的表达。结果：1、由流式细胞术散点图可见：H202损伤组凋亡和坏死细胞明显比正常组多,热休克预处理组凋亡和坏死细胞少于H202损伤组;荧光图可见：H202损伤组显示凋亡和坏死细胞明显多于正常组,热休克预处理组凋亡和坏死细胞少于H202损伤组。2.电镜结果：正常组可以看到完整的线粒体结构,热休克预处理组线粒体结构有点模糊,但外膜甚至嵴都可见,而H202组线粒体肿胀有空泡,不规则外膜,嵴丢火。3.Western-blotting技术测定各组心肌细胞线粒体细胞色素C的表达：热休克预处理可影响过氧化氢损伤的心肌细胞线粒体细胞色素C的表达。4.Western-blotting技术测定各组心肌细胞线粒体金属硫蛋白表达：热休克预处理组的心肌细胞线粒体金属硫蛋白的表达明显高于H2O2损伤组和正常组。结论：热休克预处理可抑制过氧化氢所致心肌细胞凋亡,金属硫蛋白可能与热休克预处理抑制过氧化氢损伤心肌细胞凋亡有关。
蒋碧梅[4]（2010）在《核仁素在大鼠心肌缺血预适应中的作用及其机制研究》文中认为心肌缺血及缺血-再灌注损伤导致心肌坏死和凋亡,是启动心肌重构和心力衰竭的主要原因。因此,努力减轻其所致心肌损伤成为了心力衰竭防治的关键环节。心肌缺血预适应（ischemic precondi-tioning, IP）是近年来发现的重要的心肌内源性保护现象,可明显减轻心肌缺血-再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）损伤,即减轻缺血-再灌注所致的心律失常,改善心肌舒缩功能,缩小心肌梗死面积。深入探讨缺血预适应（IP）的心肌保护机制具有重要的科学意义,并将为心肌损伤和心力衰竭的防治提供新的思路。核仁素（又称C23）是核仁中含量最多的一种RNA结合蛋白,其已知的主要功能是结合与运输rRNA,调控核糖体的生成,调控细胞生长、增殖等。核仁素含有三个主要的功能结构域：氨基端,中心区和羧基端。核仁素的许多重要功能,如调控核糖体的生成与成熟,调控细胞生长与增殖等,主要依赖于其中心区的RNA结合结构域。核仁素是细胞内一个非常重要的具有多功能的穿梭蛋白。除了上述经典的生物学功能外,近年研究发现,核仁素在丙型肝炎病毒复制、人类免疫缺陷病毒与人副流感病毒感染宿主细胞、基因转录调控等过程中也发挥了重要作用。我们研究室以前的研究也发现活性氧诱导C2C12肌原细胞、血管内皮细胞及RAW264.7细胞凋亡时伴有核仁素表达下调。进一步采用核仁素真核表达载体及反义寡核苷酸,发现核仁素在氧化应激所致细胞损伤中发挥重要保护作用,而且发现热休克反应及热休克蛋白70可抑制氧化应激所致的核仁素表达下调及细胞凋亡的发生。上述结果提示,核仁素可能是一个重要抗损伤因子。然而,核仁素在心肌缺血预适应中是否具有及具有何种作用,目前尚不清楚。本课题在本实验室以往的工作基础上,采用大鼠心肌缺血预适应动物模型、新生大鼠心肌细胞过氧化氢预适应及缺氧预适应细胞模型,探讨核仁素在心肌缺血预适应中的时空表达模式,并探讨核仁素在心肌缺血预适应中的心肌保护作用及其机制。主要方法与结果如下：1.采用在体大鼠结扎冠状动脉前降支5min,再灌注10min,再结扎5min,再灌注10min,构建心肌缺血预适应的动物模型；采用血清酶学检测、Caspase-3活性分析及DNA“梯状”条带检测心肌受损情况；采用Real-time PCR和Western-blot检测心肌中核仁素的表达。结果显示：大鼠心肌缺血预适应导致心肌中核仁素的mRNA表达逐渐升高,12h达高峰；蛋白质水平也表现为逐渐增多,以12h、24h最明显,并明显减轻了缺血30min,再灌注3h所致的心肌损伤,即血清酶学指标下降,心肌Caspase-3活性和DNA“梯状”条带明显减少。2.原代培养新生大鼠心肌细胞经过氧化氢（100μm）预处理90min或经缺氧预处理30 min后,恢复24h,构建模拟在体心肌缺血预适应的细胞模型；采用MTT、LDH活性分析及凋亡百分率检测细胞受损情况；采用Real-time PCR和Western-blot检测核仁素的表达；采用细胞成分分离及间接免疫荧光观察核仁素的定位情况。结果显示,上述过氧化氢预适应及缺氧预适应均能明显减轻心肌细胞的氧化应激损伤（500μM H2O2）和缺氧-复氧损伤（缺氧2h,复氧12-24h）；在上述过氧化氢预适应及缺氧预适应心肌细胞模型中,核仁素的mRNA表达逐渐升高,12h达高峰；蛋白质水平也表现为逐渐增多,以12h-24h最明显；而且,在正常情况下,核仁素大部分位于心肌细胞胞核,过氧化氢预适应及缺氧预适应均可导致核仁素向胞浆移位。3.采用基因转染及RNA干扰技术探讨核仁素在过氧化氢预适应所致心肌细胞保护中的作用。结果显示,核仁素过表达可增强过氧化氢预适应对心肌细胞氧化应激损伤（500μM H2O2）的保护作用,表现为LDH释放减少,细胞存活率增加,细胞凋亡减少；而核仁素低表达则明显抑制了上述过氧化氢预适应的心肌细胞保护作用。4.将新生大鼠心肌细胞暴露于过氧化氢（500μM H2O2,6h）,采用核仁素抗体进行免疫共沉淀,抽提沉淀物中RNA进行大鼠基因表达谱芯片分析以及生物信息学分析,对氧化应激损伤时心肌细胞中核仁素调控的可能靶基因进行了筛选。根据大鼠基因表达谱芯片结果以及生物信息学提供的信息,初步筛选出氧化应激损伤时心肌细胞中包括Hsp32, Hsp70在内的10个可能受核仁素调控的靶基因。5.采用Real-time PCR和Western-blot技术观察到Hsp32, Hsp70在大鼠心肌缺血预适应整体及细胞模型中表达明显增加,为探讨Hsp32及Hsp70在缺血预适应心肌保护中的作用,进一步采用Hsp32特异性抑制剂及Hsp70的RNA干扰片段抑制了Hsp32的活性或抑制Hsp70的表达,发现抑制Hsp32活性或抑制Hsp70表达可明显减弱过氧化氢预适应的心肌保护作用。6.采用Real-time PCR和Western-blot技术探讨了核仁素对Hsp32和Hsp70表达的调控作用。结果显示,核仁素过表达可上调Hsp32和Hsp70的表达；进一步采用mRNA稳定性分析,IP-RT-PCR、RNA-EMSA技术和荧光素酶报告基因技术探讨了核仁素对Hsp32和Hsp70基因的调控机制。结果显示,在心肌缺血预适应中,核仁素与Hsp32, Hsp70的3’UTR相结合,进一步采用荧光素酶报告基因系统检测发现核仁素可通过与Hsp32, Hsp70的3’UTR相结合,增加Hsp32和Hsp70 mRNA的,从而发挥心肌保护作用。综上所述,大鼠心肌缺血预适应及心肌细胞过氧化氢预适应及缺氧预适应可导致心肌中核仁素的mRNA及蛋白质水平表达上调,并促进其从胞核向胞浆的移位；核仁素与靶基因Hsp32, Hsp70 mRNA的3’UTR相结合,通过增加调控Hsp32, Hsp70 mRNA的稳定性,而上调Hsp32,Hsp70的表达,从而在心肌缺血预适应的心肌保护中发挥重要作用。
马燕花[5]（2010）在《当归红芪超滤膜提取物对过氧化氢诱导心肌细胞氧化损伤的保护作用》文中提出一、研究背景心血管疾病在我国的发病率逐年增加,目前已经成为造成我国人民死亡的首要疾病。近年来的大量研究表明,心肌细胞凋亡是多种心血管疾病如心力衰竭、扩张性心肌病（DCM）、阿霉素诱导性心肌病和病毒性心肌炎、心肌梗塞、心肌缺血等的一个重要的发生和进展机制。同时细胞凋亡参与心室重构和心功能不全的发生,是心功能远期预后的重要预报因子。缺氧、缺氧复氧、酸中毒、氧化应激、压力应激等多种刺激均可诱导心肌细胞产生凋亡。其中,氧自由基代谢障碍是心肌细胞凋亡的重要促发因素,生物体内存在的活性氧可以与DNA、蛋白质、多元不饱和脂肪酸等作用,造成DNA链断裂、突变和对热稳定性的改变,严重影响遗传信息的传递,使细胞代谢功能紊乱；导致蛋白质与蛋白质交联、蛋白质与DNA交联,使其理化性质和生物学功能发生改变；作用于生物膜的多不饱和脂肪酸,使其发生脂质过氧化,造成膜的完整性被破坏、膜流动性下降、膜脆性增加,影响细胞内外物质与信息的交换。当活性氧过氧化氢（H2O2）高浓度作用于心肌细胞时,可致细胞内活性氧水平迅速增加,并诱导体内抗氧化剂如：超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱苷肽过氧化物酶等的活性降低,使生物膜的结构和功能的完整性遭到破坏,致使细胞发生凋亡。细胞凋亡又称程序性死亡（PCD）,是多细胞有机体为保持自身组织稳定、调控自身细胞的增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞主动性死亡过程。诱导细胞凋亡的因素很多,体内代谢或外源性因素产生的自由基均被证实可诱导细胞凋亡。在细胞凋亡的发生机制研究中,已知的引起细胞凋亡的信号传导通路有：死亡因子介导的细胞凋亡；神经酰胺介导的细胞凋亡；p53+基因触发的细胞凋亡；线粒体损伤启动的细胞凋亡。通过以上通路,细胞凋亡的结果使体细胞特别是具有重要功能的细胞如脑细胞、心肌细胞数量减少,造成其组成的重要器官如心室肌等发生衰退性病理过程。在心肌细胞凋亡中研究较多的有两条主要的信号转导通路,即线粒体通路和膜死亡受体通路。通过干预心肌细胞凋亡能在一定程度上保护心肌细胞,因此,人们在研究药物对心肌细胞凋亡影响方面产生了浓厚的兴趣。长期以来,中药在心血管疾病的治疗中占据了一定的地位。目前,中药与心肌细胞凋亡相关性的研究正受到普遍关注,并取得了一些可喜的成果,其研究正在不断深入,尤其在探索中药有效单体成分对心肌细胞凋亡的影响方面。本实验室运用超滤膜技术对传统方剂当归补血汤进行分离纯化,前期研究已证实,当归红芪超滤膜提取物具有清除氧自由基,抗脂质过氧化,抗心肌细胞凋亡的作用。在本课题中,通过模拟体内心肌细胞氧化损伤过程,建立H2O2诱导体外培养心肌细胞凋亡模型,观察当归红芪超滤膜提取物对氧化损伤诱导的体外培养心肌细胞凋亡的影响,从而为明确当归红芪超滤膜提取物抗凋亡的作用机制及其临床应用价值奠定基础。二、目的1、运用超滤膜技术对中药合剂进行分离、纯化。2、研究当归红芪超滤膜提取物抗心肌细胞氧化损伤的作用。3、研究当归红芪超滤膜提取物抗心肌细胞凋亡的作用。4、研究当归红芪超滤膜提取物对氧应激状态下心肌细胞热休克蛋白70表达的影响。5、为当归红芪超滤膜提取物的临床应用提供实验依据。三、方法1、应用陶瓷膜微滤和聚丙烯腈（PAN）中空纤维超滤膜（截留分子量为10万分子量）精制当归、红芪合剂（1：5）水提物。2、Wistar乳鼠心肌细胞原代培养：取出生后1～3d的大鼠乳鼠,用75%乙醇溶液浸泡消毒皮肤后,移入超净工作台。开胸取出心室肌,运用酶消化法反复多次消化,收集细胞悬液,以差速贴壁法分离纯化心肌细胞,用含15%小牛血清的DF培养液调整细胞浓度至每毫升5×105,在37℃、5% CO2条件下培养。选生长状态佳者于72 h后进行实验。采用台盼蓝染色法检测心肌细胞存活率。采用心肌细胞α横纹肌肌动蛋白（a-Sarcomericactin）的免疫细胞化学染色方法鉴定心肌细胞纯度。3、制备乳鼠心肌细胞氧化应激性损伤模型：以400μmol·L-1的H2O2诱导心肌细胞凋亡。实验分为以下5组：正常对照组；H202模型组（作用6h）；当归红芪超滤膜提取物高剂量干预组（15 g·L-1）、当归红芪超滤膜提取物中剂量（7.5 g·L-1）干预组、当归红芪超滤膜提取物低剂量（3.75·g-1）干预组。倒置相差显微镜观察心肌细胞形态学改变;MTT法检测心肌细胞细胞活力改变；Annexin V-FITC/PI双染法标记凋亡心肌细胞,采用流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡指数。4、应用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术和蛋白印（Western-blotting）技术测定凋亡相关基因蛋白Hsp70、Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达。5、用生化学技术检测氧化应激状态下心肌细胞相关酶类如SOD、LDH、CK、MDA、MPO的变化。四、结果1、经紫外分光光度计测定,10万分子量当归红芪超滤膜提取物（不含阿魏酸）多糖含量接近单剂含量,当归多糖含量为23.84 g·L-1,红芪多糖含量为27.55 g·L-1,合剂多糖含量为22.08g·L-1。2、倒置相差光学显微镜下观察：正常心肌细胞伸出伪足互相融合成片,细胞核折光性好,搏动具有整体性、协调性和规律性（98.2±13.4次／min）。H2O2损伤组细胞皱缩,细胞核暗淡,搏动明显减弱（20.1±3.3次／min）,部分停搏,搏动幅度强弱不一,搏动频率与正常对照组相比较差异具有显着性（P＜0.01）。当归红芪超滤物高、中、低剂量干预组心肌细胞搏动频率分别为86.9±8.4、71.1±6.7和43.7±9.6次／min,细胞伪足较对照组变细,搏动频率略减低,但高于氧化损伤组（P＜0.01）。3、MTT法检测心肌细胞的存活率：氧化损伤模型组心肌细胞严重受损,细胞存活率显着降低（29.5%）,与正常对照组（89.7%）比较具有统计学意义（P＜0.01）。当归红芪超滤物干预组心肌细胞的受损显着改善,存活率显着提高,高、中、低剂量组分别为77.6%、64.4%、43.9%,与氧化损伤组比较差异显着（P＜0.01）。4、生化学检测：H2O2处理使细胞膜的通透性增加,培养介质中LDH（274.36±15.16U/L）、CK（201.47±2.71 U/L）的含量增加,与正常对照组比较（LDH 138.07±11.27U/L,CK42.69±1.53 U/L）,具有显着性差异（P＜0.01）。当归红芪超滤物可显着抑制H2O2所致心肌细胞膜通透性的改变,高剂量组（LDH 167.22±10.11U/L, CK 88.14±1.06U/L）、中剂量组（LDH183.48±9.88U/L, CK 99.66±4.18 U/L）、低剂量组（LDH201.06±18.13U/L, CK 132.54±1.92 U/L）均能减少LDH、CK的外漏,与模型组比较差异显着（P<0.01）。H2O2损伤组细胞内MDA （3.82±0.64nmol/mL）、MPO （114.00±3.24 U/L）含量增加、SOD （58.23±2.45U/mL）活力降低,与正常对照组（MDA2.34±0.50 nmol/mL, MPO 38.47±1.12 U/L, SOD 118.33±5.77 U/mL）比较,差异显着（P＜0.01）。当归红芪超滤物可显着降低心肌细胞内MDA、MPO的含量,提高SOD活力,高剂量组（MDA2.51±0.28 nmol/mL, MPO 59.76±1.84 U/L, SOD 101.34±2.14U/mL）、中剂量组（MDA 2.80±0.32 nmol/mL, MPO 71.52±1.03 U/L, SOD 83.36±6.63U/mL）、低剂量组（MDA 3.11±0.35 nmol/mL, MPO 85.22±4.18 U/L, SOD71.45±7.11U/mL）与模型组比较均具有显着性差异（P＜0.01）；且呈剂量依赖关系,随超滤物浓度的增加LDH、CK、MDA、MPO含量逐渐减少,SOD活力逐渐增加。5、RT-PCR检测结果：正常对照组Hsp70、Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA呈低水平表达,模型组Hsp70、Caspase-3、Bax mRNA表达量显着增加,Bcl-2 mRNA表达量显着降低,与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较,各超滤物干预组Hsp70 mRNA呈过度表达,Bcl-2 mRNA表达量显着增加,而Bax、Caspase-3 mRNA表达量显着降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。6、Western-blotting检测结果：400μmol·L-1 H2O2处理心肌细胞6h后,模型组心肌细胞中Hsp70、Bax蛋白的表达明显增加,Bcl-2蛋白的表达明显降低,与正常对照组比较差异具有显着性（P<0.01）, Bcl-2/Bax的蛋白比值降低（P＜0.01）。而经当归红芪超滤膜提取物处理后,心肌细胞中Hsp70蛋白表达量均较模型组显着增加（P＜0.05）；在高剂量组和中剂量组细胞中Bcl-2蛋白表达显着增加（P<0.05）, Bax蛋白表达显着降低（P＜0.01）,Bcl-2/Bax比值显着升高（P＜0.01）,差异具有统计学意义。低剂量组则Bcl-2、Bax蛋白表达无显着改变（P＞0.05）。五、结论1、氧化损伤是诱导心肌细胞凋亡的重要原因之一。2、当归红芪超滤膜提取物具有抗过氧化氢诱导心肌细胞损伤的作用,可减轻细胞活力的下降,抑制心肌细胞凋亡。3、Bax、Caspase-3的激活是过氧化氢诱导心肌细胞凋亡的重要机制,Bcl-2、Hsp70表达的增多具有抗心肌细胞凋亡作用。4、当归红芪超滤膜提取物可能通过抑制心肌细胞凋亡、防止心肌细胞氧化损伤而在治疗心血管病方面发挥作用。
邓红兵[6]（2009）在《Bcl-2在HSP70抗氧化应激所致C2C12细胞凋亡中的作用研究》文中指出近年研究表明,细胞凋亡是导致心肌损伤的重要细胞机制之一,在心肌缺血/再灌注损伤、心肌梗死、心肌重塑及心力衰竭等心脏疾病或病理过程的发生发展中发挥了重要作用。热休克蛋白（heat shockprotein,HSP）是细胞在生理状态下必需而在应激状态（特别是热应激）时表达增多的一类细胞内源性保护蛋白。本室以往研究证实HSP70能通过减少促凋亡蛋白Smac的释放而显着抑制H2O2诱导的C2C12肌源细胞凋亡。然而,HSP70影响Smac释放和抗细胞凋亡的分子机制仍不清楚。Bcl-2是最早发现的抗凋亡蛋白,具有稳定线粒体膜的功能,国外研究表明Bcl-2能抑制凋亡刺激所致Smac从线粒体的释放。但HSP70影响Smac释放和抗细胞凋亡的作用是否与Bcl-2有关,目前还不清楚。本实验首先采用HSP70基因转染及其反义寡核苷酸技术,探讨HSP70对Bcl-2表达的影响;再采用HSP70过表达的C2C12肌源细胞株,运用H2O2处理构建细胞凋亡模型,在Bcl-2表达上调与抑制的情况下,探讨Bcl-2在HSP70抗细胞凋亡中的作用,并且通过检测Smac从线粒体释放情况及caspase-3,9活化情况,进一步揭示HSP70抗细胞凋亡的分子机理。主要结果如下:①稳定转染HSP70的C2C12细胞株,与转空载体组相比,HSP70的表达较高,Bcl-2的表达也明显升高（p＜0.01 vs pcDNA3.1）;而转染HSP70反义寡核苷酸后,与转随机寡核苷酸组相比,C2C12细胞内HSP70的表达降低,Bcl-2的表达也明显降低（p＜0.01 vs Scr-Hsp70）。②稳定转染HSP70的C2C12细胞株,分别转染Bcl-2反义寡核苷酸及随机寡核苷酸后,0.5mmol/LH2O2处理2小时,细胞成分分离后Western-blot结果显示:在随机寡核苷酸组,Smac主要存在线粒体中,其胞浆含量较低;而在反义寡核苷酸组,较多Smac从线粒体释放,其胞浆含量显着升高。③稳定转染HSP70的C2C12细胞株,分别转染Bcl-2反义寡核苷酸及随机寡核苷酸后,0.5mmol/LH2O2处理8小时,凋亡蛋白酶活性检测显示,在随机寡核苷酸组细胞内caspase-9、3活性较低,而在反义寡核苷酸组细胞内caspase-9、3活性较高。④稳定转染HSP70的C2C12细胞株,分别转染Bcl-2反义寡核苷酸及随机寡核苷酸后,0.5mmol/LH2O2处理24小时,流式细胞术检测显示,在随机寡核苷酸组细胞凋亡率较低,而在反义寡核苷酸组细胞凋亡率较高。结论:①HSP70能上调Bcl-2的表达。②HSP70抑制Smac从线粒体释放及抗细胞凋亡功能与其上调Bcl-2表达相关。
李义杰[7]（2009）在《热休克蛋白70过表达对淋巴细胞辐射损伤的保护效应》文中认为目的:本研究课题选取HSPs家族中最为重要的HSP70为代表,研究了42℃,90min热休克预处理后淋巴细胞中HSP70的表达规律;观察了42℃,90min热休克预处理对淋巴细胞存活,凋亡和hprt基因突变的影响;重点研究了诱导表达的HSP70对X射线照射引起的淋巴细胞凋亡和hpn基因突变的影响,旨在探讨HSP70保护细胞,减轻辐射损伤的机理,为研究抗辐射损伤药物和寻找提高肿瘤放射治疗效果的药物提供基础性研究资料。方法:（1）采用Ficoll法分离大鼠外周血中的淋巴细胞,梳刮法制备大鼠脾脏淋巴细胞悬液;采用台盼蓝染色法,Annexin V/PI双标法的流式细胞术和多核细胞法分别检测42℃,90min热休克预处理对大鼠外周血和脾脏淋巴细胞的存活率,凋亡和hprt基因的影响,确定诱导HSP70表达的热休克条件;同时采用流式细胞术检测42℃,90min热休克预处理后淋巴细胞中HSP70的表达规律,为研究HSP70的辐射防护作用做准备。（2）对大鼠外周血和脾脏淋巴细胞进行42℃,90min热休克预处理,于正常培养条件下分别恢复3h,6h和10h后,分别给予0Gy,0.5Gy,1.0Gy,1.5Gy,2.0 Gy,2.5 6y,3.0 Gy的X线照射,应用Annexin V/PI双荧光标记的流式细胞术检测淋巴细胞凋亡率的变化,研究HSP70是否可以减少辐射引起的细胞凋亡。（3）对大鼠外周血和脾脏淋巴细胞进行42℃,90min热休克预处理,于正常培养条件下分别恢复3h,6h和10h后,分别给予0Gy,0.5Gy,1.0Gy,1.5Gy,2.0 Gy,2.5Gy,3.0 Gy的X线照射,采用多核细胞法检测淋巴细胞hprt基因突变情况,研究HSP70是否可以减轻辐射引起的细胞hprt基因突变率。结果:（1）42℃,90min的热休克预处理对淋巴细胞的的存活率,凋亡率,和hprt基因突变率没有影响,对淋巴细胞是一种无害刺激。（2）淋巴细胞在42℃,90min的热休克预处理后表达立即增高,2～4h表达最为明显（P＜0.01）,随后至少可持续表达24h。（3）X射线照射剂量在0.5～3.0Gy时,外周血和脾脏淋巴细胞热休克预处理后恢复培养6h或10h,热休克+照射组与照射组比较淋巴细胞凋亡率差异明显（P＜0.01）,恢复培养3h时淋巴细胞凋亡率无差异（P＞0.01）;热休克预处理后恢复培养3h,6h或10h的热休克+照射组与照射组比较淋巴细胞的坏死率无差异（P＞0.01）。（4）X射线照射剂量在0～3.0Gy时,外周血和脾脏淋巴细胞热休克预处理后恢复3h,6h或10h,X射线引起的细胞hprt基因突变在热休克+照射组与照射组之间比较无明显差异（P＜0.01）。HSP70对外周血和脾脏淋巴细胞的hprt基因的保护效率,在0.5Gy时为70%左右,在3.0Gy时为30%左右;HSP70对hprt基因的保护效率小剂量照射时效果显着。结论:（1）42℃,90min的热休克预处理对大鼠外周血和脾脏淋巴细胞的存活,凋亡和hprt基因突变无显着影响,即42℃,90min的热休克预处理是诱导淋巴细胞高表达HSP70的理想条件。（2）大鼠外周血和脾脏淋巴细胞在42℃,90min条件下热休克预处理后细胞中HSP70表达立即增高,2～4h表达最为明显,随后表达逐渐下降,24h时表达仍高于正常水平。（3）照射剂量在0.5～3.0Gy时,大鼠外周血和脾脏淋巴细胞接受42℃,90min的热休克预处理,恢复培养6h或10h时诱导的HSP70可以明显减少辐射引起的细胞凋亡,对细胞起到保护效应;而恢复培养3h时诱导的HSP70则没有明显的保护效应:同时HSP70对辐射引起的淋巴细胞坏死没有保护效应。（4）照射剂量在0～3.0Gy时,大鼠外周血和脾脏淋巴细胞接受42℃,90min热休预处理后恢复3h,6h或10h诱导的HSP70,均可以对X射线致淋巴细胞hprt基因突变产生明显保护效应,并且在小剂量照射时,HSP70保护hprt基因的效果更明显。
秦永春[8]（2008）在《热休克蛋白70过表达对V79细胞电离辐射损伤的保护作用》文中进行了进一步梳理目的:本课题通过检测42℃,1h的热休克处理后V79细胞中热休克蛋白70（诱导型）的表达情况;观察热休克预处理对γ射线照射后V79细胞存活率的影响;以及热休克预处理对γ射线照射引起的V79细胞周期阻滞的影响,研究热休克蛋白70过表达对V79细胞电离辐射损伤的保护作用,并从细胞周期的角度探讨其保护作用的机制。方法:包括三个部分:（1）对V79细胞进行42℃,1h的热休克处理,37℃中恢复不同时间后,采用western blot法检测热休克处理后恢复不同时间的细胞中热休克蛋白70的表达情况。（2）对V79细胞进行42℃,1h的热休克预处理,37℃中恢复一定时间后给予不同剂量的60Coγ射线照射,克隆形成法比较热休克处理组和未做热休克处理的对照组细胞照射后存活率的不同。（3）对V79细胞进行42℃,1h的热休克预处理,37℃中恢复一定时间后给予一定剂量的60Coγ射线照射,采用流式细胞术观察热休克预处理对γ射线照射引起的V79细胞周期阻滞的影响。结果:1、Western blot显示V79细胞经42℃,1h的热休克处理,37℃中恢复1h后,热休克蛋白70（诱导型）即有明显增加,4—10h达到高峰,可持续至24h,未做热休克处理的对照组未检测到热休克蛋白70（诱导型）的表达。2、1)照射剂量为0Gy,6Gy,8Gy时,热休克预处理组和未做热休克预处理的对照组细胞存活率无显着差别;2)照射剂量为2Gy,4Gy时,热休克处理后恢复10h组细胞的存活率明显高于未做热休克处理的对照组,而恢复4h组与未做热休克处理的对照组相比细胞存活率无显着差别。3、经4Gyγ射线照射的V79细胞相比未经照射的对照组G2/M期细胞比例明显增加,而热休克处理组相比未作热休克处理的对照组γ射线照射后G2/M期细胞比例无显着差别。结论:1、42℃,1h的热休克处理可以有效诱导V79细胞热休克蛋白70过表达。热休克处理后恢复1h时,热休克蛋白70即有明显增加,4—10h达到高峰,可持续至24h。2、1)42℃,1h的热休克处理不会对V79细胞造成损伤;2)热休克处理后恢复10h,照射剂量小于6Gy时,热休克预处理可以提高V79细胞电离辐射后的存活率;热休克预处理后恢复4h不能提高V79细胞电离辐射后的存活率。提示:热休克蛋白70过表达可以对V79细胞电离辐射损伤起到一定的保护作用。3、电离辐射引起V79细胞G2期阻滞,42℃,1h的热休克预处理对电离辐射引起的G2期阻滞无影响,提示热休克预处理引起的热休克蛋白70过表达对电离辐射引起的周期阻滞无影响。
陆明康[9]（2007）在《热休克（预）处理对过氧化氢诱导细胞损伤的保护作用》文中提出[目的]本研究旨在细胞水平，用过氧化氢模拟电离辐射来探讨热休克蛋白作为辐射防护剂的可行性，包括热休克蛋白是否能提高细胞活力，是否能减少细胞基因突变率两个方面。由于热休克（预）处理是诱导热休克蛋白过表达最简单有效的物理方法，因此本实验重点研究V79细胞（成体）和NIH3T3细胞（胚胎）的最佳热休克（预）处理条件，研究热克预处理对过氧化氢诱导产生细胞活力损伤的影响以及热休克（预）处理对过氧化氢诱导细胞发生基因突变的影响，为本课题今后进一步的研究工作打下基础。[方法]主要包括三个方面：1．用正交试验法分析了V79细胞、NIH3T3细胞最佳的热休克（预）处理条件（细胞存活率采用MTT法检测）。2．分别采用克隆法（细胞克隆形成率）和台盼蓝染色法（细胞染色率）分析细胞的活力（增殖能力和存活能力），从而分析热休克（预）处理对过氧化氢诱导细胞产生活力损伤的影响。3．用6-巯基鸟嘌呤（6-TG）筛选HPRT基因突变细胞并形成细胞克隆，应用Giemsa染色法计数细胞克隆数，从而分析热休克（预）处理对过氧化氢诱导细胞发生基因突变的影响。[结果]1．对于V79细胞来说，热休克（预）处理温度42℃，时间1h，热休克后恢复4-8小时的条件为最佳。对于NIH3T3细胞来说，热休克（预）处理温度在41℃，热休克处理时间0.5h-2h，热休克后恢复时间2-8小时均可。2．对于V79细胞来说，最佳的热休克（预）处理条件下最大可以提高存活率达20％，对于NIH3T3细胞来说，最佳的热休克（预）处理条件下最大可以提高存活率达40％。3．低细胞密度下，热休克（预）处理对低浓度过氧化氢（0.06mmol／L-0.2mmol／L）诱导产生的细胞克隆能力损伤（不发生细胞凋亡）没有明显的保护作用（p＞0.05），对中高浓度过氧化氢（0.5mmol／L-4mmol／L）诱导产生的细胞存活能力的损伤（发生细胞凋亡）亦没有明显的保护作用（p＞0.05）。4．高细胞密度下，42℃以上，1.0h的热处理会诱导V79细胞活力产生明显的损伤（P＜0.05）。而42℃及以下，1.0h热处理不会诱导V79细胞活力产生明显的损伤（P＞0.05），且42℃，1.0h热处理对中高浓度过氧化氢（0.5 mmol／L-4mmol／L）诱导产生的细胞克隆能力损伤和细胞存活能力的损伤都具有明显的保护作用（P＜0.01）。5．42℃以上，1.0h的热处理会诱导V79细胞产生明显的HPRT基因突变（p＜0.01），细胞存活率明显降低。42℃及以下，1.0h的热处理不会诱导产生明显的HPRT基因突变（p＞0.05）。且42℃，1.0h热休克（预）处理可以明显降低过氧化氢诱导V79产生的HPRT基因突变率，起到明显的基因保护作用（P＜0.05）。并且在过氧化氢浓度为＜2mmol／L范围内（中浓度范围内），保护效应比过氧化氢浓度＞2mmol／L（高浓度范围内）更明显。[结论]1．42℃及以下的热处理不会诱导高密度V79细胞产生明显的细胞活力损伤。热休克（预）处理对中高浓度过氧化氢诱导高密度V79细胞产生的细胞活力损伤均具有保护作用，并且42℃，1h的热休克（预）处理条件能较好地起到保护作用。2．42℃及以下的热处理不会诱导V79细胞产生明显的基因突变。热休克（预）处理能保证较高细胞存活率的同时，减少细胞的基因突变率，并且42℃，1h的热休克（预）处理条件能较好地起到保护作用。综上所述，热休克（预）处理对过氧化氢诱导的细胞损伤具有保护效应，具有作为辐射防护剂的基本特性之一。
杨萍[10]（2007）在《心脉通含药血清抗H2O2诱导的心肌细胞凋亡作用及机制探讨》文中认为目的：心肌缺血再灌注损伤是心肌缺血性疾病治疗的难点。氧自由基的大量产生并造成的心肌细胞的结构破坏和功能代谢障碍是心肌缺血再灌注损伤的主要机制之一。目前中药抗缺血再灌注损伤的作用越来越受到重视。本研究从细胞水平观察心脉通对乳鼠心肌细胞在过氧化氢损伤诱导心肌细胞凋亡中的保护效应，并探讨其可能的作用机制。方法：以过氧化氢制备乳鼠心肌细胞氧化应激性损伤模型，以用400μmol／L浓度的H2O2诱导心肌细胞凋亡。实验分为以下几组：正常对照组；H2O2作用1h模型组；H2O2作用6h模型组；H2O2作用1h心脉通含药血清组；H2O2作用6h含药血清组。倒置相差显微镜观察心肌细胞形态学改变，MTT比色法检测心肌细胞细胞活力改变，TUNEL法检测心肌细胞凋亡。免疫细胞化学方法检测NF-κB、Caspase-3及HSP70在心肌细胞内表达程度及分布情况。结果：H2O2作用1h对心肌无损伤作用，细胞形态学无病理学改变，细胞活力、细胞凋亡指数与正常组比较无显着性差异，NF-κB核转位率、心肌细胞内caspase-3表达与正常组比较无显着性差异，HSP70表达轻度增加。H2O2作用6h可诱导心肌细胞凋亡，细胞活力显着下降。心脉通含药血清可减轻H2O2导致的细胞活力下降，显着抑制心肌细胞凋亡，明显增加HSP70在细胞内的表达，减少NF-κB核转位，减少心肌细胞内caspase-3表达。结论：（1）过氧化氢对乳鼠心肌细胞损伤具有时间依赖性。（2）心脉通含药血清具有抗过氧化氢诱导的心肌细胞损伤作用，可减轻细胞活力的下降，抑制心肌细胞凋亡。（3）NF-κB、Caspase-3的激活是过氧化氢诱导心肌细胞凋亡的重要机制，HSP70表达的增多具有抗心肌细胞凋亡作用。（4）心脉通含药血清可能通过抑制NF-κB、Caspase-3活化，促进HSP70表达而发挥其抗过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡作用。
二、热休克预处理抑制过氧化氢所致心肌细胞Smac的释放及细胞凋亡（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、热休克预处理抑制过氧化氢所致心肌细胞Smac的释放及细胞凋亡（论文提纲范文）
（1）FOXO3a在替莫唑胺诱导的保护性线粒体自噬中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 胶质瘤的治疗概述 |
| 2.2 程序性细胞死亡 |
| 2.2.1 凋亡 |
| 2.2.2 自噬依赖性细胞死亡 |
| 2.2.3 程序性坏死 |
| 2.2.4 铁死亡 |
| 2.3 自噬 |
| 2.3.1 自噬的分类 |
| 2.3.2 自噬的机制 |
| 2.3.3 自噬的调控 |
| 2.3.4 自噬在胶质瘤及其治疗中的作用 |
| 2.3.5 替莫唑胺与自噬 |
| 2.4 线粒体的质量控制 |
| 2.4.1 线粒体的结构和功能 |
| 2.4.2 线粒体动力学 |
| 2.4.3 线粒体自噬 |
| 2.4.4 BNIP3与线粒体自噬 |
| 2.5 ROS与细胞抗氧化机制 |
| 2.5.1 ROS的产生和作用 |
| 2.5.2 ROS的调控 |
| 2.5.3 ROS与肿瘤 |
| 2.6 内质网应激和未折叠蛋白质反应 |
| 2.7 替莫唑胺的作用及耐药机制 |
| 2.7.1 替莫唑胺的作用机制 |
| 2.7.2 染色质溶解 |
| 2.7.3 MGMT |
| 2.8 替莫唑胺的其他相关耐药机制 |
| 2.8.1 ABC转运蛋白 |
| 2.8.2 NF-κB信号通路 |
| 2.8.3 JAK-STAT信号通路 |
| 2.9 总结 |
| 第3章 资料与方法 |
| 3.1 主要器材与试剂 |
| 3.1.1 主要实验器材 |
| 3.1.2 主要实验试剂 |
| 3.2 细胞系及细胞培养、裸鼠饲养 |
| 3.3 实验液体及配制方法 |
| 3.4 细胞复苏、传代及冻存 |
| 3.5 实验技术 |
| 3.5.1 MTT法检测细胞生存率 |
| 3.5.2 RNA干扰技术 |
| 3.5.3 乳酸脱氢酶释放法(LDH法)检测细胞的死亡率 |
| 3.5.4 中性单细胞凝胶电泳电泳检测DNA双链断裂 |
| 3.5.5 JC-1 探针检测细胞内线粒体膜电位的变化 |
| 3.5.6 Mito SOX检测线粒体内超氧化物的变化 |
| 3.5.7 DCFH-DA探针检测细胞内ROS的变化 |
| 3.5.8 构建荧光蛋白标记的LC3B的U87细胞系 |
| 3.5.9 线粒体荧光探针检测细胞内线粒体的形态和数量变化 |
| 3.5.10 裸鼠皮下移植胶质瘤模型 |
| 3.5.11 蛋白质印迹技术检测细胞胞浆、胞核、线粒体蛋白的变化 |
| 3.5.11.1 蛋白样品准备 |
| 3.5.11.2 蛋白质印迹 |
| 3.5.11.3 实验分组 |
| 3.5.12 免疫共沉淀法检测胶质瘤细胞及肿瘤组织中LC3BⅡ、BNIP与相关蛋白的相互作用 |
| 3.5.13 激光共聚焦扫描显微镜观察细胞内目标蛋白的表达和定位变化 |
| 3.5.14 裸鼠肿瘤组织内过氧化氢含量的测定 |
| 3.5.15 透射电镜观察线粒体自噬 |
| 3.5.16 统计学分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 替莫唑胺在体外抑制胶质瘤细胞增殖 |
| 4.2 替莫唑胺引起胶质瘤细胞DNA双链断裂和线粒体损伤 |
| 4.2.1 替莫唑胺引起胶质瘤细胞DNA双链断裂 |
| 4.2.2 替莫唑胺引起胶质瘤细胞AIF核转位 |
| 4.2.3 替莫唑胺引起胶质瘤细胞线粒体损伤 |
| 4.3 损伤的线粒体通过上调ROS增强替莫唑胺引起的DNA双链断裂 |
| 4.3.1 替莫唑胺通过升高胶质瘤细胞内ROS引发DNA双链断裂 |
| 4.3.2 替莫唑胺通过损伤线粒体引起细胞内ROS升高 |
| 4.4 自噬抑制替莫唑胺引起的氧化应激 |
| 4.4.1 替莫唑胺引起胶质瘤细胞自噬 |
| 4.4.2 自噬抑制替莫唑胺引起的胶质瘤细胞死亡 |
| 4.4.3 自噬抑制替莫唑胺引起的AIF核转位和ROS升高 |
| 4.5 替莫唑胺激活胶质瘤细胞线粒体自噬 |
| 4.6 BNIP3 介导替莫唑胺引起的线粒体自噬 |
| 4.6.1 替莫唑胺上调BNIP3的表达,并促进BNIP3向线粒体转位 |
| 4.6.2 BNIP3介导替莫唑胺引起的线粒体自噬 |
| 4.6.3 BNIP3介导保护性线粒体自噬 |
| 4.7 FOXO3a调控替莫唑胺引起的线粒体自噬 |
| 4.7.1 替莫唑胺引起FOXO3a表达升高和核转位 |
| 4.7.2 FOXO3a调控BNIP3介导的线粒体自噬 |
| 4.8 动物实验 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）miR-199a-5p通过HIF-1α/P-GSK3β/mPTP轴影响心肌缺血再灌注损伤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 心肌缺血再灌注损伤时mi R-199a-5p的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分mi R-199a-5p对H9C2 细胞株糖氧剥夺复氧复糖损伤凋亡的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分mi R-199a-5p通过HIF-1α/P-GSK3β/m PTP轴影响H9C2 细胞糖氧剥夺复氧复糖损伤 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 缺血再灌注损伤的细胞生物学 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）热休克预处理对鼠心肌细胞凋亡和金属硫蛋白表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文对照表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 观察采用流式细胞术检测到的各组心肌细胞凋亡情况 |
| 3.2 通过电子显微镜观察比较各组心肌细胞线粒体结构 |
| 3.3 Western-blotting技术测定各组心肌细胞线粒体细胞色素C的表达 |
| 3.4 Western-blotting技术测定各组心肌细胞线粒体金属硫蛋白的表达 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）核仁素在大鼠心肌缺血预适应中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写注释 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一章 缺血预适应对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用及对心肌中核仁素表达的影响 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 大鼠心肌缺血预适应对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用 |
| 1.2.2 大鼠心肌缺血预适应模型中核仁素的表达情况 |
| 1.3 分析与讨论 |
| 1.3.1 大鼠心肌缺血预适应模型及保护效果 |
| 1.3.2 大鼠心肌缺血预适应对核仁素的表达的影响 |
| 1.4 结论 |
| 第二章 过氧化氢预适应及缺氧预适应对心肌细胞损伤的保护作用及核仁素表达的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 H_2O_2预适应对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及对核仁素的表达与定位的影响 |
| 2.2.2 缺氧预适应对心肌细胞缺氧-复氧损伤的保护作用及对核仁素的表达与定位的影响 |
| 2.3 分析与讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 核仁素在过氧化氢及缺氧预适应所致心肌细胞保护中的作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 核仁素过表达对H_2O_2预适应所致心肌细胞保护作用的影响 |
| 3.2.2 核仁素(Nuc)低表达对H_2O_2预适应所致心肌细胞保护作用的影响 |
| 3.3 分析与讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 核仁素在缺血预适应心肌保护中的作用机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 与核仁素结合的靶mRNA分子的筛选 |
| 4.2.2 核仁素对Hsp32表达的调控作用及其机制研究 |
| 4.2.3 核仁素对Hsp70表达的调控作用及其机制研究 |
| 4.3 分析与讨论 |
| 4.4 结论 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要成果 |
（5）当归红芪超滤膜提取物对过氧化氢诱导心肌细胞氧化损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验一 心肌细胞的原代培养和心肌细胞凋亡模型的建立 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.结论 |
| 4.讨论 |
| 5.附图 |
| 实验二 应用超滤膜技术制备当归红芪超滤膜提取物 |
| 1.材料与方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.结论 |
| 4.讨论 |
| 实验三 当归红芪超滤膜提取物抗心肌细胞氧化损伤的研究 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.结论 |
| 4.讨论 |
| 5.附图 |
| 实验四 当归红芪超滤膜提取物抗心肌细胞凋亡的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.结论 |
| 4.讨论 |
| 5.附图 |
| 实验五 热休克蛋白70和半胱-天冬氨酸酶-3在凋亡心肌细胞中的表达及当归红芪超滤膜提取物对其表达的影响 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.结论 |
| 4.讨论 |
| 5.附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述(一) |
| 文献综述(二) |
| 英语缩略词语 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的主要研究成果 |
| 附录一 实验动物质量合格证 |
| 附录二 动物实验设施使用证 |
（6）Bcl-2在HSP70抗氧化应激所致C2C12细胞凋亡中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 英文缩写注释 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 药品与试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 细胞株培养及处理 |
| 2.2 H_2O_2浓度测定 |
| 2.3 免疫印迹分析 |
| 2.4 所用反义寡核苷酸 |
| 2.5 脂质体介导基因转染 |
| 2.6 流式细胞术 |
| 2.7 Caspase活性检测 |
| 2.8 细胞线粒体及胞浆的分离 |
| 2.9 统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 1.HSP70对C2C12细胞中Bcl-2表达的影响 |
| 1.1 HSP70过表达对Bcl-2表达的影响 |
| 1.2 HSP70反义寡核苷酸对Bcl-2表达的影响 |
| 2.Bcl-2反义寡核苷酸对HSP70抑制H_2O_2所致细胞凋亡的影响 |
| 2.1 Bcl-2反义寡核苷酸对C2C12细胞中Bcl-2表达的影响 |
| 2.2 Bcl-2反义寡核苷酸对HSP70诱导Bcl-2表达的影响 |
| 2.3 Bcl-2反义寡核苷酸对HSP70抑制H_2O_2所致Smac释放的影响 |
| 2.4 Bcl-2反义寡核苷酸对HSP70抑制H_2O_2所致caspase-9活性的影响 |
| 2.5 Bcl-2反义寡核苷酸对HSP70抑制H_2O_2所致caspase-3活性的影响 |
| 2.6 Bcl-2反义寡核苷酸对HSP70抑制H_2O_2所致细胞凋亡的影响 |
| 第四章 分析与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
| 致谢 |
（7）热休克蛋白70过表达对淋巴细胞辐射损伤的保护效应（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 一、研究背景及意义 |
| 二、国内外的研究进展 |
| 三、本研究的内容 |
| 第一部分 热休克预处理后淋巴细胞中HSP70的表达情况 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 HSP70过表达对X线照射后淋巴细胞凋亡的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 HSP70过表达对X线照射后淋巴细胞hprt基因突变的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 中英文缩略语对照表 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（8）热休克蛋白70过表达对V79细胞电离辐射损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 中文提要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 一、研究背景及意义 |
| 二、国内外研究进展 |
| 三、本研究的内容 |
| 第一部分：热休克处理后 V79 细胞中 HSP70 的表达情况 |
| 一、实验材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分：HSP70 过表达对电离辐射后V79 细胞存活率的影响 |
| 一、实验材料和方法 |
| 二 、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分：HSP70 过表达对电离辐射引起V79 细胞周期阻滞的影响 |
| 一、实验材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 热休克蛋白:细胞内源性保护蛋白 |
| 发表的文章及其它 |
| 中英文缩略语对照表 |
| 致谢 |
（9）热休克（预）处理对过氧化氢诱导细胞损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 一、研究背景及意义 |
| 二、国内外研究进展 |
| 三、本研究的内容 |
| 四、本研究的局限性及展望 |
| 第一部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究生期间发表的文章 |
| 附录:缩略词表和照片 |
| 致谢 |
| 详细摘要 |
（10）心脉通含药血清抗H2O2诱导的心肌细胞凋亡作用及机制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一部分 心脉通含药血清抗H_2O_2Z致心肌细胞损伤作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 心脉通含药血清制备 |
| 2.2 乳鼠心肌细胞分离、纯化、培养 |
| 2.3 实验分组 |
| 2.4 指标及方法 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 心肌细胞A-SARCOMERIC ACTIN的免疫细胞化学染色 |
| 3.2 心肌细胞形态观察 |
| 3.3 心肌细胞 MTT吸光度检测 |
| 3.4 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 |
| 4 讨论 |
| 4.1 心肌细胞培养技术 |
| 4.2 中药血清药理学 |
| 4.3 细胞凋亡检测 |
| 4.4 心肌缺血再灌注与氧自由基损伤 |
| 4.5 中药抗氧自由基损伤及抗细胞凋亡作用 |
| 第二部分 心脉通含药血清抗H_2O_2致心肌细胞凋亡的机制探讨 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 乳鼠心肌细胞分离、纯化、培养 |
| 2.2 实验分组 |
| 2.3 指标及方法 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 心肌细胞形态观察 |
| 3.2 心肌细胞内HSP70表达 |
| 3.3 NF-κB核转位率检测 |
| 3.4 心肌细胞内CASPASE-3表达量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 细胞因子与心肌细胞凋亡 |
| 4.2 中医对冠心病的认识与防治 |
| 5 实验小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、热休克预处理抑制过氧化氢所致心肌细胞Smac的释放及细胞凋亡（论文参考文献）
- [1]FOXO3a在替莫唑胺诱导的保护性线粒体自噬中的作用和机制研究[D]. 何川. 吉林大学, 2021(01)
- [2]miR-199a-5p通过HIF-1α/P-GSK3β/mPTP轴影响心肌缺血再灌注损伤的研究[D]. 刘大伟. 河北医科大学, 2019(01)
- [3]热休克预处理对鼠心肌细胞凋亡和金属硫蛋白表达的影响[D]. 胡艳. 中南大学, 2011(01)
- [4]核仁素在大鼠心肌缺血预适应中的作用及其机制研究[D]. 蒋碧梅. 中南大学, 2010(12)
- [5]当归红芪超滤膜提取物对过氧化氢诱导心肌细胞氧化损伤的保护作用[D]. 马燕花. 兰州大学, 2010(10)
- [6]Bcl-2在HSP70抗氧化应激所致C2C12细胞凋亡中的作用研究[D]. 邓红兵. 中南大学, 2009(04)
- [7]热休克蛋白70过表达对淋巴细胞辐射损伤的保护效应[D]. 李义杰. 苏州大学, 2009(10)
- [8]热休克蛋白70过表达对V79细胞电离辐射损伤的保护作用[D]. 秦永春. 苏州大学, 2008(11)
- [9]热休克（预）处理对过氧化氢诱导细胞损伤的保护作用[D]. 陆明康. 苏州大学, 2007(04)
- [10]心脉通含药血清抗H2O2诱导的心肌细胞凋亡作用及机制探讨[D]. 杨萍. 暨南大学, 2007(02)